Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

Riepilogo

Un metodo per generare fette organotipica dal mesencefalo murino embrionale E12.5 è descritto. Le culture fetta organotipica può essere usato per osservare il comportamento dei neuroni dopaminergici o di altri neuroni del mesencefalo ventrale.

Abstract

Il mouse è un organismo modello eccellente per studiare lo sviluppo del cervello dei mammiferi a causa della abbondanza di dati molecolari e genetici. Tuttavia, il cervello di topo in via di sviluppo non è adatto per una facile manipolazione e di imaging in vivo in quanto l'embrione del mouse è inaccessibile e opaco. Culture fetta organotipica di cervelli embrionali sono quindi ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo del cervello murino in vitro. Ex-vivo, la manipolazione o l'uso di topi transgenici permette la modifica dell'espressione genica in modo che le sottopopolazioni di cellule neuronali e gliali possono essere etichettati con proteine ​​fluorescenti. Il comportamento delle cellule etichettate possono essere osservate con time-lapse imaging. Time-lapse imaging è stata particolarmente efficace per lo studio dei comportamenti delle cellule che sono alla base dello sviluppo della corteccia cerebrale a fine fase embrionale ^1-2. Embrionale organotipica sistemi fetta della cultura nelle regioni del cervello al di fuori del prosencefalo sono establis menoHED. Pertanto, la ricchezza di time-lapse dati di immagini che descrivono la migrazione delle cellule neuronali è limitato al ^3,4 proencefalo. Non è ancora noto, se i principi scoperti per il cervello dorsale valere per le aree del cervello ventrale. Ventrale del cervello, i neuroni sono organizzati in gruppi neuronali, piuttosto che i livelli e spesso devono sottoporsi a complicate traiettorie migratorie per raggiungere la loro posizione finale. Il mesencefalo ventrale non è solo un buon sistema modello per lo sviluppo cerebrale ventrale, ma contiene anche le popolazioni neuronali come i neuroni dopaminergici che sono rilevanti nei processi di malattia. Mentre la funzione e la degenerazione dei neuroni dopaminergici è stato studiato in grande dettaglio nel cervello adulto e l'invecchiamento, poco si sa circa il comportamento di questi neuroni durante la fase di differenziazione e migrazione ^5. Descriviamo qui la generazione di culture fetta dal giorno embrionale (E) 12,5 mesencefalo ventrale del mouse. Queste fetta cultoUres siano potenzialmente idonei per il monitoraggio dello sviluppo dei neuroni dopaminergici per diversi giorni in vitro. Evidenziamo i passaggi critici nella generazione di fette di cervello in queste prime fasi di sviluppo embrionale e discutere le condizioni necessarie per mantenere il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici in vitro. Abbiamo inoltre presentare i risultati di esperimenti di imaging lasso di tempo. In questi esperimenti, precursori mesencefalo ventrale (compresi i precursori dopaminergici) ed i loro discendenti sono stati etichettati in modo mosaico utilizzando un Cre / loxP basato destino sistema inducibile mappatura ^6.

Protocollo

Parti di questo protocollo sono modificate da Daza et al., 2007 ^7.

1. Preparativi

1. Possono essere preparati un giorno di anticipo
   1. Preparare 1X tampone Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH ₂ PO _4: H ₂ O, 1,2 mM MgCl _2, 2.5 mM CaCl _2, 11 mM glucosio, 25 mM NaHCO _3; aggiustare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare (0,22 dimensione dei pori micron) e conservare a 4 ° C.
   2. Preparare il terreno di coltura (20 ml): 5 ml HBSS, 9 ml di glucosio DMEM alto, 850 ml di glucosio al 30%, 5 ml di siero di cavallo (25%). Aggiungere 200 microlitri Penicllin 100X / streptomicina. Conservare a 4 ° C.
2. Preparare prima di iniziare la dissezione
   1. Preparare 100 ml di fusione agarosio 4% bassa (LMP agarosio) in 1X tampone Krebs: forno a microonde la soluzione fino a quando l'agarosio è completamente sciolto e poi posto l'agarosio in un bagno di acqua a 45 ° C.
   2. Riempire le vibrazionitome vassoio buffer con gelida tampone 1X Krebs e avviare l'elemento di raffreddamento (mantenere a 4 ° C). Fissare una lametta nel supporto lama e set-up della zona vibratome con un bisturi, un pennello fine e un cucchiaio forato mini per raccogliere le fette. Preparare piastre sterili (35 x 10 mm) con tampone 1x Krebs per la raccolta delle fette. Tenere su ghiaccio.
   3. Set-up della zona dissezione con piastre sterili (100 x 15 mm) per la dissezione e piccoli piatti Petri sterili (35 x 10 mm) per l'incorporamento, piccole forbici, due pinze fine (Dumont 5), un cucchiaio forato mini, un bicchiere pipetta Pasteur fuoco lucido con una punta rotonda chiusa e 1 L di tampone 1X Krebs sul ghiaccio. Pulire tutti gli strumenti di dissezione con il 70% di etanolo.
   4. Aggiungi terreno di coltura per i pozzi di un bambino di sei pozzetti (1,5 mL / pozzetto) e metterla in un incubatore a 37 ° C.
   5. Preparare una a sei pozzetti con 1,5 mL / pozzetto sterile 1X tampone Krebs e 15 microlitri Penicilin / streptomicina (100X) / bene. In condizioni sterili, luogo Millicell Cultura inserisce cellule nei pozzetti. Posto a sei pozzetti accanto al vibratome in modo che le fette di cervello possono essere trasferiti sulle membrane filtro subito dopo il sezionamento.

2. Dissezione e incorporamento di cervello embrionale

1. Anestetizzare un topo femmina gravida con isoflurano e sacrificio il mouse da dislocazione cervicale (embrioni dovrebbe essere allo stadio E12.5). Sezionare fuori l'utero del mouse sollevando l'utero con una pinza. Utilizzare pinze altri per separare il mesometrium via dall'utero. Posto l'utero in gelida tampone 1X Krebs. Utilizzare una pinza sottile per separare la parete muscolare dell'utero, membrana Reichert e la viscerale sacco vitellino dall'embrione. Rimuovere gli embrioni dall'utero. Mettere gli embrioni sezionato in un recipiente a parte con Petri sterile 1X tampone Krebs.
2. Sezionare il cervello sotto uno stereomicroscopio. Per sezionare il cervello, prima tagliare la testa dell'embrione. Fissare la testaforando una pinza sottile attraverso la testa (altezza degli occhi). Utilizzare un altro paio di pinze per rimuovere con cura la pelle e il cranio. Utilizzare pinze per sollevare con attenzione il cervello fuori e trasferirla in una capsula di Petri con la sterile 1X tampone Krebs. E 'molto importante che l'integrità di tutto il cervello si mantiene durante la dissezione, dal momento che i danni al tessuto cerebrale creerà problemi (come la distruzione dei tessuti) durante il sezionamento sul vibratome.
3. Lavare il cervello una volta nel 4% a basso punto di fusione (LMP) agarosio. Incorpora 2-3 cervelli in un momento di fresco 4% agarosio LMP. Porre le capsule incorporare sul ghiaccio più uniforme possibile. Utilizzare una pipetta Pasteur con un fuoco lucido punta rotonda per sollevare il cervello fino in fondo l'agarosio si è solidificato. Il cervello dovrebbe stabilirsi in una posizione piana orizzontale nella parte inferiore del blocco di agarosio.
4. Dopo l'agarosio si è solidificato completamente (dopo circa 3 min), tagliare l'agarosio che circonda il cervello e incollare il blocco agarosio sul palco campionedel vibratome. Per incollare i blocchi, assicuratevi che il lato ventrale del cervello è parallelo alla piattaforma, dal momento che il cervello dovrebbe essere tagliato in un piano di sezione orizzontale.

3. Vibratome sezionamento

1. Utilizzare una lama di rasoio per sezionamento. Per ottenere fette intatto è molto importante per mantenere la temperatura a 4 ° C durante il sezionamento.
2. Sezione 300 micron fette spesse orizzontali ad una frequenza di 50 Hz, ampiezza lama di 1,1 mm e una velocità di 25 mm / sec.
3. Usa il pennello sottile per spingere la fetta in un cucchiaio forato mini per raccogliere le fette di cervello e trasferirli in un piatto con sterile gelida tampone 1X Krebs. Scegliere la slice che contiene tessuto mesencefalo ventrale (vedi Figura 1). In un cervello E12.5 il mouse c'è solo una fetta di 300 micron orizzontale che contiene tessuto mesencefalo ventrale compresi i neuroni dopaminergici.

4. Fetta della cultura

Passi 4,2-4,5 deve essere effettuata in condizioni sterili.

1. Trasferire le fette di cervello su un inserto cultura Millicell membrana cellulare in sei pozzetti con 1x tampone Krebs (vedi punto 1.2.5). Per trasferire la fetta utilizzare il mini cucchiaio forato (Strumenti di scienze arti) e un pennello fine. Fino a 3 fette possono essere posizionati su una membrana.
2. Trasferire la membrana con la fetta di sei pozzetti con terreno di coltura (vedi punto 1.2.5). La parte superiore della membrana non dovrebbero essere coperti da medium. La fetta cervello riceve media dal basso e l'aria dall'alto.
3. Posto a sei pozzetti in un incubatore al 5% di CO ₂ a 37 ° C. E 'molto importante che le fette sono posti in incubatrice entro 2 ore dopo la fase iniziale della dissezione. Un tempo di preparazione più estesa può provocare scarsa sopravvivenza delle fette.
4. Fette possono essere mantenuti in vitro fino a 3 giorni. Cambia il 50% del terreno di coltura il giorno 2 ^°.

5. Time-lapse imaging

1. Lasciate le fette di recuperare in incubatore per 4-5 ore prima di iniziare il time-lapse imaging.
2. Per time-lapse imaging, tenere le fette sull'inserto membrana e trasferire l'inserto in un 35 mm Ibidi μ-piatto (il fondo del piatto è composto da materiale di alta qualità ottica).
3. Aggiungere 1 ml di terreno di coltura più 1,5 microlitri di acido ascorbico (200 mm) al piatto. L'acido ascorbico protegge contro le fette di fototossicità.
4. Incubare fette in una camera climatica a 37 ° C con 5% di CO2 durante il time-lapse imaging.

6. Rappresentante Risultati

La Figura 1 illustra la preparazione di culture fetta organotipica da E12.5 cervello di topo. La figura 2 mostra fette orizzontali organotipica (acuta e dopo alcuni giorni di cultura) ottenuto forma E12.5 cervello di topo. Per confronto, le sezioni cervello congelato nelle fasi di equivalente svilupposono mostrati. Mesencefalo neuroni dopaminergici sono visualizzati con immunoistochimica per la tirosina idrossilasi (TH). Mesencefalo progetto neuroni dopaminergici a obiettivi nel proencefalo. Queste proiezioni cominciano a formarsi a E12.5 e si estendono verso il prosencefalo durante i giorni successivi. Noi consideriamo lo sviluppo di proiezioni proencefalo come una buona indicazione per il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici nella cultura. Nel mesencefalo orizzontale fette neuroni dopaminergici estendere le proiezioni verso il loro spazio adeguato bersaglio proencefalo. Dopo 3 DIV (giorni in vitro) o quando le aree bersaglio proencefalo sono danneggiati, proiezioni aberrante si estendono verso il mesencefalo dorsale. Esempi di fette coronali del E12.5 mesencefalo sono mostrati in Figura 3. Neuroni dopaminergici visualizzate con immunocolorazione per TH estendere proiezioni aberrante al mesencefalo dorsale. Figura 4 mostra l'analisi di proliferare, le cellule necrotiche e apoptotiche nelle culture fetta organotipica. BrdU immunostaining di visualizzare le cellule proliferanti dimostra che le cellule proliferano in condizioni di coltura dopo 1 DIV. Proliferazione è ridotto dopo 4 DIV. Dopo 3 DIV, molte cellule nel mesencefalo ventrale incontro a necrosi (colorazione ioduro di propidio) e apotosis (immunocolorazione per spaccati della caspasi-3). Figura 5 mostra i percorsi migratori di YFP marcato i neuroni monitorati in un time-lapse esperimento di imaging in una fetta acuta .

Figura 1. Schematica che illustra la preparazione di culture fetta organotipica. 300 micron fette orizzontali cervello sono preparati da sezionare uno E12.5 cervello utilizzando un vibratome. (A) Schema sagittale di un cervello E12.5 il mouse. I livelli di sezioni sono indicate. L'area che contiene i neuroni dopaminergici è raffigurato in rosa, le proiezioni sono indicati in blu. (B) Schema delle tre sezioni che possono essere ottenute da dorsale a ventrale e that contengono sia proencefalo (Fb) e mesencefalo (Mb). Da notare che solo una fetta contiene i neuroni dopaminergici (b slice). La fetta appropriata può essere identificato in base alla posizione dei ventricoli e la continuità del tessuto mesencefalo e proencefalo (frecce, confrontare b sezione con la sezione A e C). L'area che contiene i neuroni dopaminergici è indicato in rosa, l'area che contiene precursori dopaminergici è raffigurato in verde, le frecce blu indicano le proiezioni di sviluppo. (C) La sezione che contiene i neuroni dopaminergici sono coltivati ​​su inserti di membrana. Abbreviazioni: VMB, mesencefalo ventrale, DMB, mesencefalo dorsale; Hyp, l'ipotalamo, Hb, rombencefalo.

Figura 2. Proiezioni dei neuroni dopaminergici del mesencefalo in culture fetta organotipica dipendono l'integrità del proencefalo. Immunoistochimica per la tirosina idrossilasi (TH) per etichettare i neuroni dopaminergici. (A) fetta acuta (0 DIV)che illustrano la posizione normale dei neuroni dopaminergici nel mesencefalo ventrale. La freccia bianca indica l'area che viene mostrato in alto ingrandimento nel riquadro. Proiezioni per il proencefalo non hanno ancora sviluppato. Dopo 1 DIV, proiezioni al proencefalo cominciano a formarsi. Le proiezioni si estendono nel proencefalo a 2-3 DIV. Frecce bianche indicano la posizione dei corpi cellulari mostrato in alto ingrandimento nella inserti (cornice bianca). Frecce gialle evidenziare le proiezioni normali a fette intatto mostrato in alto ingrandimento nella inserti (cornice gialla). Proiezioni aberrante sviluppare a fette con proencefalo danneggiati. Frecce rosse indicano le proiezioni aberrante al mesencefalo dorsale mostrato in alto ingrandimento nella riquadri (riquadro rosso). Il danno è indicata con un asterisco rosso. Dopo 3 DIV, più fette (n = 5 / 7) aveva proiezioni aberrante verso il mesencefalo dorsale. (B) immunocolorazione TH su sezioni orizzontali cervello congelato a diversi stadi di sviluppo per seguire l'evoluzionedi proiezioni dopaminergiche in vivo. Frecce bianche indicano la posizione dei corpi cellulari mostrato in alto ingrandimento nella inserti (cornice bianca). Frecce gialle evidenziare la posizione delle proiezioni mostrato in alto ingrandimento nella inserti (cornice gialla). Il livello delle sezioni congelate è stato scelto per corrispondere al meglio il livello delle culture fetta organotipica. Si noti che una singole sezioni congelate (12 micron) non rappresenta la fetta intera organotipica (300 micron). Pertanto, proiezioni mostrato a E13.5 e E14.5 sono stati osservati su degli articoli 120 micron più ventrale rispetto alla sezione che contiene i corpi cellulari (asterisco giallo).

Figura 3. Culture fetta mesencefalo coronale colorate per la tirosina idrossilasi (TH) come marcatore per i neuroni dopaminergici. (AC) Fette dopo DIV 1, 2 o 3. Neuroni dopaminergici sviluppare proiezioni aberrante verso il mesencefalo dorsale (rfrecce ndr). Frecce indicano la posizione dei corpi delle cellule dopaminergiche.

Figura 4. Proliferazione cellulare e la vitalità cellulare in colture fetta mesencefalo organotipica. (A) Le cellule in proliferazione sono stati etichettati con l'aggiunta di BrdU (50 ng / ml, Sigma) al mezzo di coltura per 18 h. Fette sono stati successivamente immunostained per BrdU. Dopo 1 DIV, le cellule BrdU etichettate si trovano nelle zone ventricolare (frecce rosse). Dopo 4 DIV, le cellule proliferanti sono più sparsi ed una zona ventricolare distinta non è più mantenuto. (B), le cellule necrotiche sono stati etichettati con l'aggiunta di ioduro di propidio (1μg/μL, Sigma) al mezzo di coltura, per 2 ore e visualizzati al microscopio a fluorescenza. Dopo 1 DIV, il mesencefalo ventrale (VMB) non è necrotico, ma molte cellule ioduro di propidio marcata può essere visto nel mesencefalo dorsale e proencefalo. Dopo 3 DIV la vitalità cellulare diminuisce nel midbra ventraleScala in bar: 500 micron (C) per Immunostaing spaccati della caspasi-3 per visualizzare cellule apoptotiche. A 1 o 2 DIV, i neuroni dopaminergici solo pochi (TH) sono apoptotico. Dopo 3 DIV, i neuroni dopaminergici iniziare l'apoptosi. Pannelli al centro e sulla destra sono più alti ingrandimenti della zona in scatola nei pannelli di sinistra. Le immagini più elevati ingrandimenti sono proiezioni di massima intensità z-stack di 14-16 frame. Le immagini sono state scattate ogni 0,5 micron con un Apotome Zeiss set-up.

Figura 5. Rotte migratorie di YFP marcato i neuroni in una fetta acuta. (A) Fetta orizzontale utilizzata per l'imaging lasso di tempo di YFP marcato i neuroni. La fetta è stato incubato per 5 ore prima di imaging. Le cellule sono state etichettate con un inducibile Cre / loxP sistema ^6. Shh topi ^{Creer 8} e ROSA ^{loxP-STOP-loxP-EYFP} topo giornalista ⁹ abbiamore utilizzato. Ricombinazione degli alleli giornalista ROSA (e di espressione EYFP) è indotta nelle cellule che esprimono Creer (Shh cellule che esprimono), ma solo la somministrazione di Tamoxifene (Sigma). In questo esempio, Tamoxifen (3 mg/40 g di peso corporeo) è stato somministrato a femmine di topo gravide a E8.5. Questo set-up sperimentale risultati soprattutto per l'etichettatura dei precursori dei neuroni dopaminergici e dei loro discendenti nel mesencefalo ventrale ^10,11. Scala grafica: 500 micron. (B) Tracciare la rotta migratoria di YFP marcato i neuroni in una fetta acuta. Time-lapse immagini di YFP marcato i neuroni destino mappati sono stati acquisiti ogni 30 min per un tempo totale di 5 ore e 30 minuti su una Axio Observer-microscopio Zeiss (obiettivo CE PLnn 10x / 0,3). Fette sono state incubate in una camera climatica (incubatore XLS1 Pecon) a 37 ° C e forniti con il 5% di CO ₂ durante l'imaging. La posizione iniziale delle cellule è segnato con frecce rosse; posizioni migrazione sono contrassegnati con un asterisco rosso.

Discussione

Il metodo organotipica cultura fetta qui presentato fornisce un sistema di breve termine in analisi in vitro di neuroni dopaminergici e sviluppare le loro rotte migratorie e di proiezione nel mesencefalo ventrale embrionale. Abbiamo scoperto che ci sono una serie di passaggi critici nel protocollo che dovrebbe essere attentamente curato in modo da ottenere fette che permettono il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale. La fase più critica è la dissezione del cervello embr...

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
Glucosio 30%	Sigma-Aldrich	G7528-250
Siero di cavallo	Invitrogen	26050-088
DMEM (4,5 g / L Glc., Con L-Gln, Na Pyr, NaHCO3)	Sigma-Aldrich	D6429-500
Penicillina / streptomicina 100x	Sigma-Aldrich	P4333-20
Acido L-ascorbico	Sigma-Aldrich	A4403	preparare magazzino 200mm e conservare a -20 ° C
Ultrapura agarosio LMP	Invitrogen	15517-022
Millicel inserti	Millipore	PICMORG50
μ-piatto 35 mm, a basso	Ibidi	80136
Vibratome	Microm	HM 650V
Lametta	Plano GmbH	121-6
Histoacryl colla	BRAU9381104	Braun Aesculap
Spoon Dia perforata diametro 15 mm	Strumenti Scienza multa	10370 -18
Pinza 5 Dumoxel	Strumenti Scienza multa	11252-30

Nome dell'anticorpo	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Coniglio anti-tirosina idrossilasi	Millipore	AB152	Diluizione 1:500
Topo anti-tirosina idrossilasi	Millipore	MAB318	Diluizione 1:500
Topo anti-BrdU	BD Pharmingen	555627	Diluizione 1:200
Coniglio anti-caspasi 3 spaccati	Tecnologia delle celle di segnalazione	9661	Diluizione 1:200
Donkey anti-IgG di coniglio-Alexa 488	Invitrogen	A21206	Diluizione 1:500
Donkey IgG anti-topo-Cy3	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	Diluizione 1:200