배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

요약

E12.5 murine 배아 midbrain에서 organotypic 조각을 생성하는 방법을 설명합니다. organotypic 슬라이스 문화가 dopaminergic 신경이나 다른 복부 midbrain의 뉴런의 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

마우스 분자 및 유전자 데이터의 풍부한으로 인해 포유류의 두뇌 개발을 연구하는 훌륭한 모델 생물이다. 마우스 배아에 액세스할 수 및 불투명이기 때문에 그러나, 개발 마우스 두뇌는 생체내에서 쉽게 조작 및 이미징에 적합하지 않습니다. 배아 두뇌의 Organotypic 슬라이스 문화가 따라서 광범위하게 체외에 murine 두뇌 개발을 연구하는 데 사용됩니다.의 연결이나 glial 세포의 subpopulations이 형광 단백질이 표시 수 있도록 전 생체내 조작 또는 유전자 변형 생쥐의 사용은 유전자 표현의 수정을 허용합니다. 분류 전지의 동작은 다음 시간에 촬영된 영상을 사용하여 볼 수 있습니다. 시간 경과 이미징 늦게 배아 단계 ^1-2에서 대뇌 피질의 발전을 기초 셀 동작을 공부하고 특히 성공을 거두었습니다. forebrain 외부의 뇌 지역에서 배아 organotypic 슬라이스 문화 시스템은 덜 잘 establis 아르쓰인. 따라서, 세포의 연결을 마이 그 레이션을 설명하는 시간 경과 영상 데이터의 풍부한은 forebrain ^3,4으로 제한됩니다. 그것은 아직 지느러미 뇌를 발견 원칙 복부 뇌 영역에 대한 진정한 보유하고 있는지, 알 수 없습니다. 복부 두뇌에서 뉴런의 연결은 클러스터가 아닌 레이어로 구성 그리고 그들은 종종 자신의 최종 위치에 도달하는 복잡한 철새의 탄도를 받아야 할 수 있습니다. 복부 midbrain은 복부 두뇌 개발에 대해서만 좋은 모델 시스템이 아니지만, 또한 질병 과정에 관련된 dopaminergic 신경로의 연결 인구가 포함되어 있습니다. dopaminergic 신경의 기능과 변성은 성인과 노화 두뇌에 좋은 상세히 조사하고있는 동안, 꼬마들은 차별화 및 마이 그 레이션 단계 ⁵ 동안 이러한 뉴런의 행동에 대해 알려져 있습니다. 우리는 여기서 배아 일 (E) 12.5 마우스 복부 midbrain에서 슬라이스 문화의 생성을 설명합니다. 이러한 슬라이스 예찬ures는 체외에서 며칠 동안 dopaminergic 신경 세포 개발을 감시하는 잠재적으로 적합합니다. 우리는 배아 개발이 초기 단계에서 뇌 조각을 생성에 중요한 단계를 강조하고 체외에서 dopaminergic 신경의 정상적인 발전을 유지하기위한 필요 조건을 토론합니다. 시간 저속 이미징 실험에서 우리는 또한 현재의 결과입니다. 이 실험에서, 복부 midbrain의 엽 성의 전구 물질 (dopaminergic 엽 성의 전구 물질 포함) 및 그들의 자손은 Cre / loxP 기반 inducible 운명 매핑 시스템 ^6을 사용 모자이크 방식으로 표시했다.

프로토콜

이 프로토콜의 일부는 Daza 외에서 수정할 수 있습니다. 2007 년 ^7.

1. 준비

1. 사전에 일일 준비할 수
   1. : 1X Krebs 버퍼 (1.5 L)를 준비 126 MM NaCl, 2.5 MM KCl, 1.2 MM은 아니 ₂ PO ₄ : H ₂ O, 1.2 MM MgCl _2, 2.5 MM CaCl _2, 11 MM 포도당, 25 MM NaHCO _3, 7.4로 산도를 조정합니다. 소독 필터 (0.22 μm의 기공 크기)와 4 저장 ° C.
   2. 5 ML의 HBSS, 9 ML DMEM 높은 포도당, 30 % 포도당을 850 μL, 5 ML 말 혈청 (25 %) : 문화 매체를 (20 ML) 준비합니다. 200 μL 100X Penicllin / 스트렙토 마이신을 추가합니다. 4 저장 ° C.
2. 절개를 시작하기 전에 준비
   1. 1X Krebs 버퍼 4퍼센트 낮은 용융 아가로 오스 (LMP 아가로 오스) 100 ML 준비 : 전자 레인지 솔루션을 아가로 오스가 완전히 해산 후 45 ° C 물 목욕으로 아가로 오스를 배치 때까지.
   2. vibra을 채워메 버퍼 얼음처럼 차가운 1X Krebs 버퍼와 트레이 (4 ° C에서 보관) 냉각 요소를 시작합니다. 블레이드 캐리어와 메스, 좋은 붓을와 조각을 데리러 미니 구멍 스푼으로 설정 vibratome 지역의 면도날을 수정. 조각을 모으기위한 1X Krebs 버퍼와 함께 멸균 배양 접시를 (35 × 10 ㎜) 준비합니다. 얼음 계속.
   3. 해부에 대한 무균 배양 접시 (100 X 15mm)과 작은 멸균 배양 접시 (35 X 10mm) 포함을 위해, 작은 가위, 두 훌륭한 포셉 (뒤몽 5), 미니 구멍 스푼, 유리 해부 영역을 설정 원형과 광택 파스퇴르 피펫 화재 얼음이 제보 및 1X Krebs 버퍼 1 L를 마감했다. 70 % 에탄올로 모든 해부 도구를 닦아주십시오.
   4. 여섯 잘 플레이트 (1.5 ML / 음)의 우물에 배지를 추가하고 37 ° C 배양기에 배치합니다.
   5. 1.5 ML / 잘 멸균 1X Krebs 버퍼와 15 μL Penicilin / 스트렙토 마이신 (100X) / 잘있는 여섯 잘 접시를 준비합니다. 무균 조건 하에서, 밀 배치우물에 licell의 세포 배양 삽입. 뇌 조각은 즉시 sectioning 후 필터 세포막에 전송할 수 있도록 vibratome 옆에있는 여섯 잘 접시를 놓습니다.

2. 해부 및 배아 두뇌 퍼가기

1. isoflurane을 사용하여 임신 여성 마우스를 마취하고 경추 전위 (배아는 무대 E12.5에 있어야 함)하여 마우스를 희생. 집게와 함께 자궁을 당기는하여 마우스의 자궁을 절개하다. 자궁에서 멀리 mesometrium을 구분하기 위해 다른 집게를 사용하십시오. 얼음처럼 차가운 1X Krebs 버퍼에있는 자궁을 놓습니다. 배아의 자궁, Reichert의 막이와 내장 난황의 근육 벽을 분리하는 훌륭한 집게를 사용하십시오. 자궁에서 태아를 제거합니다. 멸균 1X Krebs 버퍼와 함께 별도의 페트리 접시에 해부하는 배아를 놓습니다.
2. stereomicroscope에서 머리를 절개하다. 두뇌를 해부하다하려면 먼저 배아의 머리를 잘라. 머리를 수정머리 (눈높이)를 통해 미세 집게를 관통하여. 조심스럽게 피부와 두개골을 제거하는 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 조심스럽게 머리를 밖으로 리프트 및 살균 1X Krebs 버퍼가있는 페트리 접시에 그것을 전송하는 집게를 사용하십시오. 이것은 뇌 조직에 손상이 vibratome에 sectioning 도중 문제 (예 : 조직 분쇄 등) 만들 수 있기 때문에 전체 뇌의 무결성이, 해부 동안 유지하는 것이 매우 중요합니다.
3. 한번 4퍼센트 낮은 용융 점 (LMP) 아가로 오스의 머리를 씻으십시오. 신선한 4% LMP 아가로 오스에 한 번에 2-3 머리를 삽입할 수 있습니다. 가능한에도 얼음에 포함 요리를 놓습니다. 아가로 오스의 바닥이 확정 때까지 두뇌를 리프트에 불을 세련된 라운드 팁과 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 두뇌는 아가로 오스 블록의 아래쪽에 수평 평면 위치에 정착한다.
4. 아가로 오스가 완전히 (약 3 분 후) 확정되면, 두뇌를 둘러싼 아가로 오스 및 접착제 표본 무대에 아가로 오스 블록 트림vibratome니다. 언제 gluing 블록, 머리가 수평 섹션 비행기에서 컷해야부터 두뇌의 복부 측면은 플랫폼에 평행하게되어 있는지 확인합니다.

3. Vibratome의 sectioning

1. sectioning 위해 면도날을 사용합니다. 그대로 조각을 얻으려면 것은 sectioning 동안 4 ° C에서 온도를 유지하는 것은 매우 중요하다.
2. 50 Hz의 주파수에서 제 300 μm의 두께가 수평 슬라이스, 블레이드 1.1 mm의 진폭과 25mm / 초의 속도.
3. 뇌의 슬라이스를 수집하고 살균 얼음처럼 차가운 1X Krebs 버퍼와 함께 접시에 그들을 전송하는 미니 구멍 스푼에 조각을 밀어 좋은 붓을을 사용합니다. (그림 1 참조) 복부 midbrain 조직을 포함하는 슬라이스를 선택합니다. E12.5 마우스 두뇌에 dopaminergic 신경을 포함한 복부 midbrain 조직을 포함 한 300 μm의 수평 슬라이스가 있습니다.

4. 슬라이스 문화

단계 4.2-4.5는 무균 조건 하에서 수행되어야합니다.

1. 1X Krebs 버퍼 (포인트 1.2.5 참조) 여섯 잘 플레이트에 Millicell 셀 문화 막 삽입에 뇌 조각 전송합니다. 전송하려면 슬라이스가 미니 구멍 스푼 (파인 과학 도구)와 벌금 붓을을 사용합니다. 최대 3 조각 한 막에 둘 수 있습니다.
2. 문화 매체와 여섯 잘 판에 슬라이스 (포인트 1.2.5 참조) 멤브레인을 전송합니다. 멤브레인의 상단은 매체에 의해 적용되지 않습니다. 뇌 슬라이스는 위에서 아래 공기에서 중간받습니다.
3. 37 5퍼센트 CO ₂ 배양기에서 여섯 잘 플레이트를 배치 ° C. 그것은 조각이 절개의 초기 단계 후 2 시간 이내에 배양기에 배치하는 것이 매우 중요합니다. 보다 확장된 준비 시간은 조각의 가난한 생존이 발생할 수 있습니다.
4. 조각은 3 일 이내에 체외로 유지하실 수 있습니다. 2 ^차 당일에 문화 매체의 50 %를 변경합니다.

5. 시간 경과 이미징

1. 시간이 경과 이미징을 시작하기 전에 4-5시간에 대한 조각이 인큐베이터에서 회복합시다.
2. 시간이 경과 이미징 들어, 멤브레인 삽입에 조각을 유지하고 35mm Ibidi의 μ - 요리 (접시의 바닥이 높은 광학 품질 소재로 구성되어 있습니다)에 삽입을 전송합니다.
3. 접시에 배지 1 ML 플러스 1.5 μL 아스코르비 산 (200 MM)를 추가합니다. 아스코르비 산은 phototoxicity에 대한 슬라이스를 보호합니다.
4. 37 환경 챔버의 조각 품어 ° C 시간이 경과 이미징 동안 5 % CO2와 함께.

6. 대표 결과

그림 1은 E12.5 마우스 뇌에서 organotypic 슬라이스 문화의 준비를 보여줍니다. 그림 2는 가로 organotypic 조각이 (급성과 문화에 몇 일 후) 양식 E12.5 마우스 머리를 취득 보여줍니다. 동등한 발달 단계 비교, 냉동 뇌 섹션에 대한표시됩니다. Midbrain dopaminergic 신경은 티로신 hydroxylase (TH)에 대한 immunohistochemistry와 시각입니다. Midbrain dopaminergic 신경 프로젝트 forebrain에서 표적 수 있습니다. 이러한 추정치는 E12.5에서 양식 및 후속 일간 forebrain쪽으로 확장하는 시작합니다. 우리는 문화에 dopaminergic 신경의 정상적인 발전을위한 좋은 표시대로 forebrain의 예측의 발전을 고려하십시오. 수평 조각의 midbrain에서 dopaminergic 뉴런들은 적절한 forebrain 대상 지역으로 계획을 확장. 세 DIV (체외에서 일)하거나 forebrain 대상 영역이 손상되면 탈선 예상 지느러미 midbrain쪽으로 확장. E12.5 midbrain의 코로나 조각의 예는 다음은 그림 3에 표시됩니다. Dopaminergic의 뉴런은 TH의 지느러미 midbrain에 탈선 계획을 확장을위한 immunostaining와 시각. 그림 4는 organotypic 슬라이스 문화에 괴사성 및 apoptotic 세포를 proliferating의 분석을 보여줍니다. BrdU 인스턴트 메신저proliferating 세포를 시각화하는 munostaining하면 세포는 1 DIV 이후 문화 상황에서 분아 따위에 의해 중식 것을 보여줍니다. 확산 4 DIV 이후 줄어 듭니다. 세 DIV 후, 복부 midbrain의 많은 세포가 괴사 (propidium의 요오드화물 얼룩) 및 apotosis을 (죽습 caspase - 3에 대한 immunostaining) 받고있다. 그림 5는 급성 통에 시간 저속 영상 실험에서 모니터링 YFP - 분류 뉴런의 철새 경로를 보여줍니다 .

그림 1. organotypic 슬라이스 문화의 준비를 설명하는 도식. 300 μm의 수평 뇌 조각은 vibratome를 사용하여 E12.5 머리를 sectioning으로 준비가되어 있습니다. E12.5 마우스 뇌 (A) 도식의 화살보기. 섹션의 레벨이 표시됩니다. dopaminergic의 뉴런을 포함하는 영역이 핑크색으로 그려져 있습니다, 예상이 파란색으로 표시됩니다. 로 지느러미에서 얻을 수 세 조각의 (B) 회로도 복부와 THAt는 forebrain (FB)과 midbrain (MB)를 모두 포함합니다. 단 하나 슬라이스가 dopaminergic 뉴런 (슬라이스 B)가 포함되어 있습니다. 해당 슬라이스는 심실의 위치 및 midbrain 및 forebrain 조직 (화살표, 섹션 A와 C와 섹션 B를 비교)의 연속성에 따라 확인할 수 있습니다. dopaminergic 신경을 포함하는 영역이 분홍색으로 표시됩니다, dopaminergic 엽 성의 전구 물질을 포함하고있는 지역은 개발 계획을 나타내는 녹색, 청색 화살표로 그려져 있습니다. (C) dopaminergic 신경을 포함하는 슬라이스는 막 삽입에 양식입니다. 약어 : vMb, 복부 midbrain, DMB, 지느러미 midbrain, 우울, 시상 하부, HB, hindbrain.

그림 2. organotypic 슬라이스 문화에 midbrain dopaminergic 신경의 예상치는 forebrain의 무결성에 의존하고 있습니다. dopaminergic 신경을 라벨 티로신 hydroxylase (TH)에 대한 Immunohistochemistry. (A) 급성 슬라이스 (0 DIV)복부 midbrain에서 dopaminergic 신경의 정상적인 위치를 보여주는. 흰 화살촉은 삽입의 높은 배율로 표시되는 영역을 나타냅니다. forebrain에 예상은 아직 개발하지 않았습니다. 일 DIV 후, forebrain에 예상 형태로 시작합니다. 계획 2-3 DIV에 forebrain로 확장합니다. 화이트 화살촉은 insets 높은 배율 (화이트 프레임)에 표시된 세포 기관의 위치를​​ 나타냅니다. 노란색 화살표는 insets 높은 배율 (노란색 프레임)에 표시된 그대로 조각의 일반적인 전망을 강조 표시합니다. 탈선 계획은 손상 forebrain과 함께 슬라이스에 개발할 수 있습니다. 빨간색 화살표는 insets 높은 배율 (빨간색 프레임)에 표시된 지느러미 midbrain에 탈선 예상을 나타냅니다. 피해는 빨간색 별표로 표시됩니다. 세 DIV 후, 대부분의 조각은 (N = 5 / 7) 지느러미 midbrain 향해 탈선 전망했다. (B) 다른 발달 단계에 가로 냉동 뇌 섹션에서 TH의 immunostaining의 발전을 보여주생체내에서 dopaminergic 예상 중. 화이트 화살촉은 insets 높은 배율 (화이트 프레임)에 표시된 세포 기관의 위치를​​ 나타냅니다. 노란색 화살표는 insets (노란색 프레임)에서 높은 배율에 표시된 예측의 위치를​​ 강조 표시합니다. 냉동 섹션의 수준이 밀접하게 organotypic 슬라이스 문화의 수준에 맞게 선정되었습니다. 한 냉동 섹션 (12 μm의) 전체 organotypic 슬라이스 (300 μm의)를 대표하지 않습니다. 따라서 E13.5 및 E14.5에 표시된 예측은 세포 기관 (노란색 별표)이있는 섹션 120여 μm의 더 많은 복부 부분에서 관찰되었다.

그림 3. dopaminergic 신경에 대한 마커로 티로신 hydroxylase (TH)에 대한 스테인드 Midbrain 코로나 슬라이스 문화. 1, 2 또는 3 DIV 이후 (AC) 슬라이스. Dopaminergic 뉴런은 지느러미 midbrain (R 방향으로 탈선 계획을 개발에드 화살표). 화살촉은 dopaminergic 세포 기관의 위치를​​ 보여줍니다.

그림 4. midbrain organotypic 슬라이스 문화의 세포 증식 및 세포 생존 능력. (A) Proliferating 전지 18 H.위한 문화 매체 BrdU (50 NG / ML, 시그마)의 추가에 의해 라벨이 붙지만 조각은 이후 BrdU에 대한 immunostained되었습니다. 일 DIV 후, BrdU 표시된 세포는 심실 지역 (빨간색 화살표)에 위치하고 있습니다. 4 DIV 후, proliferating 세포보다 흩어져 있으며 뚜렷한 심실 영역이 더 이상 유지되지 않습니다. (B) 괴사성 세포는 2 시간에 대한 문화 매체 propidium 요오드화물의 정보뿐만 아니라 (1μg/μL, 시그마)로 표시하고 형광 현미경으로 시각되었습니다. 일 DIV 후, 복부 midbrain (vMb)는 괴사성 아니지만, 많은 propidium 요오드화물의 라벨 세포는 지느러미 midbrain과 forebrain에서 볼 수 있습니다. 세 DIV 후 세포 생존은 복부 midbra의 감소인치 스케일 바 : apoptotic 세포를 시각화하는 죽습 caspase - 3에 대한 Immunostaing 500 μm의 (C). 1 또는 2 DIV에서 단 몇 dopaminergic 뉴런 (TH)는 apoptotic 있습니다. 세 DIV 후 dopaminergic 신경은 apoptosis를 받아야하기 시작합니다. 중간과 오른쪽 패널이 왼쪽 패널에있는 박스 영역의 높은 배율입니다. 높은 배율의 이미지는 14-16 프레임의 Z - 스택의 최대 강도 전망입니다. 이미지 자이스 혈구 Apotome 설정과 모든 0.5 μm의를 촬영했다.

그림 5. 급성 통에 YFP - 레이블 뉴런의 이동 경로. (A) 수평 슬라이스는 YFP - 분류 뉴런의 시간 저속 이미징에 사용. 슬라이스는 이전 이미징 5 시간에 대한 incubated했다. 전지는 inducible Cre / loxP 시스템 ^6을 사용 분류되었습니다. 쉿 ^{CreER 마우스 8} 로사 ^{loxP - STOP - loxP - EYFP 기자} 마우스 ⁹ 우리다시 사용되는. 로사의 기자 allele (및 EYFP 표현)의 재조합은 세포에서 유도된 것을 표현 CreER (쉬 - 표현 세포),하지만 Tamoxifen (시그마)의 관리에 따라. 이 예제에서는, Tamoxifen (3 mg/40 g의 체중)을 E8.5에서 임신 마우스에 투여했다. 이 실험 주로 복부 midbrain ^10,11에 dopaminergic 뉴런과 그 자손의 엽 성의 전구 물질의 라벨 결과를 설정합니다. 스케일 바 : 500 μm의. (B) 급성 통에 YFP - 레이블 뉴런의 이동 경로를 추적. YFP - 라벨 운명 매핑 뉴런의 시간 저속 이미지는 5 시간의 총 시간 자이스 혈구 Axio - 옵저버 현미경 (목적 EC PlnN 10X / 0.3)에서 30 분마다 30 분을 인수했다. 조각은 37 ° C에서 환경 챔버 (인큐베이터 XLS1 Pecon)에 incubated 및 이미징 동안 5 % CO _2와 함께 제공했다. 세포의 초기 위치가 빨간색 화살표로 표시되어있다, 마이 그 레이션 순위는 빨간색 별표로 표시됩니다.

토론

여기에 제시 organotypic 슬라이스 문화 방법은 배아 복부 midbrain에서 dopaminergic 뉴런과 철새와 프로젝션 노선 개발을 체외 분석에서 단기간에 시스템을 제공합니다. 우리는 신중하게 복부 midbrain dopaminergic 신경의 정상적인 발전을 허용 조각을 얻기 위해에 참석해야 프로토콜의 중요한 단계 수가있다는 것을 발견했습니다. 가장 중요한 단계는 빠르고 정확한 모두 수있는 배아 두뇌의 해부입니?...

자료

시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
DMEM	시그마 - 올드 리치	D6429
포도당 30%	시그마 - 올드 리치	G7528 - 250
말 혈청	Invitrogen	26050-088
DMEM (4,5 g / L Glc., L - Gln와 나 Pyr, NaHCO3)	시그마 - 올드 리치	D6429 - 500
100x 페니실린은 / 스트렙토 마이신	시그마 - 올드 리치	P4333 - 20
L - 아스코르비 산	시그마 - 올드 리치	A4403	-20 ° C에서 200mM 주식 및 저장을 준비
UltraPure LMP 아가로 오스	Invitrogen	15517-022
Millicel 삽입	Millipore	PICMORG50
낮은 μ - 요리 35mm,	Ibidi	80,136
Vibratome	Microm	HM 650V
면도날	렌즈 GmbH의	121-6
Histoacryl 접착제	BRAU9381104	브라운 Aesculap
다공 숟가락 디아 직경 15mm	파인 과학 도구	10,370 -18
집게 5 Dumoxel	파인 과학 도구	11252-30

항체의> 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
토끼 안티 - 티로신 hydroxylase	Millipore	AB152	희석 1:500
마우스 방지 티로신 hydroxylase	Millipore	MAB318	희석 1:500
마우스 방지 BrdU	BD Pharmingen	555,627	희석 1:200
토끼 반 죽습 caspase 3	세포 신호 기술	9661	희석 1:200
당나귀 안티 - 토끼 IgG - 알렉사 488	Invitrogen	A21206	희석 1:500
당나귀 안티 - 마우스 IgG - Cy3	잭슨 ImmunoResearch	715-165-150	희석 1:200