Targeting dei tioli cisteina per in Vitro site-specific glicosilazione delle proteine ricombinanti

Riepilogo

Le analisi biochimiche e strutturali delle proteine glicosilate richiedono relativamente grandi quantità di campioni omogenei. Qui, presentiamo un efficiente metodo chimico per site-specific glicosilazione delle proteine ricombinanti purificate da batteri prendendo di mira i tioli reattivi di Cys.

Abstract

Stromal interazione molecola-1 (STIM1) è un tipo-io la proteina del transmembrane situato sul reticolo endoplasmatico (ER) e membrane plasmatiche (PM). ER-residente STIM1 regola l'attività dei canali PM Orai1 in un processo noto come memorizzare voce azionata calcio (Ca^{2 +}) che è il principale Ca^{2 +} segnalazione processo che spinge il sistema immunitario. STIM1 subisce post-traduzionali N- glicosilazione in due siti di Asn luminal all'interno del Ca^{2 +} rilevamento dominio della molecola. Tuttavia, la biochimica, biofisica, e gli effetti biologici di struttura di N- glicosilata STIM1 erano capiti male fino a recentemente dovuto un'incapacità di facilmente ottenere alti livelli di omogeneo N- glicosilata proteina. Qui, descriviamo l'implementazione di un in vitro approccio chimico che attribuisce moiety glucosio ai siti di proteina specifica applicabili alla comprensione degli effetti sottostanti di N- glicosilazione il meccanismo e la struttura della proteina. Usando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare soluzione valutiamo sia l'efficienza della modificazione nonché le conseguenze strutturali del collegamento del glucosio con un singolo campione. Questo approccio può essere adattato facilmente per studiare le proteine glicosilate una miriade che si trovano in natura.

Introduzione

Negozio gestito calcio (Ca^{2 +}) voce (SOCE) è la via principale, in cui le cellule immunitarie prendono il Ca^{2 +} dallo spazio extracellulare nel cytosol. Nei linfociti T, cellule T recettori situati sulla membrana plasmatica (PM) legano gli antigeni che attivano proteine tirosin chinasi (rivisto in ^1,2,3). Una cascata di fosforilazione conduce all'attivazione di fosfolipasi-γ (PLCγ), che successivamente ha trasmesso l'idrolisi di membrana fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP₂) in diacilglicerolo e inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP₃ ). IP₃ è un piccolo messaggero diffusibile che si lega ai IP₃ recettori (IP₃R) il reticolo endoplasmatico (ER) quindi aprire questo canale del ricevitore e permettendo Ca^{2 +} a fluire verso il basso la pendenza di concentrazione dall'ER lumen al cytosol (rivisto in ⁴). Segnalazione da accoppiati a proteine G e recettori tirosina-chinasi in una varietà di altre cellule eccitabili e non eccitabili tipi piombo per la produzione stessa di IP₃ e l'attivazione di IP₃Rs del ricevitore.

A causa del Ca^{2 +} deposito capacità limitata dell'ER, IP₃-rilascio mediato e aumento risultante in Ca citosolico^{2 +} è solo temporaneo; Tuttavia, questo svuotamento del ER luminal Ca^{2 +} effetti profondamente stromal interazione molecola-1 (STIM1), un tipo-io transmembrana (TM) proteina trovata principalmente sul ER membrana ^5,6,7. STIM1 contiene un lume-oriented Ca^{2 +} rilevamento dominio costituito da una coppia di EF-hand e sterile di α-motivo (EFSAM). Tre citosolico orientato arrotolato-arrotola domini sono separati da EFSAM dal singolo dominio TM (rivisto in ⁸). Al momento di svuotamento^{2 +} ER luminal Ca, EFSAM subisce una destabilizzazione-accoppiato oligomerizzazione ^7,9 che provoca riarrangiamenti strutturali della TM e arrotolato-arrotola domini ¹⁰. Questi cambiamenti strutturali culminano in un intrappolamento di STIM1 ER-PM giunzioni ^11,12,13,14 attraverso interazioni con PM phosphoinositides ^{15, 16} e Orai1 subunità ^17,18. Orai1 proteine sono le subunità di PM che assemblano per formare Ca^{2 +} canali ^19,20,21,22. Facilitano le interazioni di STIM1-Orai1 alle giunzioni di ER-PM una Ca^{2 +} sblocco attivato Ca^{2 +} (CRAC) canale conformazione aperta che consente lo spostamento di Ca^{2 +} nel citosol da alte concentrazioni della spazio extracellulare. In cellule del sistema immunitario, il citosolico Ca^{2 +} elevazioni continue attraverso canali di CRAC inducono il Ca^{2 +}- calmodulina/calcineurina dipendente defosforilazione del fattore nucleare delle cellule di T attivate che successivamente entra nel nucleo e inizia la regolazione trascrizionale di geni promuovendo l'attivazione delle cellule T ^1,3. Il processo di attivazione del canale CRAC di STIM1 ^23,24 via indotta da agonisti ER luminal Ca^{2 +} lo svuotamento e la risultante citosolico Ca^{2 +} elevazione continua è collettivamente denominato SOCE ²⁵. Il ruolo vitale dei SOCE in cellule di T è evidente da studi che dimostrano che le mutazioni ereditabili in Orai1 e STIM1 possono causare immunodeficienza combinata grave sindromi ^{3,19,26, 27}. EFSAM avvia SOCE dopo rilevamento luminal ER Ca^{2 +} svuotamento tramite la perdita di Ca^{2 +} coordinamento presso la canonica EF-hand, infine conducendo alla destabilizzazione-accoppiato autoassociazione ^{7, 28,29}.

La glicosilazione è il legame covalente ed elaborazione di strutture oligosaccaride, noto anche come glicani, attraverso vari passaggi biosintetici in ER e Golgi (rivisto in ^30,32,33). Ci sono due tipi predominanti di glicosilazione negli eucarioti: N-collegati e O-collegato, a seconda delle specifiche dell'aminoacido e atomo colmare il sollevatore. In N- glicosilazione, glicani sono associati l'ammide di catena laterale di Asn, e nella maggior parte dei casi, il passo di iniziazione si verifica nell'ER come polipeptide catena si muove nel lume ³⁴. Il primo passo di N- glicosilazione è il trasferimento di una struttura di nucleo di quattordici-zucchero composto da glucosio (cromatografia gaseoliquido), mannosio (uomo) e N- acetilglucosamina (GlcNAc) (cioè Glc₃Man₉GlcNAc₂) da un ER dei lipidi di membrana da un oligosaccharyltransferase ^35,36. Ulteriori passi, come la scissione o il trasferimento di residui di glucosio, vengono catalizzate al pronto soccorso di glicosiltrasferasi e specifiche glicosidasi. Alcune proteine che lasciano l'ER e spostare nel Golgi possono essere ulteriormente trasformati ³⁷. O- glycosylation si riferisce all'aggiunta di glicani, solitamente per il gruppo dell'idrossile di catena laterale dei residui Ser o Thr, e questa modificazione avviene interamente nel complesso di Golgi ^33,34. Ci sono diverse strutture di - glycan Oche possono essere costituiti da N- acetilglucosamina, fucosio, galattosio e acido sialico con ogni monosaccaride aggiunto in sequenza ³³.

Mentre nessuna sequenza specifica è stata identificata come prerequisito per molti tipi di O- glicosilazione, una sequenza di consenso comune è stata associata con la N-collegato modifica: Asn-X-Ser/Thr/Cys, dove X può essere qualsiasi amminoacido tranne Pro ³³. STIM1 EFSAM contiene due di questi siti di consenso N- glicosilazione: Asn131-Trp132-Thr133 e Asn171-Thr172-Thr173. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che la EFSAM può essere N- glicosilata in cellule di mammifero in Asn131 e Asn171 ^38,39,40,41. Tuttavia, gli studi precedenti delle conseguenze di N- glicosilazione su SOCE sono state incongruenti, suggerendo soppresso, ha rafforzato o alcun effetto di questa modifica alberino-translational su SOCE attivazione ^38,= "xrif" > 39^,40,41. Così, la ricerca sulle conseguenze biofisiche, biochimiche e strutturali sottostanti di EFSAM N- glicosilazione è fondamentale per comprendere gli effetti normativi di questa modifica. A causa del requisito per alti livelli di proteine omogenei in questi esperimenti in vitro , è stato applicato un approccio selettivo sito cui connettersi covalentemente moiety glucosio EFSAM. Interessante, Asn131 e Asn171 glicosilazione causato cambiamenti strutturali che convergono all'interno del nucleo EFSAM e che permettono di migliorare le proprietà biofisiche che promuovono STIM1-mediata SOCE ⁴².

L'allegato chimica dei gruppi glicosilici Cys tioli è stata consolidata da un lavoro seminale che in primo luogo ha dimostrato l'utilità di questo enzima-libero approccio alla comprensione degli effetti specifici del sito di glicosilazione su proteina funzione ^{43 , 44}. più recentemente e per quanto riguarda STIM1, i residui Asn131 e Asn171 erano mutati di Cys e glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] è stato usato per covalenza collegarsi glucosio i tioli liberi ⁴². Qui, Descriviamo questo approccio che non solo utilizza mutagenesi per incorporare i residui di Cys specifici sito per la modifica, ma si applica anche la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) soluzione per valutare rapidamente strutturale ed efficienza di modifica perturbazioni a causa la glicosilazione. In particolare, questa metodologia generale è facilmente adattabile per studiare gli effetti di entrambi O- o N- glicosilazione di qualsiasi recombinantly prodotto della proteina.

Protocollo

1. reazione a catena della polimerasi (PCR)-mediata di mutagenesi sito-diretta per l'incorporazione di Cys in un vettore di espressione batterica pET-28a.

1. Determinare la concentrazione del vettore animale-28a (cioè DNA incagliato doppio) utilizzando un coefficiente di estinzione (UV) ultravioletto di 0.020 (μg/mL) cm ^-1 a 260 nm.
2. Sintetizzare un paio degli iniettori mutageni complementari per ogni mutazione Cys tale che io) ci sono un minimo di 15 nucleotidi complementari al modello prima della mancata corrispondenza prima base e 15 nucleotidi complementari per il modello dopo la mancata corrispondenza di base finale, ii) della lunghezza totale dell'iniettore non superi 45 nucleotidi e iii) una guanina o citosina si trova alla posizione del primo e l'ultimo nucleotide di ogni primer (tabella 1). Garantire la sintesi di primer viene eseguita utilizzando una purificazione di scala e cartuccia di 0.025 μmol.
3. Utilizzando un'alta fedeltà DNA polimerasi, impostare di miscele di reazione di PCR due 20 µ l: uno contenente il primer in avanti e la seconda contenente il primer reverse. Preparare ogni miscela per contenere le concentrazioni finali di 1 x PCR tampone con 1,5 mM MgCl ₂, 0.2 mM dNTPs, 0,5 μM primer, 0,4 μL DMSO, modello di 1,25 ng/μL del DNA, 0.02 U/μL ad alta fedeltà della polimerasi del DNA.
4. Ciclo termicamente le miscele separate utilizzando un protocollo di tre fasi: 98 ° C per 30 s (denaturazione), 53-56 ° C per 30 s (ricottura), 72 ° C per 30 s kilobase(kb) ^-1 (estensione) di DNA della mascherina. Ripetere il programma di temperatura per 5 cicli e aggiungere un passaggio di estensione finale 72 ° C per un minimo di 7,5
5. Dopo l'iniziale PCR con primer forward e reverse in provette separate, combinare i prodotti in un unico tubo (cioè 40 μL totale) e proseguire la reazione di PCR per un ulteriore 20 cicli utilizzando gli stessi parametri in bicicletta come descritto al punto 1.4.
6. Electrophorese 15 μL di miscela di reazione PCR su un agarosio all'1% (p/v) gel usando 0,5 x Tris, acido acetico, etilene diammina tetra acido acetico (EDTA) (TAE) tampone di corsa. Come controlli, elettroforesi una quantità equivalente di modello di DNA che non è stato amplificato dalla PCR e un'aliquota della scala di riferimento del DNA che contiene le bande dell'indicatore sia maggiore e minore la dimensione prevista del prodotto PCR.
7. Dopo l'elettroforesi a 120 V per 40 min, immergere il gel in acqua contenente 0,5 μg/mL di bromuro di etidio e agitare per 30 min a temperatura ambiente. Confermare il modello full-length è stato amplificato dai primer del mutageno come un aumento nell'intensità relativa etidio bromuro fluorescente della band amplificata rispetto alla band di modello di controllo sotto la luce UV (302 nm).
   1. Se nessuna amplificazione è apparente, ripetere la PCR dopo aver regolato la temperatura di ricottura con incrementi di 0,5 ° C tra la gamma di temperatura di 53-56 ° C.
8. Al momento della conferma dell'amplificazione del modello dai primer del mutagene, trattare il restante ~ 25 μL della miscela di reazione PCR con l'enzima di restrizione DpnI per digerire il modello metilato di DNA. Utilizzare DpnI a 0,5 µ l (10 unità) per la miscela di reazione PCR μL 25 e una concentrazione finale di 1 × DpnI tampone di reazione. Incubare per 2,5 h a 37 ° C.
9. Dopo digestione modello, aggiungere ~ 5-10 µ l della miscela digerita a 100 µ l di calore shock cellule DH5α Esherichia coli competenti in un tubo del microcentrifuge 1,75 mL. Incubare la miscela di DNA delle cellule sul ghiaccio per 60 min.
10. Scossa di calore la miscela di DNA delle cellule nel tubo del microcentrifuge a 42 ° C per 45 s su un blocco a calore secco. Dopo incubazione la miscela sul ghiaccio per 3 min, aggiungere 900 μL di brodo temperatura Luria-Bertani (LB) alle cellule e trasferire la sospensione totale delle cellule in una provetta di turno-fondo sterile mL 14.
11. Incubare la sospensione cellulare a 37 ° C per 90 min con agitazione costante a 190 giri/min.
12. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare nuovamente dentro un tubo del microcentrifuge 1,75 mL e centrifugare a 10.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
13. Dopo la centrifugazione, rimuovere 900 μL del surnatante e risospendere le cellule batteriche pipettando delicato nei restanti 100 μL di lb.
14. Trasferire la sospensione concentrata di cellule risultante su un piatto di LB-agar che contiene antibiotico che è selettiva per il vettore di espressione (cioè 60 μg/mLKanamycin). Asetticamente diffondere la sospensione uniformemente sulla piastra agar e incubare per ~ 16 h a 37 ° C.
15. Il giorno seguente, inoculare una singola Colonia dalla piastra in 5 mL di liquido LB contenente la pressione di selezione antiobiotic (cioè 60 μg/mL kanamicina). Far crescere la cultura liquida durante la notte a 37 ° C con agitazione costante a 37 ° C.
16. Isolare e purificare il plasmide propagato dalle cellule e. coli utilizzando un kit disponibile in commercio basato sul Lisi alcalina procedura ⁴⁵.
17. Confermare la mutazione di interesse è presente e nel telaio della lettura corretta mediante sequenziamento Sanger del plasmide ⁴⁶.

2. Uniforme ¹⁵ espressione di proteina N-labeled in BL21 ΔE3 Escherichia coli.

Nota: diverse proteine ricombinanti richiedono condizioni di espressione diversa. Quanto segue è la procedura ottimizzata per l'espressione della proteina umana STIM1 EFSAM.

1. Trasformare il vettore di espressione che harboring le mutazioni di Cys (cioè animali-28a-EFSAM) in cellule competenti di BL21 ΔE3 codone (+) calore shock e piastra sulle piastre di LB-agar contenente la pressione di selezione antibiotica come descritto nei passaggi 1,9-1.14) con la successive modifiche: piastra direttamente un'aliquota di 150 μL fuori la sospensione totale delle cellule di ~ 1.000 μL sulla piastra LB-agar senza la necessità di concentrare le cellule in un tubo del microcentrifuge mediante centrifugazione.
2. Il giorno seguente, Trasferire asetticamente una singola Colonia in una beuta contenente 20 mL di LB completati con l'antibiotico adatto (cioè kanamicina μg/mL 60 per animale domestico-28a-EFSAM) da 200 mL. Far crescere questa liquido avviamento cultura durante la notte (cioè ~ 16 h) a 37 ° C con agitazione costante alle ~ 190 giri/min.
3. Lo stesso giorno come passo 2.2, preparare M9 medio per ¹⁵ espressione di proteina N-labeled in autoclave 1 L di M9 tampone sali (cioè 42mm Na ₂ HPO ₄, 22 mM KH ₂ PO ₄, 8,6 mM NaCl, pH 7.4) in un matraccio di Erlenmeyer 4L. Una volta fredda, filtrare su una miscela di 20% (p/v) D-glucosio, 1m CaCl ₂, tiamina di 1 M, 1 M MgSO ₄, biotina 1 mg/mL e 0,2 g/mL ¹⁵ N-NH ₄ Cl 0,2 μm siringa sterile filtro nella soluzione 1 L sterile M9 sale affinché il le concentrazioni finali di questi componenti sono 0,2% (w/v) D-glucosio, 100 μM CaCl ₂, 50 tiamina μM, 1mm MgSO ₄, 1 biotina μg/mL e 1 mg/mL ¹⁵ N-NH ₄ cl.
4. Il giorno successivo, Trasferire asetticamente la coltura starter liquido durante la notte di 20 mL in una provetta conica sterile da 50 mL e centrifugare a 2.400 × g per 15 min agglomerare le cellule.
5. Dopo decantazione il mezzo LB, risospendere il pellet cellulare risultante in 10 mL di terreno minimo M9 e trasferire il composto di sedimento risospeso in 1 L di terreno minimo M9 con antibiotico (cioè 60 kanamicina μg/mL).
6. Crescere i 1 L di terreno minimo M9 contenente la coltura starter batterici a 37 ° C e ~ 190 giri/min costante agitazione fino a quando la densità ottica a 600 nanometro (OD600) raggiunge ~0.6-0.8.
7. Quando viene raggiunto l'intervallo di specfified OD600, aggiungere 200 μM di isopropile β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per indurre l'espressione della proteina.
8. Dopo l'aggiunta di IPTG, continuare incubando le cellule per l'espressione della proteina a temperatura ambiente con agitazione costante a ~ 190 rpm per ~ 16 h (cioè durante la notte).
9. Il giorno successivo, raccogliere i batteri mediante centrifugazione a ~ 10.000 × g, 4 ° C per 30 min.
10. Decantare il LB e trasferire il pellet cellulare in una provetta conica da 50 mL. Conservare il pellet a-80 ° C fino al momento di purificazione.

3. Purificazione della proteina ricombinante da e. coli.

Nota: diverse proteine ricombinanti richiedono procedure di purificazione distinti. Di seguito è riportato il protocollo per 6 & n. 215; Purificazione di EFSAM sua etichetta dai corpi di inclusione espressa dal costrutto pET-28a.

1. Manualmente omogeneizzare il pellet di cellule batteriche congelati in 6m guanidina-HCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8) e 5 mM β-mercaptoetanolo utilizzando una pipetta di trasferimento motorizzata da 10 mL. Aggiungere circa 40 mL di guanidina-HCl ogni 5 mL di pellet cellulare bagnato per questo passaggio.
2. Seguenti a 90 min di incubazione a temperatura ambiente con rotazione costante in un forno di ibridazione, centrifugare la miscela a ~ 15.000 × g, 8 ° C per 40 min separare i detriti cellulari insolubile (cioè pellet) dalla proteina solubile miscela (cioè surnatante).
3. Aggiungere 750 µ l di un 50% (v/v) Ni ^{2 +}-agarosio acido nitrilotriacetico perlina liquami per il chiarificato lisato e incubare per un altro 90 min a temperatura ambiente con inversione in un forno di ibridazione.
4. Catturare successivamente, la proteina His-tag 6 × associata alla Ni ^{2 +} raccogliendo le sfere di agarosio in una colonna di purificazione della proteina di gravità flusso. Consentire il lisato di fluire attraverso la colonna completamente prima di passare alla fase 3.5.
5. Lavare le perle raccolte tre volte con 10ml di 6 M urea, 20 mM Tris-HCl pH 8 e 5 mM β-mercaptoetanolo. Assicurarsi che l'intero mL 10 passi attraverso la colonna prima di ogni successivo 10 mL nello stato di Washington
6. Eluire le proteine in una serie di frazioni di 2ml utilizzando 6 M urea, 20 mM Tris-HCl a pH 8, imidazolo di 300 mM e 5 mM β-mercaptoetanolo con un tempo di incubazione di s 90 tra frazioni. Assicurarsi che l'intero mL 2 passi attraverso la colonna prima di ogni fase successiva eluizione.
7. In questa fase, confermare la proteina di interesse è presente nelle frazioni eluite di Coomassie blu-macchiato elettroforesi dodecilica del sodio solfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) utilizzando il metodo di Laemmli ⁴⁷. Valutare la dimensione di proteine, la quantità e la purezza in confronto contro bande di marcatore di peso molecolare standard che sono entrambi minore e maggiore del previsto peso molecolare della proteina di interesse.
8. Piscina le frazioni eluite proteina in una membrana di dialisi con 3.500 peso molecolare Da taglio e incubare nel buffer di refolding 1 L (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 millimetro DTT, 5mm CaCl ₂, pH 8) a 4 ° C durante la notte mentre il buffer è agitato da un magneti agitatore di c.
9. Dopo ~ 16 h di refolding tempo, aggiungere ~ 1 U di trombina per mg di proteina direttamente per il sacchetto di dialisi e incubare a 4 ° C per un ulteriore ~ 24 h.
10. Verificare la portata di 6 × sua fenditura di tag-azzurro di Coomassie macchiando di ~ 15 proteine aliquote del μL prelevate dal sacchetto di dialisi prima e dopo incubazione con trombina che sono electrophoresed su denaturare i gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) utilizzando il metodo di Laemmli ⁴⁷. Se uno spostamento di ~ 2 kDa nella migrazione è osservato corrisponde al peso molecolare della fenduti 6 × suo tag, procedere al passaggio 3.11; Se una frazione di resti di proteine non digerite che è rilevabile dalla macchiatura azzurro di Coomassie, aggiungere ~0.2 U di trombina per mg di proteina direttamente il sacchetto di dialisi e incubare a 4 ° C per un ulteriore ~ 24 h.
11. Cromatografia di esclusione o scambio ionico di formato uso per purificare ulteriormente la proteina. Per cromatografia a scambio anionico di EFSAM, rimuovere la soluzione della proteina dal sacchetto di dialisi e concentrato ~ 10 volte usando un concentratore centrifugo di ultrafiltrazione con 10.000 peso molecolare Da taglio. Successivamente, re-diluire la soluzione ~ 20 volte in un tampone privo di NaCl (20 mM Tris, 5mm CaCl ₂, 1mm DTT, pH 8).
12. Equilibrare una colonna di scambio anionico preconfezionati con 10 volumi di colonna del buffer privo di NaCl al punto 3.11. Equilibrare utilizzando buffer caricato in una siringa luer lock non contenente bolle d'aria spingendo la soluzione attraverso la colonna in modo goccia a goccia ed evitando pressioni di siringa che causano flussi costante della soluzione uscendo la colonna. Utilizzare uno scambiatore di anioni forti (ad es. il reticolato agarosio con gruppi funzionali di ammonio quaternario).
13. Caricare la soluzione di proteine diluita in tampone privo di NaCl (punto 3.11) sulla colonna come descritto nel passaggio 3.12.
14. Eluire le proteine in una sfumatura [cioè 0 - 60% (v/v)] di NaCl in aumento del buffer (20 mM Tris, 1 M di NaCl, 5 mM CaCl ₂, 1mm DTT, pH 8) utilizzando un sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) proteine veloci di due pompe. Impostare il sistema FPLC per raccogliere le frazioni ~1-1.5 mL e monitorare il profilo di eluizione di proteina utilizzando la capacità di assorbimento di UV 280 nm e una portata nominale di 0,5 mL/min
15. Identificare i picchi di eluizione e le frazioni contenenti la proteina d'interesse così come la purezza della proteina di Coomassie blu-macchiato SDS-PAGE gel utilizzando il metodo di Laemmli ⁴⁷.
16. Frazioni piscina mostrando > 95% (ossia assunto come frazioni che mostrano solo una banda singola proteina su macchiato gel di Coomassie) in un sacchetto di dialisi e cambio nel buffer sperimentale di interesse tramite dialisi come descritto al punto 3.8.

4. Allegato chimica del glucosio-5-MTS alla proteina tramite dialisi.

Soluzione di riserva

1. preparare un 55 millimetri di N.-(β-D-glucopyranosyl)-N '-[2-methanethiosulfonyl) etil] urea (glucosio-5-MTS) sciogliendo 10 mg del composto in 500 μl di 100% (v/v) DMSO. Immagazzinare glucosio-5-MTS inutilizzati solubilizzato in DMSO a -20 ° C.
2. Preparare il campione della proteina per la modifica di dialisi 1,5 mL di proteina μM ~ 60 in 1 L di modificazione buffer costituito da MOPS di 20 mM, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl ₂ e 0,1 mM TCEP, pH 8.3. Utilizzare un taglio peso molecolare di membrana di dialisi che è inferiore alla dimensione della proteina viene modificata (ad esempio utilizzare un cut-off Da 3.500 per il EFSAM Da ~ 17.500).
3. Dopo 24 h a 4 ° C, trasferire il campione dal sacchetto di dialisi in una microcentrifuga. Aggiungere il glucosio-5-MTS solubilizzato in DMSO ad una concentrazione finale di 2 mM.
4. Incubare il campione al buio per 1 h a temperatura ambiente. Durante il periodo di incubazione di 1 h, miscelare la soluzione di picchiettando del tubo ogni 10 min.
5. Successivamente, ri-scambiare la proteina con il buffer finale sperimentale non contenente nessun agente riduttore di dialisi a 4 ° C, come descritto al punto 4.2 o mediante ultrafiltrazione centrifugo. Per la procedura di ultrafiltrazione, concentrare il campione di proteina mL di ~1.5 di < 0,5 mL e successivamente diluire nel concentratore stesso con il buffer di sperimentale. Ripetere questo passaggio di concentrazione-diluizione due volte in modo che lo scambio totale è un minimo di 30 × 30 × 30 = 27,000-fold. Per EFSAM, utilizzare 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl ₂, pH 7.5 del buffer sperimentale.
6. Preparare il campione per la spettrometria totale di ionizzazione electrospray di dialisi o ultrafiltrazione scambio come descritto ai punti 4.2 e 4.5, rispettivamente, in bicarbonato di ammonio di 25 mM o 25 mM ammonio acetato. Se si utilizza la dialisi, assicurarsi si scambiano almeno tre volte per rimuovere qualsiasi residuo NaCl e CaCl ₂ sali.
7. Determinare la massa accurata (cioè ± 1 Da) della proteina di interesse utilizzando la ionizzazione electrospray di massa spettrometria ^{48 , 49}. Si aspettano ogni aggiunta di glucosio covalente di un tiolo di Cys via il prodotto chimico methanethiosulfonate per aggiungere Da 281.3 alla proteina massa (cioè aggiungere 360.4 Da per il glucosio-5-MTS e sottrarre Da 79,1 per CH ₃ modo lasciando ₂ gruppo durante covalente allegato).

5. Valutazione di soluzione NMR di modifperturbazioni di efficienza e strutturali icazione.

Proteina

1. verificare la concentrazione del modificati è > 100 μM dopo l'attacco di glucosio e lo scambio di buffer finale. Per EFSAM, stimare la concentrazione nella proteina utilizzando un coefficiente di estinzione UV a 280 nm di 1,54 (mg mL ^{– 1}) cm ^{– 1}.
2. Integratore soluzione della proteina con 60 μM di acido 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic (DSS) per la calibrazione di spessoramento e impulso e 10% (v/v) D ₂ O per il blocco del segnale. Per i campioni di alto segnale-rumore uso 600 μL in tubi di frequenza-abbinati 5 mm NMR, inserito in uno spettrometro di 600 MHz minimo dotato di una sonda criogenica di tripla risonanza HCN.
3. Raccogliere gli spettri standard ¹ H - ¹⁵ N HSQC come precedentemente dettagliate ^{50 , 51} a temperatura, ¹ H e ¹⁵ N sweep larghezze, transitori e incremento impostazioni adatte per il particolare campione. Per EFSAM spectra, uso 20 ° C, 256 ¹ H transitori, 64 incrementi di dimensione ¹⁵ N e ¹ H e ¹⁵ N spazzare larghezze impostate rispettivamente su 8.000 e 1.800 Hz,.
4. a seguito dell'acquisizione dello spettro della proteina glicosilata, aggiungere ditiotreitolo (DTT) al campione NMR da uno stock di 1m a una concentrazione finale di 15 mM. Il DTT rimuove la molecola di glucosio dalla proteina di riduzione del pignoramento bisolfuro-mediata.
5. Acquisire una seconda ¹ H - ¹⁵ N HSQC in queste condizioni di ridotto/non modificato, fornendo uno spettro di riferimento per valutare le perturbazioni di modificazione strutturale ed efficienza causati tramite il collegamento di glucosio.
6. Elaborare i dati NMR utilizzando NMRPipe come dettagliato in precedenza ⁵². Assicurarsi che l'elaborazione minimamente includa conversione dati, phasing, solvente soppressione, di Fourier e visualizzazione iniziale degli spettri.
7. Valutare l'efficienza di modifica misurando l'intensità del picco di ammide e valori di spostamento chimico negli spettri modificati e ridotti utilizzando il plugin NEASY su CARA ⁵³. Garantire per valutare l'intensità di picco del ammide Cys entrambi nel glucosio attaccato e ridotto gli spettri. Se non può trovarsi in modo affidabile l'ammide Cys in due spettri, utilizzare le intensità dei residui adiacenti la Cys come una lettura a.
8. Calcola l'efficienza come l'intensità del ammide dallo spettro Cys-modificato diviso per l'intensità del ammide dallo spettro della Cys-ridotto (cioè DTT-trattato), moltiplicato per 100:
   , dove _M è l'intensità del ammide nello spettro Cys-modificato e I _R è l'intensità del ammide nello spettro Cys-ridotto. In alternativa, valutare l'efficienza media sopra parecchi picchi di ammide:
   , dove l'efficienza _i è l'efficienza separatamente determinato calcolato per ogni residuo, i e n è il numero totale di residui utilizzati nel calcolo.
9. Calcolare perturbazioni di spostamento chimico (CSP) dalle differenze di spostamento chimico tra i due spettri osservati nel ¹⁵ N e ¹ H dimensioni di ogni picco e normalizzante per il più grande ¹⁵ N spostamento chimico gamma utilizzando il seguendo l'equazione:
   , dove ΔH è il cambiamento di ppm nella dimensione del protone e ΔN è il cambiamento di ppm nella dimensione azoto.

Risultati

Il primo passo di questo approccio richiede la mutagenesi dei residui glicosilazione candidato ai residui di Cys che possono essere modificabile utilizzando il EFSAM di glucosio-5-MTS. non ha nessun residui di Cys endogeni, quindi particolari considerazioni non devono essere fatte prima dei mutagenesi. Tuttavia, residui di Cys natali devono essere mutati in residui non modificabile prima di eseguire la chimica descritta. Per effetto minimamente la struttura nativa, suggeriamo di eseguire ...

Discussione

Glicosilazione della proteina è una modificazione post-traduzionale dove gli zuccheri sono covalente di polipeptidi principalmente attraverso collegamenti con catene laterali dell'amminoacido. Oltre il 50% delle proteine di mammiferi sono glicosilata ⁵⁴, dove le proteine glicosilate successivamente possono avere una vasta gamma di effetti da alterazione biomolecolare affinità di legame, che influenzano la proteina pieghevole, alterando l'attività del canale, il targeting molecole per degradazio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phusion DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F530S	Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	FERSM1163	Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme	New England Biolabs, Inc.	R0176	Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit	GeneAid, Inc.	PDH300	Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli	Agilent Technologies, Inc.	230280	Use in step 2.1.
DH5a E. coli	Invitrogen, Inc.	18265017	Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter	Millipore, Inc.	SLGV033RS	Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin	Thermo Fisher Scientific	88221	Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing	BioDesign, Inc.	D306	Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin	BioPharm Laboratories, Inc.	SKU91-055	Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column	GE Healthcare, Inc.	17-5156-01	Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS	Toronto Research Chemicals, Inc.	G441000	Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators	Sartorius, Inc.	VS2001	Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26630	Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column	GE Healthcare, Inc.	17-5053-01	Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System	GE Healthcare, Inc.	29018224	Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer	Agilent Technologies, Inc.		Use in step 5.2 and 5.5.