Un modello di vescica murine decentralizzato (Ex Vivo) con il muscolo del detrusore rimosso per l'accesso diretto al Suburothelium durante il riempimento della vescica

Riepilogo

Il modello di vescica privo di detrusivi consente l'accesso diretto al suburothelium per studiare i meccanismi locali per la regolazione della disponibilità del mediatore biologicamente attivo in suburothelium/lamina propria durante lo stoccaggio e lo svuotamento delle urine. La preparazione assomiglia da vicino al riempimento di una vescica intatta e consente di eseguire studi sul volume di pressione senza influenze sistemiche.

Abstract

Studi precedenti hanno stabilito il rilascio di sostanze chimiche da fogli di mucosa della vescica piatta apposti nelle camere di ussing ed esposti a cambiamenti nella pressione idrostatica o tratto meccanico e dalle cellule umaleali coltivate su cambiamenti di pressione idrostatica, stretch, gonfiore cellulare, o forze di trascinamento, e in lucentezza della vescica alla fine del riempimento. Tali risultati hanno portato all'ipotesi che questi mediatori siano rilasciati anche in suburolio (SubU)/lamina propria (LP) durante il riempimento della vescica, dove influenzano le cellule profonde nella parete della vescica per regolare in ultima analisi l'escitabilità della vescica. Ci sono almeno due ovvie limitazioni in tali studi: 1) nessuno di questi approcci forniscono informazioni dirette sulla presenza di mediatori in SubU/LP, e 2) gli stimoli utilizzati non sono fisiologici e non riassumono l'autentico riempimento della vescica. Qui, discutiamo una procedura che consente l'accesso diretto alla superficie suburoteliale della mucosa della vescica nel corso del riempimento della vescica. La preparazione senza detrusioni murine che abbiamo creato assomiglia molto al riempimento della vescica intatta e consente di eseguire studi di volume di pressione sulla vescica in assenza di segnalazione confusa da riflessi spinali e muscolo liscio detrusore. Utilizzando il nuovo modello di vescica priva di detrustori, abbiamo recentemente dimostrato che le misurazioni intrassiche dei mediatori non possono essere utilizzate come proxy per ciò che è stato rilasciato o presente nel SubU/LP durante il riempimento della vescica. Il modello consente l'esame delle molecole di segnalazione derivate dall'urotelium che vengono rilasciate, generate dal metabolismo e/o trasportate nel SubU/LP durante il corso del riempimento della vescica per trasmettere informazioni ai neuroni e al muscolo liscio della vescica e regolarne l'eccitabilità durante la continenza e la miturismo.

Introduzione

Lo scopo di questo modello è quello di consentire l'accesso diretto al lato submucosale della mucosa della vescica durante le diverse fasi di riempimento della vescica.

La vescica deve astenersi da una contrazione prematura durante il riempimento e vuota quando si raggiunge il volume critico e la pressione. Continenza anormale o svuotamento delle urine sono spesso associati con eccitabilità anormale del muscolo detrusore liscio (DSM) nel corso del riempimento della vescica. L'eccitabilità del DSM è determinata da fattori intrinseci alle cellule muscolari lisce e da influenze generate da diversi tipi di cellule all'interno della parete della vescica. La parete della vescica urinaria è costituita da urotelium (mucosa), suburotilio (SubU)/lamina propriale (LP), muscolo detrustore liscio (DSM) e sirosa (Figura 1A). L'urotelium è costituito da cellule ombrelli (cioè lo strato più esterno dell'urolium), cellule intermedie e cellule basali (cioè lo strato più interno dell'urothelium). Vari tipi di cellule, tra cui cellule interstitial, fibroblasti, terminali nervosi afferenti, piccoli vasi sanguigni, e le cellule immunitarie risiedono nella SubU/ LP. È ampiamente ipotizzato che l'urotelium della vescica sia un organo sensoriale che avvia la minzione riflessiva e la continenza rilasciando mediatori nella submucosa che colpiscono le cellule nel SubU/ LP e nel DSM^1,2,3. Per la maggior parte, tali ipotesi si basano su studi che hanno dimostrato il rilascio di mediatori: da pezzi di mucosa esposti a cambiamenti di pressione idrostatica^4,5; da cellule uoreliali coltivate esposte al tratto^6,7, cella indotta dall'ipotonicità^{gonfiore 7} o forze di trascinamento⁸; da strisce di parete della vescica isolate al^recettoreo attivazione del nervo⁹,^{10,11,12,13,14}; e nel lume della vescica alla fine della vescica che riempie^15,16,17^,18,19. Mentre tali studi sono stati strumentali per dimostrare il rilascio di mediatori sulla stimolazione meccanica di segmenti della parete della vescica o cellule urotelia coltivate, hanno bisogno di essere supportati da prove dirette per il rilascio di mediatori nella submucosa che è suscitata da stimoli fisiologici che riproducono il riempimento della vescica. Questo è un compito impegnativo dato che il SubU / LP si trova in profondità nella parete della vescica ostacolando il semplice accesso alle vicinanze di SubU / LP durante il riempimento della vescica.

Qui, illustriamo un modello di vescica murina decentralizzata (ex vivo) con il muscolo detrusor rimosso¹³ che è stato sviluppato per facilitare gli studi sui meccanismi locali di meccanotransduzione che partecipano alla segnalazione tra l'urothelium della vescica, DSM e altri tipi di cellule nella parete della vescica. Questo approccio è superiore all'utilizzo di fogli piatti della parete della vescica, strisce di parete della vescica o cellule uroliali coltivate perché consente misurazioni dirette in prossimità di SubU/LP di mediatori derivati dall'urothelium che vengono rilasciati o formati in risposta a pressioni fisiologiche e volumi nella vescica ed evita potenziali cambiamenti fenotipici nella coltura cellulare. Può essere utilizzato per misurare la disponibilità, il rilascio, il metabolismo e il trasporto transuroteliale dei mediatori in SubU/LP in diverse fasi di riempimento della vescica (Figura 1B). La preparazione può essere utilizzata anche per esaminare la segnalazione uoteliale e la meccanotrazione in modelli di sindromi della vescica iperattiva e sottoattiva.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono animali descritte in questo manoscritto sono state condotte secondo il National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e il Institutional Animal Use and Care Committee dell'Università del Nevada.

NOTA: Il modello qui presentato consiste nella rimozione del muscolo detrusore mentre l'urolium e il SubU/LP rimangono intatti(Figura 1B) per consentire agli investigatori l'accesso diretto a SubU/LP nel corso del riempimento della vescica.

1. Dissezione della preparazione della vescica priva di detrusivi

1. Collocare la vescica isolata in un piatto di dissezione pieno di freddo (10 gradi centigradi) e ossigenato con 5% CO₂/95 % O₂ Krebs soluzione bicarbonato (KBS) con la seguente composizione (mM): 118.5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl₂, 23.8 NaHCO₃, 1.2 KH₂PO₄, 11.0 dextrose, 1.8 CaCl₂ (pH 7.4)¹³.
2. Pin una piccola porzione della cupola della vescica isolata a un piatto di dissezione sillgarda ricoperto di Sylgard pieno di KBS. Assicurarsi che il perno passi attraverso un pezzo di sirosa o il bordo più esterno del muscolo detrusore lontano dal bordo più interno del muscolo che si affaccia sul SubU/LP.
3. Utilizzando un microscopio, identificare l'uretra e gli ureteri e fissare ciascuno di essi sul fondo del piatto di dissezione.
4. Rimuovere i tessuti adiposi e connettivi in eccesso in modo che vengavisualizzato l'intero corpo principale della vescica, l'uretra ed entrambi gli ureteri.
5. Legare gli ureteri con 6-0 suture di nylon. Quindi, pin le estremità aperte degli ureteri verso il fondo del piatto di dissezione per garantire la preparazione.
6. Utilizzando pinze a punta fine, tirare delicatamente un pezzo di sirosa all'angolo tra l'uretere e il corpo della vescica.
7. Regolare la luce del microscopio per aumentare la trasparenza e distinguere il margine della sottomucosa sotto il muscolo detrusore.
8. Iniziare a tagliare (non peeling!) la parete della vescica con forbici a punta fine lungo la superficie interna dello strato muscolare del detrusore mentre si allontana delicatamente il segmento tagliato dalla preparazione. In ogni momento, assicurarsi che il bordo laterale della mucosa può essere visto ed evitare di toccarla.
9. Rimuovere completamente il muscolo detrusore girando intorno al piatto di dissezione in modo che la posizione della preparazione sia comoda per continuare a sezionare il muscolo detrusore.
10. Lasciare un piccolo pezzo di muscolo detrusore sulla parte superiore della cupola della vescica per garantire la capacità di immobilizzare la preparazione durante le fasi rimanenti del protocollo.
11. Fare un doppio anello di 6-0 filo di nylon, posizionarlo intorno al collo della preparazione della vescica, e lasciare il ciclo sciolto.
12. Aggiungere un secondo doppio anello di 7-0 filo di seta, posizionarlo intorno al collo della preparazione della vescica e lasciare che il ciclo perda. Avere due suture previene le perdite intorno alle suture.
13. Tagliare circa 2 cm di 20 pE tubi (catetere), brillare la punta muovendo lentamente la punta vicino a una fiamma.
14. Riempire il catetere con KBS ossigenato caldo (37 gradi centigradi).
15. Inserire il catetere nell'orifizio dell'uretra della vescica e spingere delicatamente il catetere fino a quando la punta del catetere raggiunge approssimativamente il centro della vescica.
16. Legare la sutura intorno al catetere e il tessuto circostante del collo della vescica.
17. Riempire lentamente la vescica con circa 50-100 gradi di KBS ossigenato (37 gradi centigradi), sollevarla brevemente (<10 s) sopra la superficie di KBS e monitorare le perdite alle suture e al corpo della vescica.
18. Se non si osserva alcuna perdita, la preparazione è pronta per l'esperimento. Se si osserva una perdita intorno alla sutura, rimuovere la sutura e sostituirla. Se si nota una perdita da un buco nel corpo della vescica, scartare la preparazione.

2. Riempimento della preparazione della vescica denudata

1. Perfusi KBS (37 ) in una camera da 3 mL di un piatto d'organo rivestito in acqua con fondo Sylgard.
2. Regolare le linee di ossigeno e aspirazione.
3. Posizionare la preparazione della vescica denudata nella camera.
4. Fissare il catetere sul lato della camera in modo che la preparazione non galleggia sopra la superficie della soluzione di perfusione.
5. Collegare il catetere della vescica a un tubo PE20 più lungo (linea di infusione) collegato al stopcock a tre vie utilizzando il raccordo della stessa dimensione.
6. Assicurarsi che le linee tra la pompa di infusione, il trasduttore di pressione e la vescica siano aperte.
7. Riempire la siringa di infusione con KBS fresco, caldo (37 gradi centigradi) e ossigenato.
8. Regolare i parametri della pompa: tipo/volume della siringa (ad esempio, 1 mL), funzionamento (cioè infuso), flusso (cioè costante) e portata (ad es. 15 l/min).
9. Premere il pulsante Start sulla pompa della siringa per riempire la vescica.
10. Monitorare il volume di riempimento e la pressione intravesica durante il riempimento della vescica.

3. Rilevamento dei Mediatori nell'Aspetto SubU/LP della preparazione della vescica denudata

1. Raccogliere le aliquote della soluzione vasca da bagno in tubi di microcentrifuga a freddo ghiaccio o inserti di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
2. Preparare ed elaborare i campioni in base all'applicazione di rilevamento appropriata. Nel caso di rilevamento della disponibilità di purine, elaborare i campioni da HPLC con rilevamento della fluorescenza^13,18.

Risultati

La parete di preparazione della vescica senza detrusori murini è intatta e contiene tutti gli strati tranne il DSM e la sirosa. Studi di prova hanno dimostrato che la parete della vescica senza DSM comprende urothelium e SubU/LP mentre la tunica muscularis e la sirosa sono assenti (Figura 2)¹³.

Riempimento della vescica detrustore-free approssima il normale riempime...

Discussione

La vescica ha due funzioni: stoccaggio e svuotamento dell'urina. Il normale funzionamento di queste funzioni richiede un adeguato rilevamento meccanico del volume e della pressione intraluminale e la trasduzione dei segnali attraverso le cellule nella parete della vescica per regolare l'eccitabilità muscolare detrusatrice. La mucosa della vescica (urothelium) è creduta per regolare l'eccitabilità della vescica rilasciando una varietà di molecole di segnalazione nella SubU/LP che colpiscono numerosi tipi di cellule ne...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	Fisher	C79	Source flexible
Dextrose	Fisher	D16	Source flexible
Dissecting pins	Fine Science Tools	26002-20	Source flexible
Infusion Pump	Kent Scientific	GenieTouch	Source flexible
KCl	Fisher	P217	Source flexible
KH2PO4	Fisher	P284	Source flexible
Light source	SCHOTT ACEI		Source flexible
Microscope	Olympus SZX7		Flexible to use any scope
MgCl2	Fisher	M33	Source flexible
NaCl	Fisher	S671	Source flexible
NaHCO3	Fisher	S233	Source flexible
Needles 25G	Becton Dickinson	305122	Source flexible
Organ bath	Custom made		Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish
PE-20 tubing	Intramedic	427405	Source flexible
Pressure transducer	AD instrument		Source flexible
S&T Forceps	Fine Science Tools	00632-11	Source flexible
Software pressure-volume	AD Instruments	Power lab
Suture Nylon, 6-0	AD surgical	S-N618R13	Source flexible
Suture Silk, 6-0	Deknatel via Braintree Scientific, Inc.	07J1500190	Source flexible
Syringes 1 ml	Becton Dickinson	309602	Source flexible
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08	Source flexible
Water circulator	Baxter	K-MOD 100	Source flexible