Analisi del microambiente epatico durante la progressione precoce del carcinoma epatocellulare associato alla steatosi epatica non alcolica nel pesce zebra

Riepilogo

Qui, presentiamo come generare un modello di zebrafish con carcinoma epatocellulare (HCC) associato alla malattia del fegato grasso non alcolico (NAFLD) per studiare l'impatto del surplus di colesterolo sul microambiente epatico e sul panorama delle cellule immunitarie.

Abstract

Il cancro del fegato è attualmente la terza causa di morte correlata al cancro in tutto il mondo e il carcinoma epatocellulare (HCC) rappresenta il 75-90% di tutti i casi di cancro al fegato. Con l'introduzione di trattamenti efficaci per prevenire e curare l'epatite B / C, la steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e la forma più aggressiva nota come steatoepatite non alcolica (NASH), stanno rapidamente diventando i fattori di rischio numero uno per sviluppare HCC nelle società moderne. Per comprendere meglio il ruolo che la NASH ha nello sviluppo dell'HCC, abbiamo progettato un pesce zebra HCC associato alla NASH. La chiarezza ottica e la trattabilità genetica delle larve di zebrafish le rendono un modello attraente e potente per studiare il microambiente epatico e la composizione delle cellule immunitarie utilizzando l'imaging fluorescente dal vivo non invasivo. Questo protocollo descrive come utilizzare un modello di zebrafish HCC associato alla NASH per studiare l'effetto del surplus di colesterolo nel microambiente epatico e il suo impatto sulla composizione delle cellule immunitarie nelle prime fasi della malattia. In primo luogo, nutriamo le larve di HCC (s704Tg), che esprimono beta-catenina attivata specifica per gli epatociti, con una dieta ad alto contenuto di colesterolo al 10% per 8 giorni per sviluppare un modello HCC associato alla NASH. Qui descriviamo come utilizzare diverse linee transgeniche per valutare diverse caratteristiche neoplasie precoci nel fegato mediante microscopia confocale non invasiva, come l'area epatica, la cellula e la morfologia nucleare (area degli epatociti, area nucleare, rapporto nucleare:citoplasmatico (rapporto N:C), circolarità nucleare, micronuclei/punteggio di ernia nucleare) e angiogenesi. Quindi, utilizzando linee transgeniche con cellule immunitarie marcate (neutrofili, macrofagi e cellule T) mostriamo come analizzare la composizione delle cellule immunitarie del fegato nelle larve HCC associate alla NASH. Le tecniche descritte sono utili per valutare il microambiente epatico e la composizione delle cellule immunitarie nelle prime fasi dell'epatocarcinogenesi, ma possono anche essere modificate per studiare tali caratteristiche in altri modelli di malattia epatica.

Introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è un tumore aggressivo con opzioni terapeutiche limitate. È stato riscontrato che oltre il 30% di tutti i pazienti con HCC sono obesi e hanno NASH, una forma aggressiva di NAFLD 1,2,3,4. Il consumo di diete ricche di calorie aumenta drasticamente la disponibilità di acidi grassi che causano cambiamenti metabolici locali e sistemici e innescano steatosi, lesioni degli epatociti, infiammazione e fibrosi - tutte caratteristiche chiave della NASH. La progressione della NASH verso HCC comporta l'accumulo di lipidi nel fegato, che innesca l'infiammazione e l'alterazione della composizione delle cellule immunitarie ^5,6,7. È di particolare interesse e importanza capire come il microambiente epatico e il panorama delle cellule immunitarie sono alterati durante la progressione della malattia epatica e come cambia a causa di determinati fattori eziologici. Per identificare meglio l'impatto che il surplus di colesterolo ha sul microambiente epatico e sul panorama delle cellule immunitarie, abbiamo sviluppato un modello unico di zebrafish di HCC associato alla NASH. L'uso di questo modello ci ha dato una migliore comprensione dell'impatto della dieta e della sovranutrizione sul microambiente epatico e sulla progressione della malattia epatica.

I modelli di mammiferi, come topi e campioni di tessuto umano, sono stati essenziali per comprendere la patogenesi della steatoepatite e della steatosi⁸. I topi sono il modello preferito per le malattie del fegato e il cancro, ma mancano di chiarezza ottica a livello cellulare, mentre i campioni di tessuto umano spesso mancano dell'ambiente 3D che i modelli animali sono in grado di imitare. Questi ostacoli hanno reso il pesce zebra un modello potente nella comunità di ricerca. I pesci zebra hanno notevoli somiglianze con gli esseri umani, con almeno il 70% di conservazione genetica. Mantengono il microambiente epatico, la composizione cellulare epatica, la funzione, la segnalazione e la risposta alle lesioni ^9,10. Utilizzando una dieta ad alto contenuto di colesterolo (HCD) in combinazione con un modello di zebrafish transgenico di HCC, abbiamo sviluppato un modello di zebrafish di HCC associato alla NASH.

Qui presentiamo un protocollo che spiega come generare un modello di zebrafish HCC associato alla NASH e come studiare il microambiente epatico e affrontare le caratteristiche neoplasie precoci in vivo. Utilizzando la microscopia confocale non invasiva in combinazione con linee transgeniche di zebrafish con membrana e nucleo di epatociti marcati in modo fluorescente, possiamo affrontare le caratteristiche di malignità precoce analizzando la morfologia epatica (area, volume e superficie), la morfologia cellulare e nucleare (area degli epatociti, area nucleare, rapporto N/C, circolarità nucleare, micronuclei / punteggio di ernia nucleare) e l'angiogenesi (densità dei vasi). Il microambiente delle cellule immunitarie è anche una caratteristica importante sull'epatocarcinogenesi^11,12,13,14, quindi, mostriamo anche come analizzare la composizione delle cellule immunitarie del fegato nelle larve HCC associate alla NASH, utilizzando linee di zebrafish transgeniche con cellule immunitarie marcate (neutrofili^, macrofagi e cellule T). Le tecniche descritte sono uniche per il modello ed estremamente utili per valutare il microambiente epatico e la composizione delle cellule immunitarie nella progressione della malattia epatica.

Protocollo

Gli studi sugli animali vengono effettuati seguendo le procedure approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Albert Einstein College of Medicine. Per le ricette relative ai buffer e alle soluzioni utilizzate nel protocollo, fare riferimento alla Tabella supplementare 1.

1. Preparazione di una dieta arricchita di colesterolo al 10% per il surplus di colesterolo acuto.

1. Pesare 2 x 4 g di Golden Pearl Diet 5-50 nm Active Spheres (GPAS) in due becher di vetro da 25 ml, uno per la dieta normale (ND) e l'altro per la dieta ad alto contenuto di colesterolo alto al 10% (HCD).
   NOTA: È possibile utilizzare qualsiasi dieta commerciale di cibo secco per larve di zebrafish.
2. Pesare 0,4 g di colesterolo in un becher di vetro da 10 ml. Coprire il becher con un foglio di alluminio.
3. Misurare 5 mL di etere dietilico usando una siringa da 10 mL con un ago da 20 G. Quindi, aggiungere l'etere dietilico al becher ND e mescolarlo immediatamente con il cibo secco usando una spatola.
   ATTENZIONE: L'etere dietilico provoca irritazione agli occhi, alla pelle e alle vie respiratorie. Utilizzare solo in una cappa aspirante chimica.
4. Misurare nuovamente 5 mL di etere dietilico utilizzando una siringa da 10 mL con un ago da 20 G e aggiungerlo al becher da 10 mL con colesterolo, mescolare aspirando immediatamente su e giù con la siringa.
5. Aggiungere rapidamente la soluzione di colesterolo al becher HCD e mescolarla immediatamente con una spatola fino a quando la soluzione è uniforme.
6. Lasciare i bicchieri nel cappuccio per un massimo di 24 ore per far evaporare completamente l'etere dietilico. Il giorno dopo, macinare le diete GPAS in particelle fini usando un pestello e un mortaio.
   NOTA: Macinare le diete è un passo cruciale, le larve non saranno in grado di mangiare particelle più grandi di 50 nm.
7. Trasferire ogni dieta in un piccolo sacchetto di plastica etichettato o in una provetta da centrifuga da 50 ml e conservare a -20 °C.

2. Induzione della NASH con larve a breve termine che si nutrono con dieta arricchita di colesterolo - condizioni statiche.

1. Impostare le linee di pesci transgenici il giorno -1 (Tabella 1). La mattina dopo (giorno 0), dopo che i pesci hanno deposto le uova, raccogli le uova in un colino a rete.
2. Utilizzando un flacone di lavaggio con acqua embrionale (E3), sciacquare accuratamente le uova e trasferire con cura le uova in una piastra di Petri di 10 cm con mezzo E3.
3. Pulire le piastre da tutti i detriti che potrebbero essersi accumulati nelle scatole di allevamento, comprese eventuali uova morte o non fecondate.
   NOTA: Il risciacquo delle uova e la pulizia delle piastre è fondamentale per evitare la crescita incontrollata di microrganismi e conseguenti difetti sullo sviluppo delle larve.
4. Dividere le uova in una densità di 70/80 per 10 cm di piastre di Petri (in 25 ml di E3). Al giorno 1, sotto un cannocchiale di dissezione dotato di una base di transilluminazione, controllare e pulire embrioni morti o embrioni con difetti di sviluppo.
   NOTA: Utilizzare la modalità campo scuro della base di transilluminazione per identificare gli embrioni con effetti sullo sviluppo e per verificare la crescita di microrganismi nelle piastre. Diverse strutture hanno una diversa resa di microrganismi nei loro sistemi. Cambiare il mezzo E3 e/o i piatti, se necessario, per evitare effetti negativi.
5. Al giorno 5, unire le larve di tutti i piatti in una capsula di Petri di 15 cm, aggiungere E3 senza blu di metilene. Quindi, dividere le larve nelle scatole di alimentazione come segue (Tabella 2).
   NOTA: In condizioni di controllo, per generare larve sane senza innescare un'infiammazione cronica sistemica, le larve devono essere alimentate con circa 0,1 mg di cibo per larva al giorno. Si noti che la quantità totale di cibo (Tabella 2) è divisa equamente in due poppate al giorno.
6. Tenere le larve in un'incubatrice a 28 °C, in un ciclo buio-luce (ad esempio, 14 ore di luce/10 ore di buio), e nutrire le larve due volte al giorno dal giorno 5 al giorno 12.
7. Aspirare giornalmente eventuali residui di cibo, nonché il 90-95% del mezzo utilizzando un sistema a vuoto collegato a una punta di pipetta da 1 ml. Quindi versare con cura il nuovo E3 senza blu di metilene in un angolo della scatola di alimentazione per evitare di danneggiare le larve.
   NOTA: La pulizia quotidiana delle scatole di alimentazione è fondamentale per evitare la crescita incontrollata di microrganismi.

3. Raccolta di larve di 13 giorni dopo la fecondazione dalle scatole di alimentazione.

1. Al giorno 13, prepara i piatti di raccolta in base al numero di condizioni sperimentali che sono state impostate. Con un pennarello permanente fare un segno sul lato dei piatti (coperchio e fondo) per evitare di cambiare campioni, ad esempio una striscia nera per la dieta normale (ND) e due strisce nere per HCD.
2. Versare abbastanza E3 senza blu di metilene per coprire il fondo di ogni piatto. Utilizzando con attenzione il sistema di aspirazione aspirare l'acqua dalle scatole di alimentazione, cercare di aspirare eventuali detriti o larve morte dal fondo per evitare di trasferire questi materiali ai piatti di raccolta.
3. Quando il livello dell'acqua inizia ad abbassarsi, sollevare lentamente la scatola di alimentazione per far nuotare le larve verso uno degli angoli, quindi aspirare nella direzione opposta.
   NOTA: Utilizzare una pipetta da 1 mL con punte tagliate, a diverse altezze, per consentire diametri diversi durante l'aspirazione dell'acqua. Alternare tra le diverse dimensioni, iniziare con un diametro più grande e passare a uno più piccolo man mano che il volume dell'acqua si riduce e la densità delle larve aumenta.
4. Una volta che ci sono solo circa 20-30 ml di liquido, decantare accuratamente le larve nella capsula di Petri di raccolta preparata nella fase 1. Posizionare il nastro etichettato dalla scatola di alimentazione sul coperchio del piatto.
5. Ripetere i passaggi 3.2-3.4 per tutte le scatole di alimentazione.

4. Saggio di controllo per la steatosi epatica indotta dalla dieta - colorazione, imaging e punteggio Oil Red O (ORO).

1. Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, trasferire 15-20 larve in un tubo inferiore rotondo da 2 ml e mettere in ghiaccio per circa 15-30 minuti. Rimuovere la maggior parte dei supporti dal tubo.
2. Aggiungere 2 ml di 4% di paraformaldeide (PFA) per fissare le larve e incubare a 4 °C durante la notte.
3. La mattina dopo, rimuovere la soluzione di PFA al 4% e lavare le larve tre volte con 2 ml di 1x PBS.
4. Preparare una piastra da 12 pozzetti (Figura 2A) per condizione con un inserto a maglie.
5. Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire la larva dal tubo da 2 mL all'inserto precedentemente posizionato nel pozzetto, aggiungere 5 mL di 1x PBS. Conservare le provette da 2 mL per la conservazione del campione dopo la colorazione.
   ATTENZIONE: Le larve sono estremamente appiccicose in questa fase non utilizzare pipette di plastica.
6. Trasferire l'inserto con le larve in un altro pozzetto con 5 ml di soluzione di isopropanolo al 60%. Incubare le larve per 30 min a temperatura ambiente (RT).
7. Nel frattempo, preparare un olio rosso O allo 0,3% in una soluzione di isopropanolo al 60%. Filtrare due volte la soluzione rosso olio allo 0,3% utilizzando un filtro a siringa da 0,45 μm.
   NOTA: Preparare 5 ml di soluzione per pozzetto mescolando 3 ml di olio O rosso 0,5% in isopropanolo con 2 ml di acqua distillata. Lo 0,3% di olio rosso O in soluzione di isopropanolo al 60% deve essere preparato al momento.
8. Quindi, trasferire l'inserto a rete con le larve in un altro pozzetto con 5 ml di olio O rosso olio appena fatto allo 0,3% in soluzione di isopropanolo al 60%. Larve incubate per 3 ore a RT con un leggero dondolio.
9. Dopo la colorazione ORO, sciacquare le larve trasferendo l'inserto in un altro pozzetto con isopropanolo al 60%. Lavare le larve due volte in isopropanolo al 60% per 30 minuti ogni volta trasferendo l'inserto sequenzialmente nei pozzetti con isopropanolo al 60%.
10. Lavare le larve tre volte per 5 minuti in 1x PBS-0,1% Tween trasferendo l'inserto sequenzialmente ai pozzetti con 1x PBS-0,1% Tween.
11. Trasferire le larve nei tubi da 2 ml. Rimuovere PBST, aggiungere 1 mL di glicerolo all'80% e conservare a 4 °C fino all'imaging.
12. Per una migliore imaging, trasferire le larve a 1x PBS-0.1% Tween e sotto un ambito di dissezione sezionare i fegati tirando attentamente i tessuti usando due pinze # 55.
    NOTA: Se si utilizza un imaging di fondo Casper può essere eseguito utilizzando le larve intere.
13. Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire con cura i fegati in un pozzetto di una piastra spot in porcellana con glicerolo al 50%. Posizionare i fegati usando un piccolo strumento per manipolare le larve (ad esempio, strumento ciglia - Figura 2B). Fegati di immagini in uno stereomicroscopio dotato di una telecamera a colori.
14. Steatosi epatica Score (nessuna colorazione ORO = nessuna; colorazione ORO rosso chiaro = lieve; colorazione ORO rosso-rosso scuro = moderata/grave).

5. Imaging confocale non invasivo utilizzando il dispositivo di ferimento e intrappolamento del pesce zebra per la crescita e l'imaging (zWEDGI).

1. Preparare una capsula di Petri da 10 cm con 15-20 ml di 1x Tricaina-E3, quanto basta per coprire il fondo.
   NOTA: Una soluzione di lavoro 1x Tricaina-E3 (0,16 mg/ml) può essere ottenuta diluendo 2 mL di una soluzione madre di tricaina 25x (4 mg/ml) in 48 mL di E3. La concentrazione di tricaina non deve superare 0,16 mg/ml poiché le larve sono estremamente sensibili all'anestesia in questa fase di sviluppo.
2. Trasferire 15-20 larve con una pipetta Pasteur di plastica nella piastra di Petri contenente 1x Tricaina-E3 e anestetizzare le larve per 5 minuti.
3. Preparare una piastra a 6 pozzetti con 2-3 ml di E3 senza blu di metilene per pozzetto.
4. Su uno stereomicroscopio fluorescente, schermare le larve anestetizzate, per i marcatori fluorescenti desiderati (Tabella 1). Trasferire le larve schermate nella quantità minima di Tricaina in E3 e lasciarle recuperare nella piastra a 6 pozzetti fino al momento di visualizzare.
   NOTA: Lo screening delle larve transgeniche doppie, triple e quadruple richiede tempo, posizionare le larve in E3 e cambiare spesso i terreni dalla piastra a 6 pozzetti per ridurre l'esposizione non necessaria alla tricaina. Inoltre, le larve in questa fase di sviluppo galleggiano, quindi utilizzare uno strumento ciglia per posizionare le larve per lo screening senza indurre danni ai tessuti.
5. Dopo lo screening, preparare una capsula di Petri da 10 cm con 25 ml di 1x Tricaina-E3. Trasferire 15-20 larve con una pipetta Pasteur di plastica nella capsula di Petri contenente 1x Tricaina-E3 e anestetizzare le larve per 5 minuti.
6. Nel frattempo, sotto lo stereomicroscopio aggiungere 1x Tricaina-E3 nelle camere del dispositivo di ferimento e intrappolamento (ad esempio, zWEDGI)^15,16. Rimuovere le bolle d'aria dalle camere e dal tunnel di contenimento utilizzando una micropipetta P200. Rimuovere tutto l'eccesso di 1x Tricaina-E3 lasciando solo il volume sufficiente per riempire le camere.
7. Trasferire una larva anestetizzata nella camera di carico dello zWEDGI e posizionarla usando uno strumento ciglia sotto lo stereomicroscopio. Delicatamente, tocca la testa delle larve e spingila in modo che la coda entri nel tunnel di contenimento. Inoltre, utilizzando la micropipetta rimuovere 1x Tricaina-E3 dalla camera di ferita per aiutare la larva a entrare nel tunnel. Assicurarsi che la larva sia posizionata in modo appropriato per l'imaging del lobo sinistro - Microscopio invertito: lato sinistro rivolto verso il basso; Microscopio verticale: lato sinistro rivolto verso l'alto.
   NOTA: Se uno zWEDGI non è disponibile, il pesce può essere montato e posizionato in agarosio a basso punto di fusione all'1% in 1x Tricaina-E3, tuttavia, l'immersione di agarosio può essere utilizzata solo per immagini rapide (fino a 15 minuti).
8. Per l'analisi della morfologia nucleare e degli epatociti, visualizzare i fegati con un microscopio confocale utilizzando un obiettivo aereo 40x e z-stack di sezioni ottiche da 2 μm. Per i saggi di morfologia epatica, angiogenesi e reclutamento delle cellule immunitarie, i fegati di immagine utilizzano un obiettivo aereo 20x e z-stack di sezioni ottiche da 5 μm. Per le larve con fegati grandi, devono essere prese immagini di piastrelle 2 x 2 per assicurare l'imaging di tutto il fegato e dell'area circostante di 75 μm.
9. Dopo l'imaging, utilizzare una pipetta Pasteur di plastica con 1x Tricaina-E3 per estrarre la larva dal tunnel di contenimento e trasferirla in una capsula di Petri con E3 senza blu di metilene.

6. Analisi delle variazioni morfologiche epatiche.

NOTA: I passaggi elencati di seguito vengono eseguiti per la quantificazione della superficie e del volume del fegato:

1. Software di imaging aperto. Aggiungi cartella contenente i file immagine da analizzare ad Arena selezionando l'icona Osserva cartella . Successivamente, facendo clic con il pulsante destro del mouse sulle miniature, selezionare Converti in formato di file Imaris nativo per convertire i file nel formato (.ims).
2. Nel sottomenu Supera regola la luminosità e il contrasto per ciascun canale. Quindi, crea una superficie dal fegato facendo clic sul pulsante blu Aggiungi nuove superfici .
3. Successivamente, nel pannello di creazione della superficie, selezionare Segmenta solo una regione di interesse per creare manualmente una superficie del fegato.
4. Fai clic su Ignora creazione automatica | Opzione Modifica manualmente . Seleziona Contorno e deseleziona l'opzione "Volume" nel pannello della scena.
   NOTA: l'opzione di visualizzazione del volume deve essere deselezionata, altrimenti la selezione della regione di interesse in diversi z-stack non sarà possibile.
5. Naviga tra le pile di z e disegna la regione di interesse in ciascun piano selezionando Modalità, scegli la modalità di disegno che preferisci. Per iniziare a disegnare cambia puntatore in modalità Seleziona e non Naviga, fai clic su Disegna e inizia a trascinare il puntatore attraverso il fegato per disegnare un ROI.
6. Dopo aver selezionato un ROI nei diversi piani focali, selezionare Crea una superficie per unire tutti i ROI selezionati e creare la superficie del fegato.
7. Successivamente, utilizzando la superficie appena creata, creare una maschera del segnale degli epatociti. Fare clic sulla superficie e nella scheda Modifica (matita) scegliere Maschera tutto. Nella finestra che appare, scegli il canale che desideri mascherare che verrà utilizzato per quantificare il volume del fegato e la superficie. Quindi, scegli imposta i voxel all'esterno della superficie su 0 e seleziona l'opzione Duplica canale prima di applicare la maschera.
8. Utilizzare la superficie del fegato e i valori del volume del fegato dal menu di analisi statistica per l'analisi.

NOTA: Eseguire i seguenti passaggi per la quantificazione dell'area epatica.

9. Apri il software Fiji. Nel menu Plugin, selezionare Bio-formati seguito da Bio-formati Importer, selezionare l'opzione Dividi canali per aprire il file immagine.
10. Nel menu Immagine, selezionare Proprietà per verificare che l'immagine abbia le dimensioni in pixel e la profondità del voxel corrette, se non i valori corretti. Quindi, vai al menu Immagini, fai clic su Regola seguito da Luminosità e contrasto, regola la luminosità e il contrasto dell'immagine.
11. Successivamente, utilizzando il canale degli epatociti crea una proiezione di massima intensità del fegato. Vai al menu Immagini, fai clic su Pile seguito da Progetto Z. Selezionare Proiezione intensità massima.
12. Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, creare manualmente una regione di interesse (ROI) che circonda il fegato larvale. Successivamente, nel menu Analizza fare clic su Misura per ottenere l'area del fegato. Salva i risultati come foglio di calcolo per ulteriori analisi.

7. Analisi morfologica degli epatociti e nucleari.

1. Apri il software Fiji. Nel menu Plugin, selezionare Bio-formati seguiti da Bio-formati Importatore spuntare sull'opzione Dividi canali per aprire il file immagine.
2. Nel menu Immagine, selezionare Proprietà per verificare che l'immagine abbia le dimensioni in pixel e la profondità del voxel corrette, se non i valori corretti. Quindi, vai al menu Immagini, fai clic su Regola seguito da Luminosità e contrasto, regola la luminosità e il contrasto dell'immagine.
3. Nel menu Analizza selezionare Imposta misure selezionare tutti i parametri che si desidera analizzare (ad esempio, descrittori di area, perimetro e forma). Selezionare il canale fluorescente della membrana degli epatociti. Navigando attraverso Z, utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare un ROI perfetto attorno a un epatocita. Successivamente, nel menu Analizza fare clic su Misura per calcolare l'area degli epatociti.
4. Ripetere il passaggio 7.3 per 15-30 epatociti. Salva i risultati come foglio di calcolo per ulteriori analisi.
5. Quindi, selezionare il canale fluorescente del nucleo. Navigando attraverso Z, utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare un ROI perfetto attorno al nucleo degli epatociti. Successivamente, nel menu Analizza fare clic su Misura per calcolare l'area nucleare e la circolarità.
6. Ripetere il passaggio 7.5 per 15-30 epatociti. Salva i risultati come foglio di calcolo per ulteriori analisi, inclusa la quantificazione del rapporto nucleare:citoplasmatico.
7. Valutare i campioni per la presenza di micronuclei ed ernia come segue (Tabella 3).

8. Analisi dell'angiogenesi.

1. Creare manualmente una superficie per il fegato come descritto nella sezione 6 di questo protocollo. Denominate questa superficie come "Superficie del fegato".
2. Creare una maschera per il segnale delle cellule endoteliali all'interno del fegato. Fare clic sulla superficie e nella scheda di modifica (la matita) scegliere Maschera tutto. Nella finestra che appare, scegli il canale delle cellule endoteliali per isolare i segnali dei vasi solo dal fegato. Scegli di impostare i voxel esterni sulla superficie su 0 e seleziona l'opzione Duplica canale prima di applicare Maschera.
3. Rinominare le nuove cellule endoteliali canale mascherato come Vascolarizzazione epatica.
4. Per misurare il volume e la superficie del recipiente, creare una seconda superficie. Fare clic sul pulsante blu Aggiungi nuove superfici . Nella prima fase della creazione della superficie, accertatevi che tutte le opzioni siano deselezionate per creare automaticamente una superficie.
5. Nel secondo passaggio scegliere Canale di vascolarizzazione epatica per creare una superficie sopra. Deselezionate l'opzione di livellamento per rilevare il maggior numero possibile di dettagli dalle navi e abilitare la sottrazione dello sfondo nell'opzione di soglia.
6. Regolare la soglia assicurando che la superficie rilevata sia colocalizzata con il segnale di vascolarizzazione epatica. Utilizzare i valori di superficie e volume dal menu di analisi statistica. Calcolare l'indice di densità del vaso utilizzando le seguenti equazioni:
   Indice di densità dei vasi (per fegato μm 2) = (Area della superficie del vaso (μm 2)) / (Area della superficie epatica (μm²))
   Indice di densità dei vasi (per fegato μm 3) = (volume del vaso (μm 3)) / (volume del fegato (μm³))

9. Analisi del reclutamento delle cellule immunitarie.

1. Apri il software Fiji. Nel menu Plugin, selezionare Bio-formati seguiti da Bio-formati Importatore spuntare sull'opzione Dividi canali per aprire il file immagine.
2. Nel menu Immagine , selezionare Proprietà per verificare che l'immagine abbia le dimensioni in pixel e la profondità del voxel corrette, se non i valori corretti. Quindi, vai al menu Immagini , fai clic su Regola seguito da Luminosità e contrasto, regola la luminosità e il contrasto dell'immagine (ad esempio, macrofagi - mCherry o dTomato; neutrofili - BFP; Cellule T - EGFP; epatociti - EGFP o mCherry).
3. Quindi, create proiezioni di intensità massima per ciascun canale.
4. Come descritto nella sezione 6 (Passi 6.9-6.12), creare un ROI che circonda il fegato larvale e misurare l'area del fegato. Creare un secondo ROI che includa l'area del fegato e l'area circostante di 75 μm ("Area di reclutamento").
5. Successivamente, nel menu Modifica selezionare l'opzione Selezione seguita da Aggiungi al manager. Selezionando un canale di cellule immunitarie innate Proiezione di massima intensità, fare clic sul ROI del fegato dalla finestra ROI Manager per impostare l'area Reclutamento.
6. Nel menu Plugin, selezionare l'opzione Analizza seguita da Cell Counter e contare le cellule immunitarie all'interno dell'area di reclutamento. Registrare il numero di cellule immunitarie reclutate nell'area del fegato su un foglio di calcolo.
7. Calcola le densità di neutrofili, macrofagi e cellule T normalizzando il numero di cellule immunitarie per area epatica.

Risultati

Introducendo una dieta a breve termine ad alto contenuto di colesterolo in un modello di zebrafish con carcinoma epatocellulare (HCC), che sovraesprime una forma costitutivamente attiva specifica per gli epatociti di beta-catenina (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)¹⁷, siamo in grado di creare un modello di vertebrato non mammifero di HCC associato alla NASH. La progressione della malattia epatica può essere monitorata precocemente misurando la steatosi epatica, le dimensioni del fegato, l'epatocita, la morfologia nucleare, l'angiogenesi e l'infiltrazione delle cellule immunitarie (Figura 1).

Le larve di HCC alimentate con una dieta normale non mostrano steatosi epatica lieve, misurata dalla colorazione Oil Red O. Tuttavia, le larve di HCC alimentate con una dieta ricca di colesterolo mostrano un aumento significativo della steatosi epatica (Figura 2).

Un marker ben noto di malattia epatica è l'epatomegalia¹⁷. Per valutare le dimensioni del fegato, le larve di HCC possono essere incrociate con una linea transgenica che esprime specificamente un marcatore fluorescente sugli epatociti, come il Tg (fabp10a: H2BmCherry). Per valutare l'epatomegalia, vengono eseguite la valutazione dell'area epatica (2D), della superficie epatica e del volume epatico (3D). Dopo 8 giorni di esposizione a un surplus di colesterolo, è stato osservato un ingrossamento del fegato nelle larve di HCC (Figura 3).

Utilizzando l'imaging live non invasivo, linee di pesci transgenici che esprimono proteine fluorescenti nelle membrane degli epatociti (come Tg (fabp10a: Life-actina-EGFPP) e nei nuclei degli epatociti (come Tg (Fabp10a: H2B-mCherry) possono essere utilizzate per valutare le alterazioni morfologiche cellulari e nucleari associate alla malignità negli epatociti. L'area degli epatociti era aumentata nell'HCC associato alla NASH (Figura 4A,B,D), così come nell'area nucleare (Figura 4C,E) e nel rapporto nucleare:citoplasmatico (Figura 4F). Una significativa diminuzione della circolarità nucleare è stata osservata anche nel gruppo HCD+HCC (Figura 4G). La lipotossicità innesca il danno al DNA, una caratteristica della carcinogenesi in presenza di micronuclei. Utilizzando il marcatore H2B-mCherry abbiamo osservato una maggiore incidenza di micronuclei nelle larve di HCC alimentate con una dieta ricca di colesterolo (Figura 4H).

La vascolarizzazione epatica può essere facilmente valutata in modelli di zebrafish utilizzando una linea marcata transgenica, come Tg (kdrl:mCherry o Tg(fli:EGFP), che marcano la vascolarizzazione. Un aumento significativo della densità dei vasi è stato osservato nelle larve di HCC+HCD (Figura 5).

Per osservare la risposta infiammatoria innescata precocemente nell'HCC associato alla NASH, una linea di pesci transgenici che esprime proteine fluorescenti nei macrofagi e nei neutrofili, come Tg (mfap4: tdTomato-CAAX; lyz: BFP), è stata incrociata con la linea transgenica HCC. L'infiltrazione di neutrofili e macrofagi si verifica sia nell'HCC che nell'HCC alimentati con HCD, che è stata valutata mediante quantificazione del numero e della densità dei neutrofili/macrofagi nel fegato e nelle vicinanze (area circostante fino a 75μm) (Figura 6A-H). Tuttavia, l'HCC+HCD ha mostrato un aumento significativo del numero e della densità dei neutrofili (Figure 6F-H). A 13 giorni dalla fecondazione, il sistema immunitario adattativo è già funzionale. Utilizzo di una linea di pesci transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule T, come la Tg(lck:EGFP), e in combinazione con la linea transgenica HCC; abbiamo valutato l'impatto del surplus di colesterolo sul reclutamento delle cellule T nel fegato. Una significativa diminuzione della densità delle cellule T e del numero complessivo è stata osservata nelle larve di HCC alimentate con HCD (Figura 6I-K).

Linee di pesce zebra transgenico	Riferimento ZFIN	Saggio
Casper	RoyA9; mitfaw2	Steat osi epatica
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venere / fabp10a:H2B-mCherry )	s704Tg / uwm41Tg	Morfologia del fegato
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venere; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)	s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg	Epatociti e morfologia nucleare
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)	s704Tg / y1Tg	Angiogenesi
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venere;  mfap4:Pomodoro-CAAX; lyzC:BFP)	s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg	Reclutamento di macrofagi e neutrofili
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)	s704Tg / cz1Tg	Reclutamento delle cellule T

Tabella 1: Linee di pesci zebra transgenici da utilizzare in diversi saggi.

Numero di larve	Dimensioni della scatola di alimentazione	Quantità di cibo al giorno (mg)	Volume E3 (ml)
30-40	Piccola scatola di allevamento	3-4	200
60-80	Piccola/grande scatola di allevamento	6-8	400
100-150	Grande scatola di allevamento	10-15	500

Tabella 2: Impostare le condizioni delle scatole di alimentazione.

Fenotipo	Metodo di assegnazione dei punteggi
Nessuno	Nuclei normali, Nessun micronuclei o ernia
Lieve	Basso numero di micronuclei (meno di 5 per campo visivo) e/o ernia
Moderato/Grave	Numero da moderato ad elevato di micronuclei (più di 5 per campo visivo) e/o ernia

Tabella 3: Micronuclei e punteggio di ernia nucleare.

Figura 1: Diagramma di protocollo che riassume le principali fasi sperimentali e l'approccio analitico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Saggio di controllo per la steatosi epatica - colorazione ORO. Le larve di HCC sono state alimentate con una dieta a base di colesterolo normale o alto ed è stata eseguita la colorazione Oil Red O (ORO) per valutare la steatosi epatica. (A) Diagramma della piastra a 12 pozzetti per eseguire la colorazione sequenziale ORO utilizzando gli inserti del pozzetto della rete. (B) Immagine dello strumento ciglia utilizzato per manipolare le larve. (C) immagini rappresentative di fegati macchiati di rosso olio; Larve di HCC e HCC+HCD. (D) Grafico del chi-quadrato che mostra la percentuale di larve con diversi punteggi di steatosi epatica. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative dalle dimensioni del fegato. Le larve transgeniche di HCC che esprimono un marcatore epatico (Tg (fabp10a: H2B-mCherry)) sono state visualizzate dal vivo e in modo non invasivo, su un microscopio confocale a disco rotante invertito utilizzando uno zWEDGI. (A) Ricostruzioni rappresentative 3D di fegati in larve di HCC e HCC+HCD. (B-D) Grafico che mostra le alterazioni morfologiche del fegato tra cui l'area epatica (B), l'area della superficie epatica (C) e il volume del fegato (D) nelle larve di HCC e HCC + HCD. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Immagini rappresentative della morfologia degli epatociti e dei nuclei. Sono state visualizzate linee HCC transgeniche che esprimono proteine fluorescenti nelle membrane degli epatociti (Tg(fabp10a:Life-actina-EGFP) e nei nuclei degli epatociti (Tg(fabp10a:H2B-mCherry). (A-C) Ricostruzioni rappresentative 3D di nuclei di F-actina ed epatociti di larve di HCC e HCC+HCD. Le punte di freccia aperte mostrano nuclei allargati; le punte di freccia bianche mostrano un nucleo con forma alterata; e le frecce rosse mostrano micronuclei ed ernia nucleare. (D-G) Grafici che mostrano le medie dei parametri cellulari e nucleari nelle larve di HCC e HCC + HCD di 13 giorni. (D) Area degli epatociti. e) Zona nucleare. (F) Rapporto nucleare:citoplasma. G) Circolarità nucleare. Ogni punto rappresenta le medie per larva. I grafici a punti mostrano grafici medi ± (H) Chi-quadrato che mostrano la percentuale di larve con diversi punteggi di micronuclei e ernia nucleare. Barra di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Immagini rappresentative dal sistema vascolare epatico. Linee HCC transgeniche che esprimono proteine fluorescenti nei nuclei degli epatociti (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) e nelle cellule endoteliali (Tg)fli:EGFP)). (A) Ricostruzioni rappresentative 3D della vascolarizzazione epatica nelle larve di HCC e HCC+HCD. (B-C) Grafico che mostra l'indice di densità dei vasi per superficie epatica (B) del volume (C) nelle larve di HCC e HCC + HFCD. I grafici a punti mostrano la media ±SEM. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Immagini rappresentative dal panorama delle cellule immunitarie del fegato. Linea HCC transgenica che esprime proteine fluorescenti in macrofagi e neutrofili (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) o in cellule T (Tg(lck-EGFP). (A,C,F) Ricostruzioni rappresentative 3D di fegati e reclutamento di leucociti nell'area epatica in larve di HCC e HCC + HCD di 13 giorni. (B) Diagramma dell'area del fegato visualizzata. (D-E) Grafico che mostra la densità dei macrofagi (D) e il numero (E) nell'area epatica nelle larve di HCC e HCC + HCD. (G-H) Grafico che mostra la densità dei neutrofili (G) e il numero (H) nell'area epatica nelle larve di HCC e HCC + HCD. (G) Ricostruzioni rappresentative 3D del reclutamento delle cellule T nell'area epatica nelle larve di HCC e HCC+HCD. (H-I) Grafico che mostra la densità delle cellule T (H) e il numero (I) nell'area del fegato nelle larve di HCC e HCC + HCD. I grafici a punti mostrano la media ±SEM. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella supplementare 1: Tabella dei buffer e delle soluzioni Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Con un aumento dell'incidenza di HCC, in particolare di HCC indotto dalla NASH, è di grande importanza disporre di modelli più efficienti per studiare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nell'HCC associato alla NASH. La deconvoluzione delle interazioni cellula-cellula nel fegato è fondamentale per comprendere meglio la progressione della malattia epatica e l'epatocarcinogenesi. L'approccio descritto in questo protocollo offre un modo unico per analizzare la progressione della malattia epatica in vivo e in modo non invasivo.

La preparazione della dieta è fondamentale per il successo di stabilire un modello HCC associato alla NASH. È importante lasciare che l'etere etilico evapori completamente all'interno della cappa aspirante per evitare effetti dannosi, mentre si preparano diete per zebrafish. Per utilizzare queste diete con le larve (5-12 giorni dopo la fecondazione), è estremamente importante macinare le diete in particelle fini per assicurare l'assunzione di cibo da parte delle larve. L'uso di analoghi degli acidi grassi contrassegnati con fluorescenza può essere utilizzato per valutare l'assunzione di cibo nelle larve.

Prima di posizionare le larve nelle scatole di allevamento e iniziare la procedura di alimentazione, è fondamentale assicurarsi che il campionamento sperimentale sia uniformato mescolando larve da piastre diverse. Questo passaggio è importante poiché diversi microambienti, a partire dal Giorno 0, sono promossi in ciascuna delle piastre e potrebbero influenzare la risposta infiammatoria.

Un altro passo importante è contare le larve, per sapere quanto cibo è necessario per ogni scatola di alimentazione. Se la quantità di cibo non è adeguata al numero di larve presenti in ogni scatola, si verificherà uno dei due scenari: 1) le larve saranno denutrite; 2) le larve saranno sovralimentate. Un'alimentazione imprecisa porterà a condizioni malsane associate a malnutrizione o sovralimentazione, come l'infiammazione, che influenzeranno drasticamente il microambiente epatico. Se si verifica un'alimentazione imprecisa, le larve mostreranno problemi di movimento. In questa fase di sviluppo, le larve dovrebbero nuotare intensamente, quindi se si notano problemi di movimento, le larve sono state allevate in condizioni malsane (malnutrizione o esposizione a dosi tossiche di colesterolo a causa della sovralimentazione). Per questo motivo, le procedure di alimentazione devono essere strettamente controllate sia per le diete, normale che per quella arricchita di colesterolo. Alcuni test possono essere eseguiti per affrontare rapidamente l'accuratezza dell'alimentazione e della salute delle larve, compresa la presenza di epatomegalia (dimensioni del fegato) e l'infiammazione dei tessuti e degli organi, in particolare fegato e intestino (aumento visibile dell'infiltrazione di neutrofili e macrofagi).

La pulizia quotidiana e la sostituzione del 95% di E3 sono fondamentali per ridurre la crescita di microrganismi nelle scatole di alimentazione e migliorare la salute e la sopravvivenza delle larve. In alternativa, le larve possono essere collocate in un sistema rack stand-alone. Per ottenere i migliori risultati, posizionare 60-80 larve in un serbatoio da 3 litri. Mantenere il flusso d'acqua al livello minimo regolando il flusso in una modalità di gocciolamento rapido e alimentando le larve 3-4 mg due volte al giorno (AM e PM). Il flusso d'acqua deve essere controllato regolarmente per garantire il corretto flusso in ogni serbatoio. Nel nostro laboratorio, questo metodo ci dà il 95-100% di sopravvivenza con un'alimentazione a breve termine del 10% di HCD. Inoltre, questo metodo ha notevolmente ridotto il carico di lavoro inerente alla pulizia quotidiana e allo scambio d'acqua necessari nel protocollo di alimentazione statica descritto.

Mentre abbiamo utilizzato una dieta arricchita di colesterolo al 10% per indurre la NASH in un'esposizione a breve termine (5 giorni sono sufficienti per indurre steatoepatite), le alterazioni della dieta possono essere eseguite ed espanse per utilizzare fruttosio ¹⁸, acidi grassi (come l'acido palmitico)¹⁹ o protocolli di alimentazione che possono essere estesi utilizzando una dieta arricchita di colesterolo al 4%²⁰. Attualmente, ci sono pochi bersagli terapeutici di successo per l'HCC e nessuno per la NASH. L'uso di modelli di zebrafish offre un'opportunità unica per espandere le nostre conoscenze sull'epatocarcinogenesi, ma anche un sistema di vertebrati senza precedenti per eseguire screening farmacologici ad ampio rendimento. Le tecniche descritte in questo protocollo faciliteranno le scoperte future e gli obiettivi terapeutici per le malattie del fegato e l'epatocarcinogenesi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	Easily degraded. Store -20°C.
Corning Netwells carrier kit 15 mm	Fisher	07-200-223
Corning Netwells inserts	Fisher	07-200-212
Diethyl ether	Fisher	60-046-380	Highly Volatile.
Dumont forceps #55 dumostar	Fisher	NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in	Fisher	22-183624
4% paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	15710
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres	Brine Shrimp Direct	-	Any commercial dry powder food for larvae can be used.
Graduated Transfer Pipets	Fisher	22-170-404
Isopropanol	Fisher	BP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack	Crystalgen	221-1422-10
Petri Dishes 100X20MM	Fisher	08-747D
Tricaine	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Oil Red O solution 0.5% isopropanol	Sigma	O1391-500ML
Tricaine	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Vactrap	VWR	76207-630	Vacuum system for larvae collection
Microscopes
Fluorescent Stereomicroscope	Leica	M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large
Spinning Disk Confocal Microscope	Nikon	Nikon CSU-W1
Stereomicroscope	Leica	S9i with transilluminated base
Software
Fiji	Open-source Java image processing program.
Imaris 9.6	Bitplane; Oxford Instruments.