제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

요약

여기에서는 콜레스테롤 과잉이 간 미세 환경 및 면역 세포 환경에 미치는 영향을 연구하기 위해 비 알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 관련 간세포 암종 (HCC) 제브라 피쉬 모델을 생성하는 방법을 제시합니다.

초록

간암은 현재 전 세계적으로 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인이며 간세포 암종 (HCC)은 모든 간암 사례의 75-90 %를 차지합니다. B/C형 간염을 예방하고 치료하기 위한 효과적인 치료법이 도입됨에 따라 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)과 비알코올성 지방간염(NASH)으로 알려진 보다 공격적인 형태가 현대 사회에서 간세포 암종 발병의 가장 큰 위험 요소가 되고 있습니다. NASH가 HCC 개발에 미치는 역할을 더 잘 이해하기 위해 우리는 NASH 관련 HCC 제브라 피쉬를 설계했습니다. 제브라 피쉬 유충의 광학적 선명도와 유전 적 다루기 성은 비 침습적 형광 라이브 이미징을 사용하여 간 미세 환경과 면역 세포 구성을 연구하는 매력적이고 강력한 모델입니다. 이 프로토콜은 NASH 관련 간세포 암종 제브라 피쉬 모델을 사용하여 간 미세 환경에서 콜레스테롤 과잉의 영향과 질병의 초기 단계에서 면역 세포 구성에 미치는 영향을 조사하는 방법을 설명합니다. 첫째, 우리는 NASH 관련 간세포 모델을 개발하기 위해 8 일 동안 간세포 특이 적 활성화 베타 카테닌을 발현하는 간세포 특이 적 활성화 베타 카테닌을 발현하는 간세포 암종 유충 (s704Tg)을 10 % 고 콜레스테롤식이 요법으로 공급합니다. 여기에서는 간 영역, 세포 및 핵 형태(간세포 영역, 핵 영역, 핵:세포질 비율(N:C 비율), 핵 원형도, 소핵/핵 탈장 점수) 및 혈관신생과 같은 비침습적 컨포칼 현미경으로 간의 여러 초기 악성 종양 특징을 평가하기 위해 다양한 형질전환 라인을 사용하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 태그가 달린 면역 세포 (호중구, 대 식세포 및 T 세포)가있는 형질 전환 라인을 사용하여 NASH 관련 간세포 암종 유충에서 간 면역 세포 구성을 분석하는 방법을 보여줍니다. 설명 된 기술은 초기 간 세포 형성 단계에서 간 미세 환경 및 면역 세포 구성을 평가하는 데 유용하지만 다른 간 질환 모델에서 이러한 기능을 연구하도록 수정할 수도 있습니다.

서문

간세포 암종 (HCC)은 치료 옵션이 제한된 공격적인 암입니다. 모든 간세포 암종 환자의 30 % 이상이 비만이며 NAFLD 1,2,3,4의 공격적인 형태 인 NASH를 가지고있는 것으로 밝혀졌습니다. 칼로리가 풍부한 식단을 섭취하면 지방산 가용성이 급격히 증가하여 국소 및 전신 대사 변화를 유발하고 지방증, 간세포 손상, 염증 및 섬유증을 유발합니다. 간세포 암종으로의 NASH 진행은 간에서 지질의 축적을 수반하며, 이는 염증을 유발하고 면역 세포 구성을 변화시킵니다 ^5,6,7. 간 미세 환경과 면역 세포 환경이 간 질환 진행 중에 어떻게 변하는지, 그리고 특정 병인으로 인해 어떻게 변하는 지 이해하는 것이 특히 흥미롭고 중요합니다. 콜레스테롤 과잉이 간 미세 환경과 면역 세포 환경에 미치는 영향을 더 잘 식별하기 위해 우리는 NASH 관련 간세포 암종의 독특한 제브라 피쉬 모델을 개발했습니다. 이 모델을 사용함으로써식이 요법과 영양 과잉이 간 미세 환경과 간 질환 진행에 미치는 영향을 더 잘 이해할 수있었습니다.

마우스 및 인간 조직 샘플과 같은 포유동물 모델은 지방간염 및 지방증의 발병기전을 이해하는 데 필수적^{이었습니다8.} 마우스는 간 질환 및 암에 선호되는 모델이지만 세포 수준에서 광학 선명도가 부족한 반면 인간 조직 샘플은 종종 동물 모델이 모방 할 수있는 3D 환경이 부족합니다. 이러한 장애물로 인해 Zebrafish는 연구 커뮤니티에서 강력한 모델이되었습니다. 제브라 피쉬는 적어도 70 %의 유전자 보존으로 인간과 현저한 유사성을 가지고 있습니다. 그들은 간 미세 환경, 간 세포 구성, 기능, 신호 및 부상에 대한 반응을 유지합니다 ^9,10. HCC의 확립된 형질전환 제브라피쉬 모델과 함께 고콜레스테롤 식단(HCD)을 사용하여 NASH 관련 간세포암종의 제브라피쉬 모델을 개발했습니다.

여기에서는 NASH 관련 HCC 제브라피쉬 모델을 생성하는 방법과 간 미세 환경을 연구하고 생체 내에서 초기 악성 종양 특징을 해결하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 형광 태그가 부착된 간세포막 및 핵이 있는 제브라피쉬 형질전환 라인과 함께 비침습적 컨포칼 현미경을 사용하여 간 형태(면적, 부피 및 표면적), 세포 및 핵 형태(간세포 면적, 핵 면적, N:C 비율, 핵 원형도, 소핵/핵 탈장 점수) 및 혈관신생(혈관 밀도)을 분석하여 초기 악성 종양 특징을 해결할 수 있습니다. 면역 세포 미세 환경은 또한 간 세포 형성^11,12,13,14에 중요한 특징이므로 태그가 지정된 면역 세포 (호중구^, 대 식세포 및 T 세포)가있는 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 사용하여 NASH 관련 간세포 암종 유충에서 간 면역 세포 구성을 분석하는 방법도 보여줍니다. 기술된 기술은 모델에 고유하고 간 질환 진행에서 간 미세환경 및 면역 세포 조성물을 평가하는데 매우 유용하다.

프로토콜

동물 연구는 알버트 아인슈타인 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 한 절차에 따라 수행됩니다. 프로토콜에 사용된 완충액 및 용액에 대한 레시피는 보충 표 1을 참조하십시오.

1. 급성 콜레스테롤 과잉을위한 10 % 콜레스테롤 풍부식이 요법 준비.

1. 두 개의 25mL 유리 비커에 2 x 4g의 골든 펄 다이어트 5-50nm 활성 구체(GPAS)의 무게를 측정합니다(하나는 일반 다이어트(ND)용이고 다른 하나는 10% 고콜레스테롤 다이어트(HCD)용).
   참고 : 제브라 피쉬 유충을위한 모든 상업용 건조 식품 식단을 사용할 수 있습니다.
2. 10mL 유리 비커에 0.4g의 콜레스테롤을 계량합니다. 비커를 호일로 덮으십시오.
3. 20g 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 5mL의 디에틸 에테르를 측정합니다. 다음으로 ND 비커에 디 에틸 에테르를 넣고 주걱을 사용하여 즉시 건조 식품과 혼합합니다.
   주의: 디에틸 에테르는 눈, 피부 및 호흡기 자극을 유발합니다. 화학 흄 후드에서만 사용하십시오.
4. 20G 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 5mL의 디에틸 에테르를 다시 측정하고 콜레스테롤이 든 10mL 비커에 넣고 주사기로 즉시 위아래로 흡인하여 혼합합니다.
5. 콜레스테롤 용액을 HCD 비커에 빠르게 넣고 용액이 균일해질 때까지 주걱으로 즉시 혼합하십시오.
6. 다이에틸 에테르를 완전히 증발시키기 위해 최대 24시간 동안 후드에 비커를 두십시오. 다음날, 유봉과 박격포를 사용하여 GPAS 다이어트를 미세 입자로 분쇄하십시오.
   알림: 식단을 분쇄하는 것은 중요한 단계이며, 유충은 50nm보다 큰 입자를 먹을 수 없습니다.
7. 각 식단을 라벨이 붙은 작은 비닐 봉지 또는 50mL 원심분리 튜브에 옮기고 -20°C에서 보관합니다.

2. 콜레스테롤이 풍부한식이 요법을 먹이는 단기 유충으로 NASH 유도 - 정적 조건.

1. -1 일에 형질 전환 물고기 라인을 설정하십시오 (표 1). 다음날 아침 (0 일차), 물고기가 산란 한 후 메쉬 스트레이너에 알을 모으십시오.
2. 배아 물 (E3)이 담긴 세척 병을 사용하여 계란을 철저히 헹구고 조심스럽게 계란을 E3 배지가있는 10cm 페트리 접시에 옮깁니다.
3. 죽은 알이나 수정되지 않은 알을 포함하여 번식 상자에 쌓였을 수있는 모든 파편의 판을 청소하십시오.
   알림: 계란을 헹구고 접시를 청소하는 것은 미생물의 통제되지 않은 성장과 그에 따른 유충 발달 결함을 방지하는 데 중요합니다.
4. 계란을 10cm 페트리 접시 당 70/80의 밀도로 나눕니다 (E3 25mL). 1 일째에, 조명베이스가 장착 된 해부 스코프에서 죽은 배아 또는 발달 결함이있는 배아를 확인하고 청소하십시오.
   참고: 투과 베이스 암시야 모드를 사용하여 발달 효과가 있는 배아를 식별하고 플레이트에서 미생물의 성장을 확인합니다. 시설마다 시스템에서 미생물 수확량이 다릅니다. 부정적인 영향을 피하기 위해 필요한 경우 E3 매체 및/또는 접시를 변경하십시오.
5. 5 일째에 모든 접시의 유충을 15cm 페트리 접시에 넣고 메틸렌 블루없이 E3를 첨가하십시오. 다음으로, 유충을 다음과 같이 먹이 상자에 나눕니다 (표 2).
   알림: 통제 조건에서 전신 만성 염증을 유발하지 않고 건강한 유충을 생성하려면 유충에게 하루에 유충 당 약 0.1mg의 음식을 먹여야합니다. 음식의 총량 (표 2)은 하루에 두 번 먹이로 균등하게 나뉩니다.
6. 유충을 28°C의 인큐베이터에 암광 주기(예: 14시간 빛/10시간 다크 주기)로 보관하고 5일에서 12일까지 하루에 두 번 유충에게 먹이를 줍니다.
7. 1mL 피펫 팁에 부착 된 진공 시스템을 사용하여 음식물 찌꺼기와 배지의 90-95 %를 매일 흡인합니다. 다음으로 유충의 손상을 피하기 위해 메틸렌 블루가없는 새로운 E3를 먹이 상자의 한쪽 모서리에 조심스럽게 붓습니다.
   알림: 먹이 상자를 매일 청소하는 것은 미생물의 통제되지 않은 성장을 방지하는 데 중요합니다.

3. 먹이 상자에서 수정 후 13 일 유충 수집.

1. 13 일째에 설정된 실험 조건의 수에 따라 수집 요리를 준비하십시오. 영구 마커 펜을 사용하여 샘플 전환을 피하기 위해 접시 측면 (뚜껑 및 바닥)에 표시를하십시오 (예 : 일반 다이어트 (ND) 용 검은 색 줄무늬 1 개와 HCD 용 검은 색 줄무늬 2 개).
2. 각 접시의 바닥을 덮을 수 있도록 메틸렌 블루없이 충분한 E3를 붓습니다. 조심스럽게 진공 시스템을 사용하여 먹이 상자에서 물을 흡입하고, 바닥에서 파편이나 죽은 유충을 흡인하여 이러한 물질을 수집 접시로 옮기지 않도록하십시오.
3. 수위가 낮아지기 시작하면 먹이 상자를 천천히 들어 올려 유충이 모서리 중 하나로 수영 한 다음 반대 방향으로 흡인합니다.
   알림: 물을 흡입할 때 다른 직경을 허용하기 위해 절단 팁이 있는 1mL 피펫을 다른 높이로 사용하십시오. 다른 크기를 번갈아 가며 더 큰 직경으로 시작하여 물의 양이 감소하고 유충 밀도가 증가함에 따라 더 작은 직경으로 변경하십시오.
4. 액체가 약 20-30mL 밖에 없으면 유충을 1 단계에서 준비한 수집 페트리 접시에 조심스럽게 따라 내립니다. 먹이 상자에서 라벨이 붙은 테이프를 접시 뚜껑에 놓습니다.
5. 모든 급지 상자에 대해 3.2-3.4 단계를 반복하십시오.

4. 식이 유발 간 지방증에 대한 대조 분석 - 오일 레드 O (ORO) 염색, 이미징 및 스코어링.

1. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 15-20마리의 유충을 2mL 둥근 바닥 튜브에 옮기고 약 15-30분 동안 얼음 위에 놓습니다. 튜브에서 대부분의 미디어를 제거합니다.
2. 유충을 고정하기 위해 4% 파라포름알데히드(PFA) 2mL를 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
3. 다음날 아침, 4 % PFA 용액을 제거하고 2mL의 1x PBS로 유충을 3 회 세척하십시오.
4. 하나의 메쉬 웰 인서트로 조건당 12웰 플레이트(그림 2A)를 준비합니다.
5. 유리 피펫을 사용하여 유충을 2mL 튜브에서 이전에 웰에 놓인 삽입물로 옮기고 1x PBS 5mL를 추가합니다. 염색 후 샘플 보관을 위해 2mL 튜브를 보관하십시오.
   주의 :이 단계에서 유충은 매우 끈적 거리며 플라스틱 피펫을 사용하지 마십시오.
6. 유충과 함께 삽입물을 60% 이소프로판올 용액 5mL를 사용하여 다른 웰로 옮깁니다. 유충을 30 분 실온 (RT) 동안 배양하십시오.
7. 한편, 60 % 이소프로판올 용액에서 0.3 % 오일 레드 O를 준비하십시오. 0.45 μm 주사기 필터를 사용하여 0.3% Oil Red 용액을 2회 여과한다.
   알림: 이소프로판올에 0.5% 오일 레드 O 3mL를 증류수 2mL와 혼합하여 웰당 5mL의 용액을 준비합니다. 60 % 이소프로판올 용액의 0.3 % 오일 레드 O는 새로 준비해야합니다.
8. 다음으로, 유충이있는 메쉬 삽입물을 60 % 이소프로판올 용액에 새로 만든 0.3 % 오일 레드 O 5mL를 사용하여 다른 웰로 옮깁니다. 부드러운 흔들림으로 RT에서 3 시간 동안 배양 된 유충.
9. ORO 염색 후, 60 % 이소프로판올로 다른 웰에 삽입물을 옮겨 유충을 헹구십시오. 유충을 60% 이소프로판올로 30분 동안 매번 60% 이소프로판올로 두 번 세척하고 삽입물을 60% 이소프로판올이 있는 웰로 순차적으로 옮깁니다.
10. 삽입물을 1x PBS-0.1% 트윈으로 웰에 순차적으로 옮겨 1x PBS-0.1% 트윈에서 5분 동안 유충을 3회 세척합니다.
11. 유충을 2mL 튜브로 옮깁니다. PBST를 제거하고 1mL의 80% 글리세롤을 추가하고 이미징이 나타날 때까지 4°C에서 보관합니다.
12. 더 나은 이미징을 위해 유충을 1x PBS-0.1% 트윈으로 옮기고 해부 범위 아래에서 두 개의 #55 집게를 사용하여 조직을 조심스럽게 당겨 간을 해부합니다.
    참고: 캐스퍼를 사용하는 경우 배경 이미징은 전체 유충을 사용하여 수행할 수 있습니다.
13. 유리 피펫을 사용하여 간을 50 % 글리세롤이 함유 된 도자기 스팟 플레이트의 우물로 조심스럽게 옮깁니다. 유충을 조작하기 위해 작은 도구를 사용하여 간을 배치합니다(예: 속눈썹 도구 - 그림 2B). 컬러 카메라가 장착 된 실체 현미경의 이미지 간.
14. 간 지방증 점수 (ORO 염색 없음 = 없음, 밝은 빨간색 ORO 염색 = 경증, 빨간색-진한 빨간색 ORO 염색 = 중간 / 중증).

5. 성장 및 이미징을위한 제브라 피쉬 상처 및 포착 장치 (zWEDGI)를 사용한 비 침습적 컨포칼 이미징.

1. 바닥을 덮을만큼 15-20mL의 1x Tricaine-E3로 10cm 페트리 접시를 준비하십시오.
   참고: 1x 트리카인-E3 작업 용액(0.16mg/mL)은 25x 트리카인 스톡 용액(48mg/mL)을 48mL의 E3에 희석하여 얻을 수 있습니다. 트리카인 농도는 유충이 이 발달 단계에서 마취에 매우 민감하기 때문에 0.16mg/mL를 초과해서는 안 됩니다.
2. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 15-20 마리의 유충을 1x Tricaine-E3가 들어있는 페트리 접시에 옮기고 유충을 5 분 동안 마취시킵니다.
3. 웰당 메틸렌 블루가 없는 2-3mL의 E3가 있는 6웰 플레이트를 준비합니다.
4. 형광 실체 현미경 상에서, 원하는 형광 마커에 대해 마취된 유충을 스크리닝합니다(표 1). 선별된 유충을 E3에서 최소량의 트리카인으로 옮기고 이미지화할 시간이 될 때까지 6웰 플레이트에서 회복되도록 합니다.
   참고: 이중, 삼중 및 사중 형질전환 유충의 스크리닝에는 시간이 걸리고 유충을 E3에 배치하고 트리카인에 대한 불필요한 노출을 줄이기 위해 6웰 플레이트에서 배지를 자주 변경합니다. 또한이 발달 단계의 유충은 떠 다니므로 속눈썹 도구를 사용하여 조직 손상을 유발하지 않고 선별 할 수 있도록 유충을 배치합니다.
5. 스크리닝 후 25mL의 1x Tricaine-E3로 10cm 페트리 접시를 준비합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 15-20 마리의 유충을 1x Tricaine-E3가 들어있는 페트리 접시에 옮기고 유충을 5 분 동안 마취시킵니다.
6. 한편, 실체 현미경으로 1x Tricaine-E3를 상처 및 포착 장치 (예 : zWEDGI)의 챔버에 추가합니다 ^15,16. P200 마이크로피펫을 사용하여 챔버와 억제 터널에서 기포를 제거합니다. 초과분에 1x Tricaine-E3를 모두 제거하여 챔버를 채우기에 충분한 양만 남겨 둡니다.
7. 마취 된 유충을 zWGGI의 로딩 챔버로 옮기고 실체 현미경 아래의 속눈썹 도구를 사용하여 배치합니다. 부드럽게 유충의 머리를 두드리고 꼬리가 구속 터널에 들어가도록 밀어 넣으십시오. 또한 마이크로 피펫을 사용하여 상처 챔버에서 1x Tricaine-E3를 제거하여 유충이 터널로 들어갈 수 있도록합니다. 유충이 왼쪽 엽의 이미징을 위해 적절하게 배치되었는지 확인하십시오 - 도립 현미경: 왼쪽이 아래를 향하고 있습니다. 직립 현미경: 왼쪽이 위를 향하고 있습니다.
   알림: zWEDGI를 사용할 수 없는 경우 물고기를 1x Tricaine-E3의 1% 저융점 아가로스에 장착하고 배치할 수 있지만 빠른 이미징(최대 15분)을 위해서만 아가로스 침지를 사용할 수 있습니다.
8. 간세포 및 핵 형태 분석을 위해 40x 공기 대물렌즈와 2μm 광학 섹션의 z-스택을 사용하여 컨포칼 현미경으로 간을 이미지화합니다. 간 형태학, 혈관신생 및 면역 세포 모집 분석을 위해 20x 공기 대물렌즈와 5μm 광학 섹션의 z-스택을 사용하여 간 이미지를 제공합니다. 간이 큰 유충의 경우 모든 간과 주변 영역의 이미징을 보장하기 위해 2 x 2 타일 이미지를 75μm로 촬영해야합니다.
9. 이미징 후 1x Tricaine-E3가 포함 된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 억제 터널에서 유충을 끌어 내고 메틸렌 블루가없는 E3가있는 페트리 접시로 옮깁니다.

6. 간 형태 학적 변이 분석.

알림: 아래 나열된 단계는 간 표면적 및 부피 정량화를 위해 수행됩니다.

1. 이미징 소프트웨어를 엽니다. 분석할 이미지 파일이 포함된 폴더를 아레나 에 추가하고 폴더 관찰 아이콘을 선택합니다. 그런 다음 썸네일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 기본 Imaris 파일 형식으로 변환을 선택하여 파일을 형식(.ims)으로 변환합니다.
2. Surpass 하위 메뉴에서 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다. 다음으로, 파란색 새 표면 추가 버튼을 클릭하여 간에서 표면을 만듭니다.
3. 다음으로, 표면 생성 패널에서 관심 영역만 세그먼트화를 선택하여 간 표면을 수동으로 만듭니다.
4. 자동 생성 | 건너뛰기를 클릭합니다. 수동으로 편집 옵션을 선택합니다. 윤곽선을 선택하고 장면 패널에서 "볼륨"옵션을 선택 취소하십시오.
   참고: 볼륨 보기 옵션을 선택 해제해야 하며, 그렇지 않으면 다른 z-스택에서 관심 영역을 선택할 수 없습니다.
5. z-stacks를 탐색하고 모드를 선택하여 각 평면에서 관심 영역을 그리고 원하는 그리기 모드를 선택합니다. 그리기를 시작하려면 포인터를 탐색이 아닌 선택 모드로 변경하고 그리기를 클릭 한 다음 간을 통해 포인터를 드래그하여 ROI를 그립니다.
6. 다른 초점면에서 ROI를 선택한 후 표면 만들기를 선택하여 선택한 모든 ROI를 병합하고 간 표면을 만듭니다.
7. 다음으로, 새로 생성 된 표면을 사용하여 간세포 신호의 마스크를 만듭니다. 표면을 클릭하고 편집 탭(연필) 아래에서 모두 마스크를 선택합니다. 나타나는 창에서 간 부피와 표면적을 정량화하는 데 사용할 마스킹하려는 채널을 선택하십시오. 그런 다음 표면 외부 복셀을 0으로 설정하고 마스크를 적용하기 전에 채널 복제 옵션을 선택합니다.
8. 분석을 위해 통계 분석 메뉴의 간 표면적과 간 부피 값을 사용하십시오.

알림: 간 영역 정량화를 위해 다음 단계를 수행하십시오.

9. 피지 소프트웨어를 엽니다. 플러그인 메뉴에서 바이오 형식을 선택한 다음 바이오 형식 가져 오기를 선택하고 채널 분할 옵션을 선택하여 이미지 파일을 엽니 다.
10. 이미지 메뉴에서 속성을 선택하여 이미지의 픽셀 크기와 복셀 깊이가 올바른지 확인합니다(올바른 값이 아닌 경우). 그런 다음 이미지 메뉴로 이동하여 조정을 클릭 한 다음 밝기 및 대비를 클릭하고 이미지 밝기와 대비를 조정합니다.
11. 다음으로, 간세포 채널을 사용하여 간장의 최대 강도 투영을 만듭니다. 이미지 메뉴로 이동하여 스택을 클릭 한 다음 Z 프로젝트를 클릭하십시오. 최대 강도 투영을 선택합니다.
12. 자유형 선택 도구를 사용하여 유충 간을 둘러싼 관심 영역(ROI)을 수동으로 만듭니다. 그런 다음 분석 메뉴에서 측정을 클릭하여 간 영역을 얻습니다. 추가 분석을 위해 결과를 스프레드시트로 저장합니다.

7. 간세포 및 핵 형태 학적 분석.

1. 피지 소프트웨어를 엽니다. 플러그인 메뉴에서 바이오 형식을 선택한 다음 바이오 형식 가져 오기 틱 채널 분할 옵션을 선택하여 이미지 파일을 엽니 다.
2. 이미지 메뉴에서 속성을 선택하여 이미지의 픽셀 크기와 복셀 깊이가 올바른지 확인합니다(올바른 값이 아닌 경우). 그런 다음 이미지 메뉴로 이동하여 조정을 클릭 한 다음 밝기 및 대비를 클릭하고 이미지 밝기와 대비를 조정합니다.
3. 분석 메뉴에서 분석하려는 모든 매개변수(예: 면적, 둘레 및 모양 설명자)에 대해 측정 설정 체크 표시를 선택합니다. 간세포 막 형광 채널을 선택하십시오. Z를 탐색하면서 자유형 선택 도구를 사용하여 하나의 간세포 주위에 완벽한 ROI를 그립니다. 그런 다음 분석 메뉴에서 측정을 클릭하여 간세포 면적을 계산합니다.
4. 15-30 개의 간세포에 대해 7.3 단계를 반복하십시오. 추가 분석을 위해 결과를 스프레드시트로 저장합니다.
5. 다음으로, 핵 형광 채널을 선택하십시오. Z를 탐색하면서 자유형 선택 도구를 사용하여 간세포 핵 주위에 완벽한 ROI를 그립니다. 다음으로 분석 메뉴에서 측정을 클릭하여 핵 면적과 순환도를 계산합니다.
6. 15-30 개의 간세포에 대해 7.5 단계를 반복하십시오. 핵:세포질 비율의 정량화를 포함한 추가 분석을 위해 결과를 스프레드시트로 저장합니다.
7. 다음과 같이 소핵 및 탈장의 존재에 대한 샘플을 채점합니다(표 3).

8. 혈관 신생 분석.

1. 이 프로토콜의 섹션 6에 설명된 대로 간 표면을 수동으로 만듭니다. 이 표면의 이름을 "간 표면"으로 지정합니다.
2. 간 내부의 내피 세포 신호에 대한 마스크를 만듭니다. 표면을 클릭하고 편집 탭(연필) 아래에서 모두 마스크를 선택합니다. 나타나는 창에서 내피 세포 채널을 선택하여 간에서 혈관 신호를 분리합니다. 표면 외부 복셀 설정을 선택하고 마스크를 적용하기 전에 채널 복제 옵션을 선택합니다.
3. 새로운 내피 세포 마스킹 채널의 이름을 간 혈관계로 바꿉니다.
4. 용기 부피와 표면적을 측정하려면 두 번째 표면을 만듭니다. 파란색 새 서피스 추가 버튼을 클릭합니다. 지표면 작성의 첫 번째 단계에서 지표면을 자동으로 작성하도록 모든 옵션이 선택 취소되어 있는지 확인합니다.
5. 두 번째 단계에서는 간 혈관 채널을 선택하여 표면을 만듭니다. 스무딩 옵션을 선택 취소하여 선박에서 가능한 한 많은 세부 정보를 감지하고 임계값 옵션에서 배경 빼기를 활성화합니다.
6. 감지된 표면이 간 혈관 신호와 함께 국소화되도록 임계값을 조정합니다. 통계 분석 메뉴의 표면적과 부피 값을 사용합니다. 다음 방정식을 사용하여 용기 밀도 지수를 계산합니다.
   혈관 밀도 지수 (간 μm 2 기준) = (혈관 표면적 (μm 2)) / (간 표면적 (μm²))
   혈관 밀도 지수 (간 μm 3 기준) = (혈관 부피 (μm 3)) / (간 부피 (μm³))

9. 면역 세포 모집 분석.

1. 피지 소프트웨어를 엽니다. 플러그인 메뉴에서 바이오 형식을 선택한 다음 바이오 형식 가져 오기 틱 채널 분할 옵션을 선택하여 이미지 파일을 엽니 다.
2. 이미지 메뉴에서 속성을 선택하여 이미지의 픽셀 크기와 복셀 깊이가 올바른지 확인합니다(올바른 값이 아닌 경우). 그런 다음 이미지 메뉴로 이동하여 조정을 클릭 한 다음 밝기 및 대비를 클릭하고 이미지 밝기 및 대비를 조정합니다 (예 : 대 식세포 - mCherry 또는 d토마토, 호중구 - BFP; T 세포 - EGFP; 간세포 - EGFP 또는 엠 체리).
3. 다음으로 각 채널에 대한 최대 강도 투영을 만듭니다.
4. 섹션 6 (6.9-6.12 단계)에 설명 된대로 유충 간을 둘러싼 ROI를 만들고 간 영역을 측정합니다. 간 영역과 75μm 주변 영역 ( "모집 영역")을 포함하는 두 번째 ROI를 만듭니다.
5. 그런 다음 편집 메뉴에서 선택 옵션을 선택한 다음 관리자에 추가를 선택합니다. 선천성 면역 세포 채널 최대 강도 투영을 선택하고 ROI 관리자 창에서 간 ROI를 클릭하여 모집 영역을 설정합니다.
6. 플러그인 메뉴에서 분석 옵션을 선택한 다음 세포 카운터를 선택하고 모집 영역 내의 면역 세포를 계산합니다. 간 영역에 모집 된 면역 세포의 수를 스프레드 시트에 기록하십시오.
7. 간 영역당 면역 세포 수를 정규화하여 호중구, 대식세포 및 T 세포 밀도를 계산합니다.

결과

간세포 특이적 구성 활성 형태의 베타-카테닌(s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)¹⁷을 참조하면, NASH 관련 간세포암종의 비포유류 척추동물 모델을 만들 수 있다. 간 질환 진행은 간 지방증, 간 크기, 간세포, 핵 형태, 혈관 신생 및 면역 세포 침윤을 측정하여 조기에 모니터링 할 수 있습니다 (그림 1).

정상적인 식단을 먹인 HCC 유충은 Oil Red O 염색으로 측정한 경미한 간 지방증에 대해 전혀 나타나지 않았습니다. 그러나 고 콜레스테롤식이 요법을 먹인 HCC 유충은 간 지방증이 크게 증가한 것으로 나타났습니다 (그림 2).

간 질환의 잘 알려진 마커는 간 비대¹⁷입니다. 간 크기를 평가하기 위해 간세포 암종 유충은 Tg (fabp10a : H2BmCherry)와 같은 간세포에서 형광 마커를 특이 적으로 발현하는 형질 전환 라인으로 교차 될 수 있습니다. 간 비대를 평가하기 위해 간 면적 (2D), 간 표면적 및 간 부피 (3D)의 평가가 수행됩니다. 콜레스테롤 과잉에 노출 된 지 8 일 후, 간세포 암종 유충에서 간 확대가 관찰되었습니다 (그림 3).

비침습적 라이브 이미징을 사용하여 간세포 막(예: Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) 및 간세포 핵(예: Tg(Fabp10a:H2B-mCherry))에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 어선을 사용하여 간세포의 악성과 관련된 세포 및 핵 형태 변화를 평가할 수 있습니다. 간세포 면적은 NASH 관련 간세포 (그림 4A, B, D)뿐만 아니라 핵 면적 (그림 4C, E) 및 핵 : 세포질 비율 (그림 4F)에서 증가했다. 핵 순환성의 현저한 감소는 HCD + HCC 그룹에서도 관찰되었습니다 (그림 4G). 지방 독성은 소핵이있는 상태에서 발암의 특징 인 DNA 손상을 유발합니다. H2B-mCherry 마커를 사용하여 우리는 고 콜레스테롤식이 요법을 먹인 간세포 암종 유충에서 소핵의 더 큰 발생률을 관찰했습니다 (그림 4H).

간 혈관계는 혈관구조에 라벨을 붙이는 Tg (kdrl : mCherry 또는 Tg (fli : EGFP)와 같은 트랜스 제닉 태그 라인을 사용하여 제브라 피쉬 모델에서 쉽게 평가할 수 있습니다. HCC + HCD 유충에서 혈관 밀도의 상당한 증가가 관찰되었습니다 (그림 5).

NASH 관련 간세포 암종에서 초기에 유발 된 염증 반응을 관찰하기 위해, Tg (mfap4 : tdTomato-CAAX; lyz : BFP)와 같은 대 식세포 및 호중구에서 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 어류 계통이 HCC 형질 전환 계통과 교차되었다. 호중구 및 대식세포의 침윤은 HCD가 공급된 간세포 암종 및 간세포 모두에서 발생하며, 이는 간 및 주변(주변 면적 최대 75μm)에서 호중구/대식세포의 수 및 밀도를 정량화하여 평가되었습니다(그림 6A-H). 그럼에도 불구하고 HCC+HCD는 호중구 수와 밀도가 크게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 6F-H). 수정 후 13 일이 지나면 적응 면역 체계가 이미 기능합니다. T-Cells에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 피쉬 라인을 Tg(lck:EGFP)와 같이 사용하고, HCC 형질전환 라인과 조합하여; 우리는 콜레스테롤 과잉이 T 세포의 간으로의 모집에 미치는 영향을 평가했다. HCD를 먹인 HCC 유충에서 T 세포 밀도와 전체 수의 현저한 감소가 관찰되었습니다 (그림 6I-K).

트랜스 제브라 피쉬 라인	ZFIN 참조	시험
캐스퍼	로이A9; 미트파W2	간 발점증
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:금성 / fabp10a:H2B-m체리 )	s704Tg / uwm41Tg	간 형태학
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)	s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg	간세포와 핵 형태
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)	s704Tg / y1Tg	혈관 신생
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:금성;  mfap4 : 토마토 - CAAX; lyzC:BFP)	s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg	대식세포와 호중구 모집
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)	s704Tg / cz1Tg	T 세포 모집

표 1: 다양한 분석에 사용하기 위한 형질전환 제브라피쉬 라인.

유충의 수	급지 상자 크기	하루 음식의 양 (mg)	E3 용량 (밀리리터)
30-40	작은 번식 상자	3-4	200
60-80	작은/큰 번식 상자	6-8	400
100-150	큰 번식 상자	10-15	500

표 2 : 급지 상자의 조건을 설정합니다.

표현형	채점 방법
없음	정상 핵, 소핵 또는 탈장 없음
심하지 않음	적은 수의 소핵(시야당 5개 미만) 및/또는 탈장
보통/중증	중등도에서 높은 수의 소핵(시야당 5개 이상) 및/또는 탈장

표 3 : 소핵 및 핵 탈출증 점수.

그림 1: 주요 실험 단계와 분석 접근 방식을 요약한 프로토콜 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 간 지방증에 대한 대조 분석 - ORO 염색. HCC 유충에 정상 또는 고 콜레스테롤 식단을 공급하고 간 지방증을 평가하기 위해 Oil Red O (ORO) 염색을 수행했습니다. (a) 메쉬 웰 삽입물을 이용하여 순차적 ORO 염색을 수행하는 12웰 플레이트의 다이어그램. (B) 유충을 조작하는 데 사용되는 속눈썹 도구의 이미지. (c) 오일 레드로 염색된 간의 대표 이미지; 간세포 암종 및 HCC + HCD 유충. (D) 간 지방증의 상이한 스코어링을 갖는 유충의 백분율을 보여주는 카이-제곱 그래프. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 간 크기의 대표 이미지. 간 마커(Tg(fabp10a:H2B-mCherry))를 발현하는 형질전환 간세포 암종 유충을 zWEDGI를 사용하여 도립 회전 디스크 컨포칼 현미경에서 라이브 및 비침습적으로 이미지화했습니다. (A) HCC 및 HCC + HCD 유충에서 간의 대표적인 3D 재구성. (B-D) HCC 및 HCC + HCD 유충의 간 면적 (B) 간 표면적 (C) 및 간 부피 (D)를 포함한 간 형태 학적 변화를 보여주는 그래프. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 간세포와 핵 형태의 대표 이미지. 간세포 막(Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) 및 간세포 핵(Tg(fabp10a:H2B-mCherry)에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 HCC 라인을 이미지화하였다. (A-C) HCC 및 HCC + HCD 유충의 F- 액틴 및 간세포 핵의 대표적인 3D 재구성. 열린 화살촉은 확대 된 핵을 보여줍니다. 흰색 화살촉은 모양이 변경된 핵을 보여줍니다. 빨간색 화살표는 소핵과 핵 탈출증을 나타냅니다. (디지) HCC 및 HCC + HCD 13 일 된 유충의 세포 및 핵 매개 변수의 평균을 보여주는 그래프. (D) 간세포 영역. (e) 원자력 지역. (F) 핵 : 세포질 비율. (G) 핵 순환성. 각 점은 유충 당 평균을 나타냅니다. 점도표는 평균 ±SEM(H) 카이제곱 그래프를 보여주며, 소핵과 핵 탈출증의 점수가 다른 유충의 백분율을 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 간 혈관계의 대표 이미지. 간세포 핵 (Tg (Fabp10a : H2B-mCherry) 및 내피 세포 (Tg) fli : EGFP))에서 형광 단백질을 발현하는 트랜스 제닉 HCC 라인). (A) HCC 및 HCC + HCD 유충에서 간 혈관계의 대표적인 3D 재구성. (B-C) HCC 및 HCC + HFCD 유충의 간 표면적 (B) 부피 (C)에 의한 혈관 밀도 지수를 보여주는 그래프. 점도는 평균 ±SEM을 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 간 면역 세포 풍경의 대표 이미지. 대식세포 및 호중구(Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) 또는 T 세포(Tg(lck-EGFP)에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 HCC 라인. (ᅡ, ᄃ, 금) 13일 된 간세포 암종 및 HCC+HCD 유충에서 간 및 간 영역에 대한 백혈구 모집의 대표적인 3D 재구성. (B) 이미징 된 간 영역의 다이어그램. (D-E) HCC 및 HCC + HCD 유충의 간 영역에서 대 식세포 밀도 (D)와 수 (E)를 보여주는 그래프. (지에이치) HCC 및 HCC + HCD 유충의 간 영역에서 호중구 밀도 (G)와 수 (H)를 보여주는 그래프. (G) HCC 및 HCC + HCD 유충의 간 영역에 대한 T 세포 모집의 대표적인 3D 재구성. (H-I) HCC 및 HCC + HCD 유충의 간 영역에서 T 세포 밀도 (H) 및 수 (I)를 보여주는 그래프. 점도는 평균 ±SEM을 보여줍니다. 스케일 바 = 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 버퍼 및 솔루션 표 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

간세포 암종, 특히 NASH 유발 간세포 암종의 발생률이 증가함에 따라 NASH 관련 간세포 암종과 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 연구하기 위해보다 효율적인 모델을 갖는 것이 매우 중요합니다. 간에서 세포-세포 상호 작용의 디콘볼루션은 간 질환 진행과 간세포 생성을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 이 프로토콜에 설명 된 접근법은 생체 내 및 비 침습적으로 간 질환 진행을 분석하는 독특한 방법을 제공합니다.

식이 준비는 NASH 관련 간세포 암종 모델을 성공적으로 확립하는 데 중요합니다. 제브라 피쉬를위한 식단을 준비하는 동안 유해한 영향을 피하기 위해 디 에틸 에테르가 흄 후드 내부에서 완전히 증발하도록하는 것이 중요합니다. 유충과 함께 이러한 식단을 사용하려면 (수정 후 5-12 일), 유충의 음식 섭취를 보장하기 위해 식단을 미세 입자로 분쇄하는 것이 매우 중요합니다. 형광 태그가 붙은 지방산 유사체의 사용은 유충의 음식 섭취를 평가하는 데 사용될 수 있습니다.

유충을 번식 상자에 넣고 먹이 절차를 시작하기 전에 다른 플레이트의 유충을 혼합하여 실험 샘플링을 균일화하는 것이 중요합니다. 이 단계는 Day 0에서 시작하는 다양한 미세 환경이 각 플레이트에서 촉진되고 염증 반응에 영향을 미칠 수 있기 때문에 중요합니다.

또 다른 중요한 단계는 유충을 세어 각 먹이 상자에 필요한 음식의 양을 아는 것입니다. 음식의 양이 각 상자에있는 유충의 수에 적합하지 않으면 두 가지 시나리오 중 하나가 발생합니다 : 1) 유충이 부족합니다. 2) 유충이 넘칠 것입니다. 부정확 한 수유는 간 미세 환경에 큰 영향을 미치는 염증과 같은 영양 실조 또는 영양 과잉과 관련된 건강에 해로운 상태로 이어질 것입니다. 부정확 한 먹이가 발생하면 유충이 움직임 문제를 보입니다. 이 발달 단계에서 유충은 집중적으로 수영해야하므로 운동 문제가 발견되면 유충은 건강에 해로운 조건 (영양 실조 또는 과다 섭취로 인한 독성 용량의 콜레스테롤에 노출)에서 자랐습니다. 이러한 이유로 수유 절차는 정상 및 콜레스테롤이 풍부한 식단 모두에 대해 엄격하게 통제되어야합니다. 일부 분석은 간 비대(간 크기)의 존재와 조직 및 장기, 특히 간 및 장의 염증(호중구 및 대식세포의 눈에 띄는 침윤 증가)을 포함하여 유충의 섭식 및 건강의 정확성을 신속하게 해결하기 위해 수행할 수 있습니다.

E3의 95 %를 매일 청소하고 교체하는 것은 먹이 상자에서 미생물의 성장을 줄이고 유충의 건강과 생존을 개선하는 데 중요합니다. 또는 유충을 독립형 랙 시스템에 배치 할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 60-80 마리의 유충을 3 리터 탱크에 넣으십시오. 흐름을 빠른 물방울 모드로 조정하고 유충에게 하루에 두 번 (AM 및 PM) 3-4mg을 먹이면서 물의 흐름을 최소 수준으로 유지하십시오. 각 탱크의 올바른 흐름을 보장하기 위해 정기적으로 물의 흐름을 점검해야합니다. 우리 실험실에서이 방법은 10 % HCD의 단기 공급으로 95-100 % 생존율을 제공합니다. 또한,이 방법은 설명 된 정적 공급 프로토콜에 필요한 일일 청소 및 물 교환에 내재 된 작업량을 크게 줄였습니다.

단기간에 NASH를 유도하기 위해 10% 콜레스테롤이 풍부한 식단을 사용했지만(5일이면 지방간염을 유발하기에 충분함), 과당 ¹⁸, 지방산(예: 팔미트산)¹⁹ 또는 4% 콜레스테롤이 풍부한 식단²⁰을 사용하여 확장할 수 있는 수유 프로토콜을 사용하도록 식단 변경 및 확장할 수 있습니다. 현재 간세포 암종에 대한 성공적인 치료 표적은 거의 없으며 NASH에 대한 표적은 없습니다. 제브라피쉬 모델의 사용은 간세포 형성에 대한 지식을 확장할 수 있는 독특한 기회를 제공할 뿐만 아니라 대규모 처리량의 약물 스크리닝을 수행할 수 있는 비평행 척추동물 시스템을 제공합니다. 이 프로토콜에 설명 된 기술은 간 질환 및 간 세포 형성에 대한 향후 발견 및 치료 표적을 용이하게 할 것입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	Easily degraded. Store -20°C.
Corning Netwells carrier kit 15 mm	Fisher	07-200-223
Corning Netwells inserts	Fisher	07-200-212
Diethyl ether	Fisher	60-046-380	Highly Volatile.
Dumont forceps #55 dumostar	Fisher	NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in	Fisher	22-183624
4% paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Science	15710
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres	Brine Shrimp Direct	-	Any commercial dry powder food for larvae can be used.
Graduated Transfer Pipets	Fisher	22-170-404
Isopropanol	Fisher	BP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack	Crystalgen	221-1422-10
Petri Dishes 100X20MM	Fisher	08-747D
Tricaine	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Oil Red O solution 0.5% isopropanol	Sigma	O1391-500ML
Tricaine	Sigma	A-5040
Tween 20	Fisher	BP337-500
Vactrap	VWR	76207-630	Vacuum system for larvae collection
Microscopes
Fluorescent Stereomicroscope	Leica	M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large
Spinning Disk Confocal Microscope	Nikon	Nikon CSU-W1
Stereomicroscope	Leica	S9i with transilluminated base
Software
Fiji	Open-source Java image processing program.
Imaris 9.6	Bitplane; Oxford Instruments.