Recupero avanzato dell'olio utilizzando una combinazione di biotensioattivi

Riepilogo

Illustriamo i metodi coinvolti nello screening e nell'identificazione dei microbi che producono biotensioattivi. Vengono inoltre presentati metodi per la caratterizzazione cromatografica e l'identificazione chimica dei biotensioattivi, determinando l'applicabilità industriale del biotensioattivo nel migliorare il recupero residuo dell'olio.

Abstract

I biotensioattivi sono composti tensioattivi in grado di ridurre la tensione superficiale tra due fasi di polarità diverse. I biotensioattivi stanno emergendo come alternative promettenti ai tensioattivi chimici a causa della minore tossicità, dell'elevata biodegradabilità, della compatibilità ambientale e della tolleranza a condizioni ambientali estreme. Qui illustriamo i metodi utilizzati per lo screening dei microbi in grado di produrre biotensioattivi. I microbi che producono biotensioattivi sono stati identificati utilizzando il collasso delle gocce, la diffusione dell'olio e i saggi dell'indice di emulsione. La produzione di biotensioattivi è stata convalidata determinando la riduzione della tensione superficiale del mezzo dovuta alla crescita dei membri microbici. Descriviamo anche i metodi coinvolti nella caratterizzazione e identificazione dei biotensioattivi. La cromatografia su strato sottile del biotensioattivo estratto seguita da colorazione differenziale delle piastre è stata eseguita per determinare la natura del biotensioattivo. LCMS, ¹H NMR e FT-IR sono stati utilizzati per identificare chimicamente il biotensioattivo. Illustriamo inoltre i metodi per valutare l'applicazione della combinazione di biotensioattivi prodotti per migliorare il recupero dell'olio residuo in una colonna di sabbia simulata.

Introduzione

I biotensioattivi sono le molecole anfipatiche tensioattive prodotte da microrganismi che hanno la capacità di ridurre la superficie e la tensione interfacciale tra due fasi¹. Un tipico biotensioattivo contiene una parte idrofila che di solito è composta da una porzione di zucchero o una catena peptidica o amminoacido idrofilo e una parte idrofobica costituita da una catena di acidi grassi saturi o insaturi². A causa della loro natura anfipatica, i biotensioattivi si assemblano all'interfaccia tra le due fasi e riducono la tensione interfacciale al confine, il che facilita la dispersione di una fase nell'altra ^1,3. Vari tipi di biotensioattivi che sono stati segnalati finora includono glicolipidi in cui i carboidrati sono legati agli acidi alifatici o idrossi-alifatici a catena lunga tramite legami estere (ad esempio, ramnolipidi, trealolipidi e soforolipidi), lipopeptidi in cui i lipidi sono attaccati a catene polipeptidiche (ad esempio, tensioattivi e lichenisina) e biotensioattivi polimerici che di solito sono composti da complessi polisaccaridici-proteici (ad esempio, emulsan, liposan, alasan e lipomannan)⁴. Altri tipi di biotensioattivi prodotti dai microrganismi includono acidi grassi, fosfolipidi, lipidi neutri e biotensioattivi particolati⁵. La classe di biotensioattivi più studiata è quella dei glicolipidi e tra questi la maggior parte degli studi sono stati riportati sui ramnolipidi⁶. I ramnolipidi contengono una o due molecole di ramnosio (che formano la parte idrofila) legate a una o due molecole di acido grasso a catena lunga (di solito acido idrossi-decanoico). I ramnolipidi sono glicolipidi primari riportati per primi da Pseudomonas aeruginosa⁷.

I biotensioattivi stanno guadagnando sempre più attenzione rispetto alle loro controparti chimiche a causa di varie proprietà uniche e distintive che offrono⁸. Questi includono maggiore specificità, minore tossicità, maggiore diversità, facilità di preparazione, maggiore biodegradabilità, migliore formazione di schiuma, compatibilità ambientale e attività in condizioni estreme⁹. La diversità strutturale dei biotensioattivi (Figura S1) è un altro vantaggio che dà loro un vantaggio rispetto alle controparti chimiche¹⁰. Sono generalmente più efficaci ed efficienti a concentrazioni più basse poiché la loro concentrazione critica di micelle (CMC) è di solito parecchie volte inferiore ai tensioattivi chimici¹¹. È stato segnalato che sono altamente termostabili (fino a 100 °C) e possono tollerare pH più elevati (fino a 9) e alte concentrazioni di sale (fino a 50 g/L)¹² offrono quindi diversi vantaggi nei processi industriali, che richiedono l'esposizione a condizioni estreme¹³. La biodegradabilità e la minore tossicità li rendono adatti per applicazioni ambientali come il biorisanamento. A causa dei vantaggi che offrono, hanno ricevuto maggiore attenzione in vari settori come l'industria alimentare, agricola, dei detergenti, cosmetica e petrolifera¹¹. I biotensioattivi hanno anche guadagnato molta attenzione nella bonifica del petrolio per la rimozione di contaminanti petroliferi e inquinanti tossici¹⁴.

Qui riportiamo la produzione, la caratterizzazione e l'applicazione di biotensioattivi prodotti da Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 e Paenibacillus sp. IITD108. I passaggi coinvolti nello screening, nella caratterizzazione e nell'applicazione di una combinazione di biotensioattivi per un migliore recupero dell'olio sono descritti nella Figura 1.

Figura 1: Un metodo per un migliore recupero dell'olio utilizzando una combinazione di biotensioattivi. Viene mostrato il flusso di lavoro graduale. Il lavoro è stato eseguito in quattro fasi. In primo luogo i ceppi microbici sono stati coltivati e sottoposti a screening per la produzione di biotensioattivi mediante vari saggi, che includevano il saggio di collasso delle gocce, il saggio di diffusione dell'olio, il saggio dell'indice di emulsione e la misurazione della tensione superficiale. Quindi, i biotensioattivi sono stati estratti dal brodo privo di cellule e la loro natura è stata identificata utilizzando la cromatografia a strato sottile e sono stati ulteriormente identificati utilizzando LCMS, NMR e FT-IR. Nella fase successiva, i biotensioattivi estratti sono stati miscelati insieme e il potenziale della miscela risultante per un migliore recupero dell'olio è stato determinato utilizzando la tecnica della colonna di sabbia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Lo screening di questi ceppi microbici per produrre biotensioattivi è stato effettuato mediante collasso delle gocce, diffusione dell'olio, saggio dell'indice di emulsione e determinazione della riduzione della tensione superficiale del mezzo privo di cellule a causa della crescita dei microbi. I biotensioattivi sono stati estratti, caratterizzati e identificati chimicamente da LCMS, ¹H NMR e FT-IR. Infine, è stata preparata una miscela di biotensioattivi prodotti da questi microbi ed è stata utilizzata per recuperare l'olio residuo in una colonna di sabbia simulata.

Il presente studio illustra solo i metodi coinvolti nello screening, nell'identificazione, nella caratterizzazione strutturale e nell'applicazione della combinazione di biotensioattivi per migliorare il recupero dell'olio residuo. Non fornisce una caratterizzazione funzionale dettagliata dei biotensioattivi prodotti dai ceppi microbici^15,16. Vari esperimenti come la determinazione critica delle micelle, l'analisi termogravimetrica, la bagnabilità superficiale e la biodegradabilità vengono eseguiti per la caratterizzazione funzionale dettagliata di qualsiasi biotensioattivo. Ma poiché questo documento è un documento di metodi, l'attenzione si concentra sullo screening, l'identificazione, la caratterizzazione strutturale e l'applicazione della combinazione di biotensioattivi per migliorare il recupero dell'olio residuo; questi esperimenti non sono stati inclusi in questo studio.

Protocollo

1. Crescita di ceppi microbici

1. Pesare 2 g di Luria Brodo in polvere e aggiungere a 50 ml di acqua distillata in un matraccio conico da 250 ml. Mescolare il contenuto fino a quando la polvere si dissolve completamente e portare il volume a 100 ml utilizzando acqua distillata.
2. Allo stesso modo, preparare altri due palloni da 100 ml di brodo di Luria e posizionare tappi di cotone sul collo dei palloni.
3. Coprire i tappi di cotone con un foglio di alluminio e autoclave i palloni per 15 minuti a 121 °C e 15 psi per sterilizzare il supporto.
4. Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare il fluido a temperatura ambiente.
5. Per la preparazione della coltura primaria di un ceppo, prelevare una singola colonia da una piastra laica utilizzando un ciclo di inoculazione e inoculare in una provetta contenente 5 ml di brodo di Luria sterile.
6. Incubare la provetta durante la notte a 30 °C a 180 giri/min.
7. Inoculare i palloni contenenti 100 mL di brodo di Luria autoclavato aggiungendo 1 mL di colture di semi coltivate durante la notte ai palloni all'interno dell'armadio a flusso d'aria laminare.
8. Incubare i palloni in un incubatore rotativo a 30 °C e 180 giri/min per 7 giorni.
9. Dopo il completamento del periodo di incubazione, raccogliere i palloni e trasferire il brodo di coltura nei tubi della centrifuga. Centrifugare la coltura a 4.500 x g per 20 min in una centrifuga refrigerata a 4 °C.
10. Versare delicatamente il surnatante privo di cellule in un becher fresco e utilizzarlo nei saggi di screening per la produzione di biotensioattivi.

2. Saggi di screening per la produzione di biotensioattivi

NOTA: Nelle sezioni seguenti, il tensioattivo commerciale (Saponina) è stato utilizzato come controllo positivo mentre l'acqua e i mezzi non vaccinati sono stati utilizzati come controllo negativo.

1. Analisi di compressione delle gocce
   1. Prendere un vetrino pulito e rivestire la superficie del vetrino con 200 μL di olio.
   2. Aggiungere 20 μL del surnatante libero da cellule al centro dell'olio e lasciarlo indisturbato per 2-3 minuti.
      NOTA: se la goccia collassa, segnare il surnatante positivo per la presenza di biotensioattivo.
2. Saggio di diffusione dell'olio
   1. Prendere 20 ml di acqua doppia distillata in una piastra di Petri (diametro 75 mm) e aggiungere 200 μL di petrolio greggio alla superficie dell'acqua.
   2. Aggiungere 20 μL di surnatante libero da cellule al centro dell'olio e lasciarlo indisturbato per 1 minuto.
      NOTA: se si forma una zona di compensazione a causa dello spostamento dell'olio, assegnare un punteggio positivo al surnatante per la presenza del biotensioattivo.
3. Saggio dell'indice di emulsione (saggio E₂₄ )
   1. Aggiungere 4 ml di benzina (benzina) e surnatante senza celle ciascuno in una provetta di vetro pulita.
   2. Ruotare vigorosamente la miscela per 3 minuti e lasciarla indisturbata per le successive 24 ore.
   3. Dopo 24 ore, determinare l'indice E₂₄ in percentuale dell'altezza dello strato emulsionato (cm) rispetto all'altezza dell'intera colonna liquida (cm).
      
      NOTA: Se si osserva un'emulsione (olio in acqua o acqua in olio) dopo 24 ore, è probabile che il surnatante contenga il biotensioattivo.
4. Misurazione della tensione superficiale
   NOTA: La tensione superficiale è stata misurata utilizzando il metodo dell'anello du Noüy¹⁷. Lo strumento utilizzato in questo esperimento (vedi Tabella dei materiali) è molto sensibile, quindi garantire una corretta pulizia del recipiente di vetro e della sonda.
   1. Accendere il sistema e fare doppio clic sul software associato per aprirlo.
   2. Pulire il recipiente di vetro con il liquido la cui tensione superficiale deve essere determinata.
   3. Aggiungere il liquido (40 ml) nel recipiente e montare il recipiente sul portasciuga.
   4. Sblocca il supporto della sonda e monta la sonda su di esso. Ora blocca il supporto della sonda premendo il pulsante Di blocco sul controller manuale.
   5. Utilizzando il controller manuale, regolare l'altezza della piattaforma in modo che la sonda sia a circa 2-3 mm di distanza dalla superficie del liquido.
   6. Ora usa il software per misurare la tensione superficiale. Fai clic su File situato nel pannello in alto a sinistra dello schermo. Fare clic su Apri area di lavoro. Apparirà una finestra pop-up.
   7. Scorrere verso il basso e fare doppio clic sull'icona K100: Superficie e tensione interfacciale .
   8. Ora, fai clic sull'icona File situata nell'angolo in alto a sinistra dello schermo. Fare clic su Nuovo database. Immettere il nome per il salvataggio dei dati e fare clic su OK.
   9. Ancora una volta, fare clic su File > nuova misurazione > anello di > SFT. Immettere il nome della misurazione. Assicurarsi che il modello di configurazione mostri l'anello SFT.
   10. Inserire i dettagli nella finestra Configurazione misurazione selezionando la sonda e il recipiente utilizzato per la misurazione. Inoltre, inserisci i dettagli del liquido e della fase gassosa.
       NOTA: La fase liquida sarà acqua, mentre la fase gassosa sarà aria. La densità della fase liquida è la densità del surnatante libero da cellule. Questo può essere determinato prendendo il peso di 50 ml del liquido e calcolando la densità come Kg/m³.
   11. Ora fai clic sulla scheda Procedura e inserisci i seguenti dettagli: Velocità di rilevamento: 6 mm / min, Sensibilità di rilevamento: 0,005 g, Velocità di ricerca: 6 mm / min, Sensibilità di ricerca: 0,005 g, Velocità di misurazione: 3 mm / min, Sensibilità di misurazione: 0,001 g, Profondità di immersione: 3 mm, Distanza di ritorno: 10%, correzione: Harkins & Jordan, valori massimi: 5. Fare clic su OK.
   12. Nella finestra pop-up, selezionare il database in cui memorizzare i dati e fare clic su OK.
       NOTA: è possibile creare un nuovo database qui o aggiungere nuove misurazioni ai dati esistenti.
   13. Ora fai clic sul pulsante Riproduci situato nella parte superiore centrale dello schermo. Il sistema inizierà a eseguire lo script. Dopo che il sistema si è stabilizzato, rileverà la superficie. Immergere la sonda nel liquido, spostare la sonda avanti e indietro e rilevare la tensione nella lamella formata.
   14. Per ottenere i risultati, fare clic sull'icona Misurazione nella parte centrale sinistra dello schermo. Fare clic su Dati e annotare la tensione superficiale determinata.
   15. Dopo aver completato la misurazione, abbassare l'altezza della piattaforma e sbloccare e smontare la sonda e la nave dallo strumento.
       NOTA: per determinare la diminuzione della tensione superficiale dovuta alla produzione di biotensioattivi, il LB non inoculato deve essere utilizzato come controllo.

3. Estrazione di biotensioattivi

1. Regolare il pH del surnatante libero da cellule a 2 utilizzando 2 N HCl. Conservare la miscela a 4 °C durante la notte.
2. Aggiungere lo stesso volume della miscela cloroformio-metanolo (2:1) al surnatante e mescolare vigorosamente per 20 minuti.
3. Lasciare la miscela indisturbata affinché si verifichi la separazione di fase.
4. Rimuovere la fase superiore contenente acqua e metanolo e lasciare evaporare la fase inferiore contenente il biotensioattivo in una cappa aspirante.
5. Dopo l'evaporazione della fase organica, ridistribuire il biotensioattivo grezzo color miele in 3 ml di cloroformio e utilizzare questa miscela per un'ulteriore identificazione e caratterizzazione del biotensioattivo.

4. Studi di stabilità delle emulsioni

1. Stabilità dell'emulsione a diverse temperature
   1. Prendi 5 ml di supernatanti privi di cellule in diverse provette.
   2. Aggiungere 5 ml di benzina a ciascuna provetta e mescolare vigorosamente vorticosamente per 3 minuti.
   3. Incubare le provette durante la notte in diversi bagni d'acqua a diverse temperature (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C e 70 °C).
   4. Dopo 24 ore, stimare gli indici di emulsione come menzionato in precedenza.
2. Stabilità dell'emulsione a diversi valori di pH
   1. Prendere 5 ml di surnatante libero da cellule in provette pulite.
   2. Regolare il pH dei supernatanti liberi da cellule (2, 4, 6, 8 e 10) utilizzando 1 N HCl e 1 N NaOH.
   3. Aggiungere una quantità uguale di benzina alle provette e mescolare vigorosamente ruotando per 3 minuti.
   4. Lasciare le provette indisturbate a temperatura ambiente per 24 ore.
   5. Stimare l'indice di emulsione come accennato in precedenza.
3. Stabilità dell'emulsione a diverse concentrazioni saline
   1. Prendere 5 ml di surnatante libero da cellule in provette pulite.
   2. Aggiungere diverse quantità di sale (NaCl) ai supernatanti (0 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 60 g/L e 80 g/L).
   3. Sciogliere i sali nei supernatanti liberi da cellule vorticosamente per 3 minuti.
   4. Aggiungere una quantità uguale di benzina alle provette e mescolare vigorosamente ruotando per 3 minuti.
   5. Lasciare le provette indisturbate a temperatura ambiente per 24 ore.
   6. Stimare l'indice di emulsione dopo 24 ore.

5. Determinazione della natura del biotensioattivo

1. TLC del biotensioattivo estratto
   1. Spot 20 μL dei biotensioattivi su piastre TLC. Spot 2 μL contemporaneamente.
   2. Individua i biotensioattivi su tre diverse piastre TLC.
   3. Preparare una miscela da 100 ml dell'eluente contenente cloroformio:metanolo (2:1) e aggiungere l'eluente alla camera TLC. Chiudere il coperchio della camera e lasciarlo saturare per 20 minuti.
   4. Dopo aver asciugato le piastre, posizionare le piastre TLC all'interno della camera sature di una miscela di metanolo cloroformio ed eseguire la TLC.
   5. Dopo che l'eluente ha raggiunto la parte superiore della piastra TLC (1 cm di distanza dalla parte superiore), estrarre le piastre e lasciarle asciugare all'aria.
2. Colorazione per il rilevamento dei lipidi
   1. Prendi una camera TLC pulita e aggiungi alcuni (5-10) granuli di iodio nella camera fresca e satura la camera per 5-10 minuti.
   2. Posizionare la piastra TLC all'interno della camera e osservare lo sviluppo delle macchie gialle. Se compaiono le macchie, segnare il biotensioattivo positivo per la presenza della componente lipidica.
3. Colorazione per il rilevamento di peptidi o amminoacidi
   1. Preparare una soluzione di ninidrina sciogliendo 0,4 g di ninidrina in 20 ml di butanolo. Aggiungere 0,6 ml di acido acetico glaciale al 100% alla miscela.
   2. Spruzzare la piastra TLC con soluzione di ninidrina e lasciarla asciugare all'aria per 2 minuti. Riscaldare la piastra a 110 °C e osservare lo sviluppo del colore.
      NOTA: Se compaiono le macchie blu, assegnare un punteggio positivo al biotensioattivo per la presenza di qualsiasi catena peptidica o amminoacido.
4. Colorazione per il rilevamento dei carboidrati
   1. Preparare una soluzione di p-anisaldeide aggiungendo 2 ml di p-anisaldeide a 48 ml di acido acetico glaciale contenente 1 mL di H₂SO₄. Aggiungere 0,6 ml di acido acetico alla miscela.
   2. Spruzzare uniformemente la miscela su una piastra TLC e lasciarla asciugare all'aria per 2 minuti.
   3. Incubare la piastra a 110 °C e monitorare lo sviluppo delle macchie.
      NOTA: Se compaiono le macchie verdi o marroni, segnare il biotensioattivo positivo per la presenza di eventuali carboidrati.

6. Identificazione chimica del biotensioattivo

1. LCMS del biotensioattivo
   1. Sciogliere 25 mg del biotensioattivo estratto in 1 mL di cloroformio.
   2. Eseguire LCMS (in una configurazione di blocco spray con una frequenza di scansione di riferimento di 10 s) utilizzando una colonna C18.
   3. Utilizzare cloroformio:metanolo (1:1) come fase mobile e iniettare 2 μL del campione nella colonna ad una portata di 0,1 ml/min.
   4. Impostare i parametri sperimentali su: polarità: ES positivo, tensione capillare: 3 kV, temperatura sorgente: 80 °C, temperatura di desolvazione: 300 °C, portata gas di desolvazione: 7.000 L/h e portata gas trappola: 0,40 ml/min.
   5. Scansiona gli intervalli da 100 a 1.200 Da durante un tempo di rilevamento di 20 minuti e osserva gli ioni in modalità ES positiva.
   6. Analizza i valori m/z utilizzando qualsiasi software quantitativo di spettrometria di massa.
   7. Per l'analisi, accedere al software.
   8. Clicca su Batch Search ed entra nell'elenco delle masse ottenute. Esamina i risultati in una modalità di carica positiva e usa M + H e M + Na come addotti. Mantenere la precisione a 10 PPM e spuntare su Struttura di visualizzazione.
   9. Clicca su Cerca e dall'elenco dei composti, seleziona quello con il livello PPM più basso.
2. ¹ H NMR del biotensioattivo
   NOTA: ¹H NMR del biotensioattivo è stato eseguito utilizzando uno spettrometro NMR a 400 MHz (vedi Tabella dei materiali).
   1. Sciogliere 5 mg del biotensioattivo in 1 mL di cloroformio deuterato (CdCl₃).
   2. Trasferire la miscela in un tubo NMR. Tappare correttamente il tubo e inserire il tubo nella chiave inglese. Regolare l'altezza del tubo utilizzando il tubo regolatore.
   3. Posizionare il tubo insieme alla chiave nella macchina NMR e seguire i passaggi indicati di seguito per ottenere uno spettro NMR.
   4. Per selezionare il tipo di provetta campione: sx N, dove N è la posizione in cui è stato posizionato il tubo (ad esempio, sx 13, se il tubo è stato posizionato nella^13a posizione) nel software associato.
   5. Digitare edc e premere Invio per creare una nuova cartella in cui è possibile archiviare i dati.
   6. Apparirà un pop-up. Selezionare il solvente cliccando su CdCl ₃ nell'elenco e inserire il nome del campione.
   7. Per avviare il protocollo, digitare "getprosol"; per bloccare il solvente, digitare "lock cdcl3".
   8. Digitare "topshim" per eseguire lo shim del campione e infine digitare "rga;zgefp" per acquisire i dati. Questo avvierà il protocollo.
   9. Dopo aver ottenuto gli spettri, digitare "apk;abs n" e premere invio per la correzione di fase e di base.
   10. Per selezionare i picchi primari, digitare "pp" e premere Invio. Per selezionare solo picchi intensi, inserisci "mi" e digita l'intensità sopra la quale devono essere selezionati i picchi. Il valore predefinito sarà 0.2.
   11. Per integrare i picchi, fare clic su Integra e posizionare il cursore sul lato sinistro del picco da integrare e tenendo premuto il cursore fare clic e trascinare il cursore attorno al picco.
   12. Salva i dati facendo clic su File nell'angolo in alto a sinistra, quindi fai clic su Salva.
   13. Il campione può essere espulso dalla macchina digitando "sx ej".
   14. Analizzare i picchi e determinare l'ambiente degli atomi H.
3. Spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier del biotensioattivo
   NOTA: FT-IR del biotensioattivo estratto è stato eseguito utilizzando uno spettrofotometro disponibile in commercio in modalità ATR (vedi Tabella dei materiali).
   1. Accendere lo spettrofotometro e controllare lo spurgo, l'essiccante e il rilevatore.
   2. Per raccogliere uno spettro, prima raccogli lo spettro di fondo senza un campione in posizione.
   3. Prendere il biotensioattivo estratto e asciugarlo completamente. Posizionare il biotensioattivo essiccato direttamente sul cristallo diamantato, esercitare pressione e premere il punto di contatto ATR.
   4. Nel software, selezionare il numero delle scansioni (inserire 30) e scansionare lo spettro da 400 ^cm-1 a 4.000 ^cm-1.
   5. Fare clic su OK per aggiungere lo spettro del campione alla finestra spettrale.
   6. Fare clic su File > Salva > Salva con nome e immettere il nome del file seguito dall'estensione .spa e fare clic su OK.

7. Applicazione di biotensioattivi (recupero avanzato dell'olio)

NOTA: In questo esperimento, l'acqua a doppia distillazione è stata utilizzata come controllo negativo e il 10% di SDS, il 10% di Tween 80 e il 10% di saponina commerciale sono stati utilizzati come controlli positivi.

1. Prendi il vetro e sigilla l'uscita inferiore con lana di vetro e perline di vetro.
2. Imballare la colonna con terreno sabbioso in modo tale che un po 'di liquido possa essere aggiunto nella parte superiore del terreno e il flusso attraverso possa essere raccolto nella parte inferiore. Montare la colonna sul supporto e aggiungere alcune perle di vetro sulla parte superiore del terreno.
3. Inondare la colonna con 50 ml di soluzione di salamoia e raccogliere il flusso per determinare il volume dei pori.
   volume dei pori = volume di salamoia aggiunto sulla parte superiore - volume di flusso attraverso raccolto.
4. Rimuovere la salamoia dalla colonna costringendo il petrolio greggio a passarci attraverso di essa dopo averla aggiunta dalla parte superiore della colonna. Raccogliere il volume della salamoia e dell'olio che escono dalla colonna per determinare il volume iniziale di saturazione dell'olio. Il volume della salamoia rilasciato dalla colonna sarà il volume iniziale di saturazione dell'olio o l'olio originale in posizione.
5. Lasciare la colonna indisturbata per 24 ore.
6. Dopo 24 ore, inondare la colonna con 10 volumi di pori di salamoia e raccogliere l'olio che esce dalla colonna per stimare il recupero secondario dell'olio. L'olio lasciato nella colonna dopo il recupero secondario dell'olio corrisponde all'olio residuo.
7. Preparare una miscela di biotensioattivi aggiungendo volumi uguali del biotensioattivo estratto (estratto dopo la fase 3.5) al becher di vetro. Aggiungere i biotensioattivi nella parte superiore della colonna e incubare la colonna per 24 ore.
8. Dopo 24 ore, misurare la quantità di olio e acqua per determinare un recupero dell'olio aggiuntivo o migliorato. Il volume dell'olio rilasciato dalla colonna corrisponderà all'olio residuo recuperato.
9. Stimare il recupero dell'olio migliorato con la seguente equazione:
   

Risultati

Tre ceppi batterici (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 e Paenibacillus sp. IITD108) sono stati sottoposti a screening per la produzione di biotensioattivi mediante vari saggi, tra cui il test di collasso delle gocce, il saggio di spostamento dell'olio, il saggio dell'indice di emulsione e la riduzione della tensione superficiale. I supernatanti privi di cellule di tutti e tre i ceppi batterici e una soluzione di tensioattivo chimico hanno provocato un collasso delle gocce e, p...

Discussione

I biotensioattivi sono uno dei gruppi più versatili di componenti biologicamente attivi che stanno diventando alternative interessanti ai tensioattivi chimici. Hanno una vasta gamma di applicazioni in numerosi settori come detergenti, vernici, cosmetici, alimenti, prodotti farmaceutici, agricoltura, petrolio e trattamento delle acque grazie alla loro migliore bagnabilità, CMC inferiore, struttura diversificata e compatibilità ambientale¹⁸. Ciò ha portato a un maggiore interesse per la scoperta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml pipette	Eppendorf, Germany	G54412G
1H NMR	Bruker Avance AV-III type spectrometer,USA
20 ul pipette	Thermo scientific, USA	H69820
Autoclave	JAISBO, India	Ser no 5923	Jain Scientific
Blue flame burner	Rocker scientific, Taiwan	dragon 200
Butanol	GLR inovations, India	GLR09.022930
C18 column	Agilent Technologies, USA	770995-902
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5810R
Chloroform	Merck, India	1.94506.2521
Chloroform-d	SRL, India	57034
Falcon tubes	Tarsons, India	546041	Radiation sterilized polypropylene
FT-IR	Thermo Fisher Scientific, USA	Nicolet iS50
Fume hood	Khera, India	47408	Customied
glacial acetic acid	Merck, India	1.93002
Glass beads	Merck, India	104014
Glass slides	Polar industrial Corporation, USA	Blue Star	75 mm * 25 mm
Glass wool	Merk, India	104086
Hydrochloric acid	Merck, India	1003170510
Incubator	Thermo Scientific, USA	MaxQ600	Shaking incubator
Incubator	Khera, India	Sunbim
Iodine resublimed	Merck, India	231-442-4	resublimed Granules
K12 –Kruss tensiometer	Kruss Scientific, Germany	K100
Laminar air flow cabnet	Thermo Scientific, China	1300 Series A2
LCMS	Agilent Technologies, USA	1260 Infinity II
Luria Broth	HIMEDIA, India	M575-500G	Powder
Methanol	Merck, India	107018
Ninhydrin	Titan Biotech Limited, India	1608
p- anisaldehyde	Sigma, USA	204-602-6
Petri plate	Tarsons, India	460090-90 MM	Radiation sterilized polypropylene
Saponin	Merck, India	232-462-6
Sodium chloride	Merck, India	231-598-3
Test tubes	Borosil, India	9800U06	Glass tubes
TLC plates	Merck, India	1055540007
Vortex	GeNei, India	2006114318
Water Bath	Julabo, India	SW21C