Efficiente strategia di diagnostica della saliva della PCR quantitativa della trascrittasi inversa SARS-CoV-2 utilizzando robot di pipettaggio open source

Riepilogo

Il protocollo descrive un metodo diagnostico SARS-CoV-2 che utilizza l'automazione open source per eseguire test molecolari RT-qPCR su campioni di saliva. Questo approccio scalabile può essere applicato alla sorveglianza clinica della salute pubblica e per aumentare la capacità dei laboratori universitari più piccoli.

Abstract

L'emergere della recente crisi sanitaria globale SARS-CoV-2 ha introdotto sfide chiave per la ricerca epidemiologica e i test clinici. Caratterizzata da un alto tasso di trasmissione e da una bassa mortalità, la pandemia di COVID-19 ha richiesto test diagnostici accurati ed efficienti, in particolare nelle popolazioni chiuse come le università residenziali. La disponibilità iniziale di test sugli acidi nucleici, come i tamponi rinofaringei, è stata limitata a causa della pressione della catena di approvvigionamento che ha anche ritardato la segnalazione dei risultati dei test. Il test di reazione a catena della polimerasi quantitativa della trascrittasi inversa basato sulla saliva (RT-qPCR) ha dimostrato di essere paragonabile in sensibilità e specificità ad altri metodi di test e la raccolta della saliva è meno invasiva fisicamente per i partecipanti. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un test diagnostico multiplex RT-qPCR per la sorveglianza della popolazione della Clemson University e della comunità circostante. Il test ha utilizzato robot e termociclatori di gestione dei liquidi open source anziché complessi sistemi di automazione clinica per ottimizzare il flusso di lavoro e la flessibilità del sistema. L'automazione della RT-qPCR basata sulla saliva consente il rilevamento rapido e accurato di un'ampia gamma di concentrazioni di RNA virale per esigenze di test su larga e piccola scala. Il turnaround medio per il sistema automatizzato è stato di < 9 ore per il 95% dei campioni e < 24 ore per il 99% dei campioni. Il costo per un singolo test è stato di $ 2,80 quando tutti i reagenti sono stati acquistati in grandi quantità.

Introduzione

Il coronavirus-2 associato alla sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2), un nuovo coronavirus, è emerso alla fine del 2019 e si è rapidamente diffuso in tutte le popolazioni ^globali1. L'infezione da SARS-CoV-2 causa la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), una malattia altamente contagiosa con sintomi respiratori e infiammatori potenzialmente gravi. L'elevata trasmissibilità unita alla bassa mortalità indicava che il virus si sarebbe diffuso rapidamente tra le popolazioni e avrebbe richiesto un aumento dei test ^{diagnostici2,3}. Le raccomandazioni di salute pubblica hanno incoraggiato lo screening su larga scala della popolazione per isolare i casi e successivamente ridurre i tassi di ^{trasmissione4,5,6}. Inoltre, i modelli di sorveglianza della popolazione hanno rivelato che l'aumento della frequenza dei test e la diminuzione del tempo di segnalazione hanno avuto un effetto maggiore sulla riduzione della trasmissione rispetto all'aumento della sensibilità ai ^test7. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che gli individui infetti potrebbero essere messi in quarantena prima, rompendo così le catene di infezione.

Lo standard originale per il test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) era costituito da tamponi rinofaringei (NP) elaborati da RT-qPCR8. Tuttavia, sorgono complicazioni con questa forma di test per popolazioni molto grandi, come l'aumento dei costi relativi e l'esacerbata pressione della catena di approvvigionamento9,10. Inoltre, sia la raccolta dei campioni che l'elaborazione dei comuni metodi NAAT (compresi i tamponi NP, i tamponi orofaringei, i tamponi mid-turbinati e i tamponi nasali) dipendono da attrezzature specializzate, reagenti e personale ^medico9,10.

Un sostituto adeguato per il test RT-qPCR del tampone NP è il test basato sulla saliva, che è uno strumento diagnostico accurato per il rilevamento di SARS-CoV-211,12,13,14. L'esecuzione diretta di RT-qPCR su campioni di saliva produce sensibilità e specificità simili a quelle dei tamponi ^NP15. Uno dei principali vantaggi del test della saliva rispetto al test del tampone NP è che consente l'auto-raccolta di ^campioni16. Ciò riduce al minimo la necessità di personale medico e massimizza la facilità di raccolta dei campioni per i pazienti essendo meno invasiva dei tamponi NP. Inoltre, poiché i campioni di saliva non richiedono tamponi per rimuovere il campione da un tampone (come nel caso dei campioni NP), i test basati sulla saliva possono utilizzare direttamente l'estrazione di acido ribonucleico (RNA) a base di calore, il che riduce i costi dei test eliminando la necessità di buffer aggiuntivi, mezzi di trasporto e / o reagenti di estrazione ^{dell'RNA14,17}.

Il Clemson University Research and Education in Disease Diagnostics and Intervention (REDDI) Lab è stato istituito per rispondere alle esigenze dell'università per i test e la sorveglianza COVID-19. Nelle popolazioni chiuse, comprese le università, i frequenti test di sorveglianza abbinati al distanziamento sociale hanno prodotto i risultati più favorevoli nei modelli epidemiologici di prevalenza della ^malattia18. I protocolli consolidati CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 e ^{SalivaDirect14} sono stati adattati e l'automazione è stata utilizzata nel flusso di lavoro clinico per ridurre i costi e migliorare i tempi di consegna. I gruppi precedenti avevano utilizzato robot open source per la gestione dei liquidi per le fasi di estrazione dell'RNA SARS-CoV-220,21, ma abbiamo massimizzato l'uso dei robot per preparare piastre di prova e caricare ^campioni22. Qui, mostriamo che il protocollo adattato e l'utilizzo di sistemi di gestione dei liquidi open source (Figura 1) consente una RT-qPCR basata sulla saliva rapida e accurata ed è una strategia efficace per la sorveglianza della salute pubblica su larga scala.

Protocollo

Tutte le ricerche sono state eseguite in conformità con Clemson University e Prisma Health Institutional Review Boards (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1 luglio 2020).

1. Configurazione del robot di gestione dei liquidi open source

1. Installare moduli filtranti HEPA (particolato air) ad alta efficienza (vedere Tabella dei materiali) nella parte superiore di ciascun robot per la gestione dei liquidi secondo le istruzioni del produttore.
2. Collegare una pipetta P20 a 8 canali al supporto sinistro del robot di preparazione della piastra di miscelazione principale secondo le istruzioni del produttore.
3. Collegare una pipetta P20 al supporto destro del robot di caricamento del campione secondo le istruzioni del produttore.
4. Scaricare gli script Python personalizzati (File supplementare 1 e File supplementare 2) sui computer appropriati.
5. Aprire TigerSaliva Full 384 Loading.py nell'applicazione desktop sui computer robot di caricamento del campione. Fare clic su Calibra e impostare sia la pipetta che il programma secondo le istruzioni del software.
6. Aprire 12 Plates.py completa nell'applicazione desktop sul computer robot master mix. Fare clic su Calibra e impostare sia la pipetta che il programma secondo le istruzioni del software.
7. Stampa di rack di campioni personalizzati con una stampante tridimensionale (3D) di modellazione a deposizione fusa utilizzando un file CAD (computer-aided design) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Stampa 16 rack per robot di caricamento del campione, per due set di otto rack.

2. Preparazione di 20x multiplex N1 + P1 sonda / primer mix

1. Preparare un lotto di miscela di sonda/primer N1+P1 multipla 20x (volume totale di 20 mL, Tabella 1) in un tubo conico da 50 mL in un ambiente sterile lontano dall'RNA sintetico SARS-CoV-2 o da campioni di pazienti.
2. Aliquota 1,6 mL della miscela utilizzando una pipetta sierologica in tubi centrifughi sterili da 2,0 mL ed etichettare in modo appropriato.
3. Conservare le aliquote in un congelatore a -20 °C fino al momento dell'uso.

3. Preparazione della miscela di controllo positiva

NOTA: la miscela di controllo positiva non deve essere prodotta nello stesso ambiente sterile della miscela sonda/primer o di altri componenti della miscela principale. Dovrebbe essere usato un contenitore separato di acqua priva di nucleasi.

1. Diluire l'RNA sintetico SARS-CoV-2 (N1) da 1.000.000 di copie geniche/μL (cpμ) a 10.000 cpμ aggiungendo 10 μL di soluzione madre a 990 μL di acqua priva di nucleasi. Aliquota 25 μL di 10.000 cpμ in tubi sterili da 0,2 mL ed etichettare in modo appropriato. Conservare le aliquote inutilizzate a -80°C.
   NOTA: l'RNA sintetico deve essere conservato a -80°C per evitare la degradazione.
2. Diluire Hs_RPP30 DNA sintetico (P1) da 200.000 cpμ a 10.000 cpμ aggiungendo 50 μL di soluzione madre a 950 μL di acqua priva di nucleasi. Aliquota 25 μL di 10.000 cpμ in tubi sterili da 0,2 mL ed etichettare in modo appropriato. Conservare le aliquote inutilizzate a -80°C.
3. Diluire ciascun componente ad una concentrazione finale di 200 cpμ aggiungendo 20 μL di SARS-CoV-2 e Hs_RPP30 10.000 cpμ a 960 μL di acqua priva di nucleasi, per un totale di 1000 μL. Aliquota 20 μL di controllo positivo misto da 200 cpμ in tubi da 0,2 mL ed etichettare in modo appropriato. Conservare le aliquote a -80°C fino al momento dell'uso.

4. Preparazione delle piastre di miscelazione master

NOTA: Fare master mix in un ambiente sterile lontano da RNA sintetico SARS-CoV-2 o campioni di pazienti. Tutti i componenti devono essere completamente scongelati prima di essere aggiunti alla miscela; senza un adeguato scongelamento, le concentrazioni potrebbero essere errate. Lo scongelamento inadeguato è indicato dalla presenza di ghiaccio o colore irregolare dei reagenti. Conservare su un blocco congelatore durante la preparazione della miscela.

1. Preparare un lotto di miscela master multiplex (volume totale di 48 mL, Tabella 2) in un tubo conico da 50 mL.
2. Omogeneizzare la miscela ruotando il tubo di 3x. Non mescolare pipettando su e giù o vorticosamente in quanto ciò danneggerebbe l'enzima.
3. Riempire le colonne 1-4 di un serbatoio sterile di pozzo profondo 96 pozzi trasferendo 1,48 mL di miscela principale in ciascun pozzo. Un conico da 50 ml riempie quattro colonne, sufficienti per 12 piastre.
4. Coprire il serbatoio del pozzo profondo con una guarnizione in lamina e posizionarlo nel robot di gestione dei liquidi master mix dedicato. Posizionare il serbatoio del pozzo profondo riempito sul ponte 10, posizionare sei piastre vuote da 384 pozzetti sui ponti 1-6 e la scatola di punta P20 sul ponte 11. Scopri la piastra del pozzo profondo e le scatole di punta e chiudi il robot.
5. Inizializzare il protocollo operativo Python personalizzato facendo clic su Avvia esecuzione nell'applicazione desktop robot.
6. Dopo 40 minuti, la corsa si fermerà. Coprire le piastre del pozzo 384 riempite con guarnizioni in lamina mentre rimangono nel robot e premere verso il basso con il rullo per garantire l'aderenza. Etichettare il bordo di ogni piastra con un identificatore batch.
7. Posiziona sei nuove piastre vuote da 384 pozzetti sui ponti 1-6 e riprendi il protocollo operativo facendo clic su Riprendi esecuzione. Al termine della corsa, coprire il set finale di 384 piastre di pozzo con guarnizioni di alluminio.
8. Pipetta 2 μL della miscela master rimanente nelle colonne 1-3 e 22-24 di una piastra vuota da 384 pozzetti per il controllo della qualità del lotto. Sigillare con una guarnizione otticamente trasparente e premere sul termociclatore (punto 10.1-10.2). Se un pozzo ha valori di ciclo di soglia N1 (Ct) o se più di 10 pozzi hanno valori P1 Ct, il lotto è contaminato e non può essere utilizzato.
9. Conservare le piastre di miscelazione master preparate a 4 °C e utilizzarle entro 7 giorni dalla preparazione.

5. Raccolta, assunzione e trattamento termico dei campioni

1. Istruire i partecipanti a evitare di mangiare, bere, fumare o condurre l'igiene dentale 30 minuti prima della raccolta della saliva. Istruire i partecipanti a raccogliere almeno 1 mL di saliva che si accumula naturalmente in bocca e depositarla in un tubo conico sterile da 50 ml senza conservanti, quindi tappare il tubo (File supplementare 3).
2. Decontaminare l'esterno dei tubi di raccolta della saliva con etanolo al 70% o salviette disinfettanti e trasferirli in laboratorio per i test.
3. Registra l'arrivo del campione scansionando ogni codice a barre campione nel foglio di calcolo dell'assunzione giornaliera (File supplementare 4).
4. Trattare termicamente i campioni scansionati per 30 minuti in un forno a 95 °C. Rimuovere i campioni indossando guanti resistenti al calore.
   NOTA: i campioni non trattati sono stabili a temperatura ambiente (23 °C) fino a 72 ore. Una volta trattati termicamente, i campioni devono essere conservati a 4 °C, se non vengono elaborati immediatamente.

6. Assegnazione del campione

1. Aprire i fogli di calcolo giornalieri di caricamento dei campioni per ogni robot di caricamento dei campioni (file supplementare 5) sul computer nella stazione di assegnazione del campione.
2. Assegnare 188 campioni a ciascuna piastra a 384 pozzetti come segue: i campioni 1-48 sono considerati trimestre 1, i campioni 49-96 sono considerati trimestre 2, i campioni 97-144 sono considerati trimestre 3 e i campioni 145-188 sono considerati trimestre 4. I campioni vengono analizzati in duplice copia.
3. Vassoi per etichette con nome della targa, data e numero di quarto. Eseguire la scansione dei campioni in ordine nel foglio di calcolo per il caricamento dei campioni.
   NOTA: potrebbe essere necessario eseguire manualmente campioni di lastre precedenti, come definito nella Figura 3. Fare riferimento alle sezioni 8.1-8.3 per l'assegnazione manuale del campione e le istruzioni di caricamento.

7. Funzionamento dei robot di caricamento dei campioni

1. Alla stazione di carico del campione, allineare due set completi di otto rack stampati in 3D corrispondenti al posizionamento del ponte nel robot.
2. Sblocca i tubi del quarto 1 e posizionali in rack stampati in 3D, iniziando con la posizione A1 nel rack 1. Riempi ogni rack da sinistra a destra e dall'alto verso il basso. Continuare questo schema di caricamento nel rack 2, quindi procedere ai rack 4 e 5 (fare riferimento alla Figura 2C).
   NOTA: i rack non sono numerati consecutivamente a causa dei parametri del programma robot.
3. Posizionare i rack di campionamento del quarto 1 caricato sui ponti 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Posiziona le punte P20 sui ponti 3 e 9. Per semplificare il processo di configurazione, caricare i materiali da dietro a davanti nel robot.
4. Prendere una piastra di miscelazione master prefabbricata da 4 °C, etichettarla con il nome della piastra e utilizzare una lama affilata per tagliare una linea nella lamina attorno ai pozzetti di controllo (N23/24, O23/24 e P23/24).
5. Posizionare la piastra di miscelazione principale sul ponte 6 e staccare il coperchio della lamina, lasciando dietro di sé il piccolo rettangolo che copre i pozzetti di controllo. Scopri le scatole di punta e chiudi il robot.
6. Inizializzare il protocollo operativo Python personalizzato facendo clic su Avvia esecuzione tramite l'applicazione desktop robot. Ogni trimestre impiega 24,5 minuti per caricarsi sul piatto; impostare un timer come promemoria.
7. Mentre il robot è in funzione, scomporre e caricare le provette campione di quarto 2 nel secondo set di rack stampati in 3D come descritto nella sezione 7.2.
8. Quando il robot si ferma, rimuovere i rack del quarto 1 e sostituirli con rack del quarto 2. Fare clic su Riprendi esecuzione nell'applicazione desktop.
9. Ricapitolare le provette del quarto 1 e conservarle in frigorifero a 4 °C in attesa dei risultati.
   Ripetere questo processo di caricamento per i quarti 3 e 4.
10. Trasferire la piastra caricata in un armadio di biosicurezza. Per ridurre al minimo la contaminazione, tenere la piastra coperta durante il trasferimento.

8. Caricamento manuale del campione

NOTA: eseguire una singola esecuzione manuale su campioni ripetuti (N1 Rerun o Rerun, vedere la Figura 3) in caso di carico robotico inadeguato.

1. Raccogliere eventuali campioni ripetuti e assegnarli come ultimi campioni nel quarto trimestre (vedere paragrafo 6.2). Numera i campioni, scansiona i codici a barre e inserisci la posizione del campione originale e il risultato nel foglio di calcolo del caricamento del campione.
2. Trasferire campioni ripetuti nell'armadio di biosicurezza. Non caricare provette di campionamento ripetute nei rack di carico del robot.
3. Pipetta 2 μL di ciascun campione ripetuto ai pozzetti corretti seguendo lo schema di layout della piastra (file supplementare 6). Utilizzare una pipetta designata per aggiungere campioni di pazienti. Mantenere i pozzetti di controllo coperti con un foglio mentre si aggiungono campioni per ridurre al minimo la contaminazione.

9. Aggiunta di controlli alle piastre di prova

1. Staccare il coperchio della lamina sui pozzetti di controllo usando una pinza.
2. Pipettare 2 μL di acqua priva di nucleasi (nessun controllo del modello) ai pozzi N23-N24 e 2 μL di 200 cpμ di controllo positivo misto (fare riferimento alla sezione 3) ai pozzi O23-O24. Pipetta 2 μL di un controllo del campione di paziente positivo confermato nei pozzetti M23-M24 come controllo aggiuntivo. Lasciare vuoti i pozzetti P23-P24 per monitorare la qualità del lotto di miscelazione principale.
3. Coprire la piastra con una guarnizione otticamente trasparente e utilizzare il rullo applicatore per aderire a tutti i pozzetti. Vortice la piastra a 2500 giri / min per 30 secondi per mescolare accuratamente. Centrifugare la piastra a 500 x g per 1 min.

10. Esecuzione di RT-qPCR

1. Creare un programma di protocollo nel software del termociclatore in base alle condizioni descritte (Tabella 3). Salvare il protocollo per le piastre future. Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore ed eseguire il protocollo.
2. Esportare i valori Ct come file .xslx e copiare i valori nel foglio di calcolo di caricamento dell'esempio (file supplementare 5).
   NOTA: questi fogli sono stati progettati su misura per i file di output Ct dal software del produttore e potrebbero essere necessarie modifiche per accettare altri formati.

11. Determinazione della validità della targa

1. Convalidare sia il controllo positivo e/o i campioni positivi noti che il controllo negativo per considerare validi i risultati della piastra. Valutare i pozzetti di controllo con i seguenti criteri.
   1. Per il controllo positivo, verificare se almeno un pozzo di controllo positivo (O23/O24) produce valori ct compresi tra 22-28 per entrambe le sonde P1 e N1. In alternativa, i pozzi campione positivi noti (M23/M24) producono valori P1 e N1 Ct <33 sulle sonde P1 e N1.
   2. Per il controllo negativo, verificare che non vi siano valori N1 o P1 Ct in nessuno dei due pozzi di controllo negativi (N23/N24). Verificare che i valori Ct abbiano curve di amplificazione valide prima di invalidare la piastra.

12. Interpretazione dei risultati del campione

1. Determinare il risultato del paziente seguendo il diagramma (Figura 3) e riportare i campioni risolti.
   1. Valutare il risultato P1 come VALIDO o NON VALIDO. Se P1 produce un risultato di Ct <33, considerare il pozzo VALIDO e procedere al risultato da N1. Se P1 produce un risultato di Ct >= 33 o nessun valore Ct, considerare il pozzo INVALID.
      1. Valutare il risultato N1 come SÌ, NO o NO*. Se N1 produce un risultato di Ct <33, il pozzo è SÌ. Se N1 non produce un valore Ct, il pozzo è NO. Se N1 produce un Ct >=33, il pozzo è NO*. Verificare che tutti i valori di N1 Ct siano associati a una curva di amplificazione reale. Se un valore Ct per N1 non ha curva di amplificazione, il pozzo è NO.
      2. Identificare i campioni ripetuti (N1 Rerun o Rerun), etichettarli con un numero di campione interno e un tipo di campione e restituirli al flusso di lavoro di caricamento (sezione 8.1-8.3).

13. Pulizia del laboratorio

1. Robot per la movimentazione dei liquidi
   1. Pulire tutti i lati con disinfettante di livello intermedio. Non usare etanolo in quanto degraderà la plastica.
   2. Pulire delicatamente l'estremità della punta della pipetta e il cestino dei rifiuti con una salvietta alcool (70% di etanolo o 100% di isopropanolo). Pulire la tastiera e il mouse.
2. Armadio di biosicurezza
   1. Pulire tutte le superfici con disinfettante di livello intermedio. Accendere la luce UV per 15 minuti.

Risultati

Abbiamo determinato l'intervallo di rilevamento per le sonde RT-qPCR e i primer per il contenuto di acido nucleico sintetico sia per SARS-CoV-2 (N1) che per Hs_RPP30 (P1). È stata effettuata una diluizione seriale di 10 volte delle concentrazioni note di RNA sintetico combinato SARS-CoV-2 e DNA sintetico Hs_RPP30 in acqua. La seguente formula è stata utilizzata per convertire il peso molecolare in numero di copie geniche

Numero di copia del gene = (ng * 6.0221 x ¹⁰²³)/(lunghezza in coppie di basi*660 g/mole) *1 x ¹⁰⁹ ng/g)

e RT-qPCR è stato eseguito. Dopo aver effettuato RT-qPCR, le curve lineari per il rilevamento di N1 (Figura 4A) e il rilevamento P1 (Figura 4B) hanno mostrato buoni coefficienti di correlazione in un'ampia gamma di concentrazioni di copie geniche (^R2 = 0,9975 e ^R2 = 0,9884, rispettivamente). Questo risultato indica che la combinazione di primer e set di sonde non è inibitoria e può rilevare con precisione l'RNA SARS-CoV-2 a una copia del gene / μL (Cq = 33). Una copia del gene è approssimativamente equivalente a una copia virale; tuttavia, non abbiamo determinato il numero quantitativo di copie virali nella saliva a causa della natura semi-quantitativa di RT-qPCR. Abbiamo tentato di simulare campioni di saliva positivi spillando RNA sintetico SARS-CoV-2 di concentrazioni note in saliva priva di virus (sia trattata termicamente che non trattata termicamente), ma non siamo stati in grado di produrre amplificazione N1 a basse concentrazioni di RNA (dati non mostrati). Ciò potrebbe essere dovuto alla degradazione della RNasi o ad altri fattori confondenti.

È stata inoltre valutata la variabilità inter-e intra-saggio tra metodi di caricamento del campione automatizzati e manuali. Per valutare la variabilità tra i test, sono stati caricati 20 campioni positivi unici utilizzando i metodi manuali (descritti al paragrafo 8.1-8.3) e automatizzati (descritti al punto 7.1-7.11). I valori di N1 Ct sono stati confrontati per determinare se i robot di movimentazione dei liquidi e il caricamento manuale dei campioni hanno prodotto risultati equivalenti (Figura 5A). La relazione lineare tra metodi manuali e automatizzati ha prodotto un alto coefficiente di correlazione (^R2 = 0,9088), indicando che entrambi i metodi sono funzionalmente equivalenti. Con l'aumento dei valori di N1 Ct, è aumentata anche la variabilità dei valori di Ct. Questa tendenza è probabilmente dovuta alla distribuzione eterogenea delle particelle virali all'interno della saliva, che è più pronunciata quando sono presenti meno particelle. Per valutare la variabilità intra-saggio, è stato effettuato un confronto tra i valori di N1 Ct provenienti da pozzetti replicati di campioni di saliva unici utilizzando entrambi i metodi di carico del campione (Figura 5B). La relazione lineare tra le repliche del carico automatizzato del campione (^R2= 0,9622) ha prodotto un coefficiente di correlazione leggermente superiore a quello del carico manuale (^R2= 0,9589), indicando un'elevata riproducibilità del rilevamento SARS-CoV-2 per entrambi i metodi di carico.

Infine, è stata effettuata una valutazione della riduzione della viscosità della saliva rispetto ai metodi di trattamento termico (Figura 6). La saliva è stata ottenuta da un'unica fonte per eliminare la variabilità del campione. Una maggiore variabilità dei valori di P1 Ct all'interno di un metodo di trattamento termico può essere indicativa di una maggiore viscosità del campione poiché la saliva viscosa non può essere aspirata ed erogata con precisione. Entrambi i metodi di trattamento termico di 30 minuti e 60 minuti hanno prodotto una variabilità del campione significativamente ridotta rispetto a nessun controllo del trattamento (p = 0,0006 e p = 0,0429, rispettivamente). Non c'era differenza significativa tra i trattamenti di 30 minuti e 60 minuti (p = 0,2245); pertanto, è stato implementato il metodo di trattamento termico di 30 minuti per ridurre i tempi di lavorazione.

Figura 1: Flusso di lavoro di laboratorio che utilizza il sistema diagnostico RT-qPCR basato sulla saliva. (A) I campioni vengono raccolti e trattati termicamente a 95 °C per 30 minuti. I campioni trattati vengono ordinati e monitorati con le informazioni sui pazienti attraverso un sistema di fogli di calcolo interno. Un robot per la movimentazione di liquidi carica campioni in pozzetti duplicati di piastre di miscelazione master preparate. Un tecnico carica manualmente i controlli, sigilla la piastra e posiziona la piastra in un termociclatore per la lavorazione. I risultati vengono analizzati attraverso un sistema informatico automatizzato e verificati da un tecnico. (B) Un tecnico prepara i reagenti per la miscela principale che vengono aggiunti a un serbatoio di pozzo profondo in un armadio sterile di biosicurezza. I serbatoi dei pozzi profondi riempiti vengono caricati in un robot dedicato alla gestione dei liquidi. Le lastre completate sono sigillate con un foglio, etichettate e conservate a 4 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Layout utilizzati per il robot di gestione dei liquidi. (A) Layout del ponte per i robot di preparazione delle piastre di miscelazione master. Con una pipetta a otto canali, il robot è programmato per prelevare le punte delle pipette, aspirare la miscela master da un serbatoio del pozzo profondo 96 pozzi, erogare la miscela master in piastre vuote a 384 pozzetti ed espellere le punte della pipetta in un cestino dei rifiuti. Questo viene ripetuto per sei piastre per corsa. (B) Configurazione del ponte per i robot di caricamento dei campioni. Con una pipetta a canale singolo, il robot è programmato per prelevare una punta di pipetta, aspirare un campione di saliva, erogare un campione di saliva in pozzetti duplicati di una piastra di miscelazione principale a 384 pozzetti ed espellere la punta della pipetta in un cestino dei rifiuti. Questo viene ripetuto per 48 campioni per esecuzione. (C) Ordine di caricamento del tubo campione per rack stampati in 3D. Le frecce rosse indicano l'ordine di caricamento all'interno di un rack e i numeri in scatola bianchi indicano l'ordine di caricamento dell'intero set di rack. L'intera configurazione caricherà 188 campioni in duplice copia in una piastra a 384 pozzetti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempio di diagramma di flusso risultante. I campioni con P1 valido e N1 positivo sono stati determinati come campioni di saliva umana positivi per SARS-CoV-2. I risultati del campione validi e positivi/negativi sono stati considerati conclusivi. I campioni che non hanno prodotto risultati conclusivi nella prima esecuzione sono stati classificati come Rerun (indicato RR) o N1 Rerun (indicato con N1 RR). I campioni di riesecuzione non avevano un'amplificazione P1 valida e i campioni di N1 Rerun avevano un'amplificazione N1 positiva in una singola replica. Se nessuna amplificazione P1 valida poteva essere prodotta da una successiva esecuzione manuale, o entrambe le repliche avevano valori di N1 Ct superiori alla soglia positiva (Ct >33), i risultati del campione sono stati considerati inconcludenti. Per scopi clinici, i campioni di pazienti che non sono arrivati in laboratorio, avevano una quantità insufficiente di saliva alla pipetta o sono stati danneggiati sono stati considerati non validi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Rilevazione RT-qPCR di RNA sintetico N1 (SARS-CoV-2) e DNA sintetico P1 (Hs_RPP 30). Le curve standard sono state tracciate con deviazioni standard per determinare l'intervallo di rilevamento accurato utilizzando questa combinazione sonda/primer. (A) I valori medi di Ct (n = 4) ottenuti nelle rispettive diluizioni sono stati tracciati rispetto alla quantità stimata di RNA sintetico (da ^1x100 a 1x104 copie di RNA in 10 μL di reazione RT-qPCR). (B) I valori medi di Ct (n = 3) ottenuti nelle rispettive diluizioni sono stati tracciati rispetto alla quantità stimata di DNA sintetico (da 1 x ¹⁰⁰ a 1 x ¹⁰⁴ copie geniche in 10 μL di reazione RT-qPCR). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Confronto tra i valori di trasferimento manuale e automatizzato della saliva SARS-CoV-2 (N1) Ct. I campioni di saliva positivi al SARS-CoV-2 noti (n = 20) sono stati caricati in duplice copia in una piastra di miscelazione principale RT-qPCR da un robot di gestione dei liquidi. I campioni hanno un valore ct che va da 18-32 per N1. Gli stessi campioni sono stati poi caricati manualmente in pozzi duplicati in una posizione di piastra diversa. (A) I valori di N1 Ct ottenuti da campioni unici utilizzando sia il carico del campione robot che manuale sono stati trasposti per determinare la variabilità tra i test tra il carico manuale e quello robot. (B) La variabilità intra-saggio è stata determinata anche utilizzando la replica trasposta dei valori di N1 Ct ottenuti dal caricamento del campione sia robot che manuale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Valutazione dei metodi di trattamento termico per la riduzione della viscosità nella saliva. La saliva sars-CoV-2 negativa è stata raccolta da un'unica fonte e le aliquote sono state trattate termicamente per 0 minuti, 30 minuti o 60 minuti a 95 °C. I valori di P1 Ct da repliche tecniche (n = 12) di ciascuna condizione sono stati tracciati per determinare la variabilità tra i metodi di trattamento. I confronti a coppie tra i gruppi sono stati valutati con un t-test spaiato (*** indica p <0,001, * indica p <0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Confronto di N1 Ct in campioni di saliva a basso P1 Ct. I campioni positivi con basso P1 Ct sono stati selezionati e confrontati con N1 Ct (n = 106). I valori di N1 Ct variavano da 14 a 33, indicando che il test ha una gamma dinamica nei campioni di saliva paragonabile alla curva standard. Fare clic qui per scaricare questo file.

Componente		Sequenza (5'→3')		Concentrazione delle scorte	Volume
Sonda 2019-nCoV-N1		/5FAM/ACCCCGCAT/ZEN/TACGTTTGGTGGACC/3IABkFQ		50 μM	500 μL
2019-nCoV-N1-Per		GACCCCAAAATCAGCGAAAT		100 μM	2000 μL
2019-nCoV-N1-Rev		TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG		100 μM	2000 μL
Sonda Hs RPP30 Cy5		/5Cy5/TTCTGACCT/ZEN/GAAGGCTCTGCGCG/3IABkFQ		50 μM	500 μL
Hs-RPP30-Per		AGATTTGGACCTGCGAGCG		100 μM	2000 μL
Hs-RPP30-Rev		GAGCGGCTGTCTCCACAAGT		100 μM	2000 μL
Acqua		-		-	11000 μL

Tabella 1: Componenti della miscela sonda/primer N1+P1.

Componente		Concentrazione delle scorte		Volume per reazione	Concentrazione finale	Batch Volume
Luna WarmStart RT Enzyme Mix		20 volte		0,5 μL	1X	3 ml
Miscela di reazione Luna Buffer		2 volte		5,0 μL	1X	30 ml
N1+P1 Primer/Probe Mix		nCoV N1 F: 10 μM		0,5 μL	500 nM	3 ml
		nCoV N1 R: 10 μM			500 nM
		Sonda nCoV N1: 2.5 μM			125 nM
		RPP_30 P1 F: 10 μM			500 nM
		RPP_30 P1 R: 10 μM			500 nM
		Sonda RPP_30 P1: 2.5 μM			125 nM
Nuclease Acqua Gratis		---		2 μL	---	12 ml
Subtotale		---		8 μL	---	48 ml
Sagoma				2 μL

Tabella 2: Componenti del mix master multiplex SARS-CoV-2.

Palco	Temperatura (°C)	Durata	Numero di cicli
Trascrizione inversa	55	10 minuti	1
Denaturazione iniziale	95	1 min	1
Touchdown	95	10 secondi	3
	72	30 secondi
	95	10 secondi	3
	69	30 secondi
	95	10 secondi	3
	66	30 secondi
Amplificazione principale	95	10 secondi	40
	65	30 secondi

Tabella 3: Protocollo Touchdown RT-qPCR. Condizioni di termociclismo per il test diagnostico RT-qPCR SARS-CoV-2 in una fase.

	Passo touchdown		Nessun passaggio di touchdown
	Media N1 Ct	P1 Ct medio	Media N1 Ct	P1 Ct medio
Esempio 1	19.65	22.7	27.8	28.3
Esempio 2	22.24	24.9	28.77	30.5
Esempio 3	18.85	19.2	24.65	25.9
Esempio 4	25.56	22.8	31.93	29.2
Esempio 5	22.34	24.8	38.48	40.0 (rilevamento non riuscito)

Tabella 4: Confronto dei valori di Touchdown Ct per cinque campioni positivi rispetto ai valori di Ct senza touchdown.

Campione	TigerSaliva		Test SARS-CoV-2 a base di saliva disponibile in commercio
	N1 Ct	P1 Ct	Covid-19 Valore	Valore RNaseP
D11 ·	16.4	18.1	20.86	23.4
E11 ·	18.9	19.1	25.6	21.2
F11 ·	19.5	18.4	22.8	22.2
G11 ·	22.2	19.1	23.7	22.9
H11 ·	26.4	21.3	32.2	26.7
A12 ·	14.8	16.5	29.15	19
B12 ·	24	19.6	31.05	21.35
C12 ·	14.9	17.5	20.84	18.9

Tabella 5: Confronto tra i risultati di TigerSaliva Ct e i risultati del test SARS-CoV-2 a base di saliva disponibili in commercio. Entrambi i test sono stati eseguiti sugli stessi campioni di saliva (n = 8).

File supplementare 1: Script personalizzato per la creazione di piastre di mix master robot. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Script personalizzato per l'elaborazione della saliva su robot di caricamento dei campioni. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Istruzioni per l'auto-raccolta di campioni di saliva di alta qualità dai partecipanti. Ulteriori dettagli sono disponibili nella breve descrizione video del processo di test disponibile presso https://www.clemson.edu/centers-institutes/reddilab/index.html. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: Esempio di foglio di calcolo di assunzione. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 5: Esempio di caricamento del foglio di calcolo. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 6: Esempio di diagramma di layout della piastra a 384 pozzetti. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Il test descritto nel protocollo è stato valutato da uno studio di convalida indipendente. È stato riscontrato che il test aveva una specificità del 98,9% (1,1% di falsi positivi) e del 90,0% di sensibilità (10,0% di falsi negativi) quando valutato con tamponi rinofaringei accoppiati presi contemporaneamente (n = 837; 817 negativi, 20 positivi). È importante sottolineare che tre partecipanti che sono risultati positivi con TigerSaliva e negativi con un tampone rinofaringeo sono stati nuovamente testati con tamponi 48 ore dopo e hanno restituito risultati positivi, indicando che TigerSaliva potrebbe essere in grado di rilevare infezioni da SARS-CoV-2 all'inizio del corso della malattia.

Abbiamo simulato campioni di saliva positivi facendo spillare saliva priva di virus (sia trattata termicamente che non trattata termicamente) con concentrazioni note di RNA sintetico SARS-CoV-2 ed eseguito una diluizione di 10 volte per determinare il limite ct nella saliva. Il gene N1 non era rilevabile al di sotto di 10.000 copie del gene (circa Ct = 28) in campioni positivi simulati. Sospettiamo che ciò sia dovuto alla degradazione della RNasi o ad altri fattori confondenti. Tuttavia, l'interazione delle RNasi salivari con l'RNA sintetico nudo è probabilmente diversa dall'interazione con le particelle virali, anche dopo che sono state denaturate dal calore. Campioni di saliva positivi sono stati identificati con Ct >30 e laboratori esterni hanno ottenuto dati di sequenza genetica SARS-CoV-2 da questi campioni. Ipotizziamo che le proteine virali forniscano protezione dalla degradazione dell'RNA nei campioni di saliva dei pazienti.

La fase più critica del protocollo è l'implementazione dell'automazione per la preparazione del mix master e l'elaborazione del campione di saliva (sezioni 4 e 7 rispettivamente). Ciò consente la sovrapposizione dei processi di attività, riducendo drasticamente i tempi di consegna. Un altro passo critico è l'interpretazione dei risultati clinici (paragrafi 11 e 12). La definizione di categorie di risultati intermedie (Rerun e N1 Rerun) ha anche ridotto al minimo il verificarsi di risultati di test inconcludenti.

Abbiamo dimostrato che la variazione tra i metodi di caricamento manuale e automatizzato dei campioni di saliva è trascurabile (Figura 5A) e che l'automazione può migliorare la riproducibilità del rilevamento di SARS-CoV-2 (Figura 5B). L'automazione dovrebbe essere favorita per facilitare i test durante la progettazione e l'espansione dei laboratori ^clinici25. Il flusso di lavoro del laboratorio viene migliorato con l'implementazione di attività automatizzate da ^robot26. Le funzionalità open source dei robot di gestione dei liquidi consentono l'implementazione di script personalizzati per la progettazione del protocollo. Ciò rende i robot per la gestione dei liquidi un sistema economico e altamente modificabile rispetto ai tradizionali metodi di automazione clinica. È anche una strategia ideale per l'esecuzione di attività di laboratorio altamente ripetitive. L'elevato livello di personalizzazione del sistema si traduce in libertà di modificare gli articoli da laboratorio (ad esempio, tubi di raccolta, punte di pipette o piastre a 384 pozzetti) in caso di carenze. Pertanto, l'automazione utilizzando robot per la gestione dei liquidi è praticabile sia per la sorveglianza e la ricerca su larga scala che su piccola scala.

Uno dei principali vantaggi di questa strategia di test è un tempo di consegna molto più breve rispetto ad altri laboratori clinici. L'utilizzo di robot automatizzati per la gestione dei liquidi svolge un ruolo chiave nel ridurre i tempi di consegna, ma l'uso simultaneo di robot e termocicli è anche determinante per massimizzare l'efficienza dei test. Un robot e un termociclatore devono essere azionati in coppia, dove entrambe le macchine vengono utilizzate in tandem per il caricamento ininterrotto del campione e l'analisi dei risultati del campione. Una volta stabilito un flusso costante di campioni assegnati, tutte le coppie di macchine possono essere azionate contemporaneamente. L'uso simultaneo costante di robot e termociclatori aumenta drasticamente la capacità e l'efficienza dei test, che è fondamentale per soddisfare l'elevato volume di test.

In contrasto con altri protocolli SARS-CoV-2 RT-qPCR consolidati, abbiamo incluso un passaggio da touchdown nel protocollo termociclatore per migliorare la ricottura della sonda e dei set di primer ai geni ^bersaglio27, riducendo il rischio di mancata amplificazione. I risultati hanno dimostrato che il touchdown ha migliorato il rilevamento di campioni positivi senza rischiare la perdita di un legame specifico del primer (Tabella 4). Abbiamo determinato che una vasta gamma di copie di RNA SARS-CoV-2 (Figura 4A) e copie di DNA Hs_RPP30 (Figura 4B) possono essere rilevate contemporaneamente dal test RT-qPCR.

Una limitazione dei robot di gestione dei liquidi è la possibilità di contaminazione incrociata da campioni positivi durante il trasferimento della saliva. La saliva è un fluido viscoelastico28 e può infilarsi attraverso i pozzetti adiacenti dopo essere stata erogata dalla punta della pipetta. Inoltre, l'eterogeneità della ^saliva29 può causare una distribuzione non uniforme delle particelle virali in tutto il campione. Ciò aumenta la possibilità di falsi positivi e negativi, rendendo necessaria la designazione di campioni N1 Rerun e Rerun. Tuttavia, il 14,1% dei campioni inizialmente designati come N1 Rerun si è risolto come positivo per SARS-CoV-2 e aveva più di 30 volte più probabilità rispetto ai campioni di Rerun di risolversi come positivi dopo un nuovo test. Di conseguenza, la differenziazione di Rerun da N1 Rerun (Figura 3) ha permesso una separazione più accurata dei campioni potenzialmente positivi, aumentando la sensibilità e la specificità del nostro test diagnostico. Altri parametri risultanti per il test diagnostico della saliva non hanno fatto questa distinzione12,14,24,30,31.

I campioni di saliva possono essere difficili da pipettare a causa dell'eterogeneità e della ^viscosità32. Il trattamento termico denatura adeguatamente le proteine nella biomatrice della saliva, riducendo la viscosità ed eliminando la necessità di reagenti per l'estrazione ^dell'RNA9, che erano scarsi durante le prime fasi della ^pandemia10. Il trattamento termico prolungato inattiva anche i virus ^presenti33 che consentono l'elaborazione in laboratorio a livelli di biosicurezza inferiori. Di conseguenza, è stata implementata un'estrazione di RNA basata sul calore (descritta nel paragrafo 5.4) per ridurre la viscosità attraverso la denaturazione delle proteine (Figura 6). Sulla base dei risultati, postuliamo che il trattamento termico può anche omogeneizzare i campioni di saliva oltre a denaturare la proteina biomatrice. Altri gruppi hanno combinato il trattamento termico e il trattamento con proteinasi K per aumentare l'omogeneità9,14,34. Abbiamo scelto di non implementare questo passaggio in quanto potrebbe denaturare le proteine virioni a una velocità che lascia l'RNA virale esposto alla degradazione del ^calore35. Inoltre, la diluizione del campione con proteinasi K può mascherare campioni positivi contenenti meno particelle virali, diminuendo così la sensibilità. Inoltre, i risultati del test sono stati confrontati con un test SARS-CoV-2 a base di saliva disponibile in commercio (Logix Smart COVID-19) che utilizza l'estrazione magnetica dell'RNA del tallone (Tabella 5). Si è riscontrato che l'attuale saggio era più adatto a rilevare campioni positivi deboli rispetto al test disponibile in commercio.

È difficile quantificare il numero di copie di virus nella saliva usando solo RT-qPCR, perché la qPCR è semi-quantitativa. Esiste una variazione intrinseca tra i valori ct che ha origine da limitazioni tecniche. Il numero di copie geniche può essere determinato dai valori di Ct (Figura 4) ed è approssimativamente equivalente al numero di copie virali. Una possibile soluzione per determinare il numero di copie virali nei campioni di saliva è la ddPCR, che fornisce una quantificazione dura delle copie geniche nella reazione. Tuttavia, riteniamo che sia adeguato fornire risultati qualitativi ai medici e il relativo contenuto virale possa essere confrontato tra i campioni elaborati con i nostri metodi.

Nonostante alcune limitazioni che si presentano quando si utilizza la saliva, il test SARS-CoV-2 mediante RT-qPCR basato sulla saliva si dimostra un metodo efficace per il rilevamento rapido e affidabile dell'RNA virale su qualsiasi scala di test. Ciò è particolarmente vero se abbinato all'utilizzo di sistemi di gestione dei liquidi open source. Questo approccio di test può essere modificato per rilevare altre sequenze di acidi nucleici rilevanti per la diagnostica, come agenti di malattie infettive, marcatori di malattia o altri virus. Ciò rende il test applicabile sia per gli sforzi diagnostici clinici che per quelli di ricerca.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% EtOH	Fisher scientific	22-032-601
20 uL Filtered Pipette Tips	Opentrons	20uL tips
2mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-666-313	Alternate product may be used
Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells	Thermo Scientific	AB3384	Alternate product may be used
Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates	Fisher Scientific	50-828-743	For mastermix preparation
Clear PCR Sealing Sheets	Thermo Scientific	AB0558	Alternate product may be used
DPEC Treated Water	Ambion (Thermo Scientific)	AM9916
Flip Cap 50 mL Conical Tubes	VWR	75845-210	For sample collection
Foil PCR Sealing Sheets	Thermo Scientific	AB0626	For storage of mastermix plates, Alternate product may be used
HS_RPP30 Synthetic DNA	Integrated DNA Technologies	299788131	P1 positive control
Luna Buffer Probe One-Step Reaction	New England Biolabs	M3006B
Luna WarmStart RT Enzyme Mix	New England Biolabs	M3002B
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol	Integrated DNA Technologies	10006830
nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol	Integrated DNA Technologies	10006832	Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores
nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol	Integrated DNA Technologies	10006831
Opentron HEPA Filter Module	Opentrons	N/A	Not required, but useful to reduce contamination
Opentron Multichannel Attachment, P20	Opentrons	999-00005	For mastermix preparation
Opentron OT-2 Liquid Handling Robot	Opentrons	OT-2
Opentron Pipette Attachment, P20	Opentrons	999-0000215	For sample loading
Oven	Memmert	UF450 PLUS 208V-3PH
PCR Tubes (rnase, dnase free)	Fisher Scientific	14-230-225	For aliquots of positive and neg controls
PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)	VWR	10808-952
PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)	VWR	10808-956
RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol	Integrated DNA Technologies	10007062	Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore
RNAse P Forward Primer, 100nmol	Integrated DNA Technologies	10006836
RNAse P Reverse Primer, 100 nmol	Integrated DNA Technologies	10006837
Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2	Twist Biosciences	102024 / 103907 / 103909	N1 Positive Control
Scanners	Code	CR1500	Only required when scaling up
Small HEPA Filtered Hood	Erlab	Captair Bio 321	For mastermix preparation
Thermocycler CFX384 Touch	Biorad	CFX384 Touch	Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus
X-acto Knife Set	Staples	N/A	To cut foil for keeping control wells covered