Questo protocollo per un sistema di espressione proteica senza cellule ricombinanti, comunemente noto come sistema PURE, utilizza la coltura cellulare e la purificazione cellulare per semplificare le purificazioni proteiche richieste. Ciò riduce significativamente i requisiti di tempo e manodopera. Il metodo OnePot ha dimostrato di essere non solo conveniente, ma anche efficiente in termini di tempo.
Riduce i tempi di preparazione da diverse settimane a tre giorni lavorativi. Ciò rende la piattaforma PURE cell-free accessibile a più laboratori in tutto il mondo e aiuta a implementare questa piattaforma davvero potente per la biologia sintetica senza cellule. Prima di iniziare, assicurati che tutti i ceppi esprimano bene le rispettive proteine.
Per iniziare, preparare la colonna per la purificazione delle proteine OnePot come descritto nel manoscritto di testo usando due millilitri di resina di sefarosio, quindi caricare la colonna con solfato di nichel. Preparare le colture starter combinando 20 millilitri di media LB con 20 microlitri di ampicillina. Aggiungere 300 microlitri del mezzo in 35 pozzetti di una piastra sterile a 96 pozzi profondi.
Inoculare ciascuno di essi con il rispettivo ceppo, ad eccezione del fattore di allungamento termo instabile, o EFTU, e sigillare la piastra con una membrana traspirante. Per la coltura EFTU, inoculare tre millilitri di ampicillina contenente mezzi LB in un tubo di coltura da 14 millilitri con un tappo a scatto. Circa tre millilitri di cultura EFTU sono sufficienti per una cultura di espressione OnePot.
Incubarlo a 37 gradi Celsius mentre scuote a 260 rotazioni al minuto durante la notte. Il giorno dopo, trasferire 500 millilitri di supporti LB e 500 microlitri di ampicillina nel pallone sterile sconcertato. Inoculare la coltura OnePot PURE con 1.675 microlitri della coltura EFTU e 55 microlitri di ciascuna delle colture dalla piastra del pozzo profondo.
Incubare la coltura per due ore a 37 gradi Celsius con uno scuotimento di 260 rotazioni al minuto, o fino a quando la densità ottica della coltura raggiunge da 0,2 a 0,3. Indurre la coltura con 500 microlitri di IPTG 0,1 millimolari e crescere per altre tre ore. Raccogliere le cellule per centrifugazione a quattro gradi Celsius e 3, 220 volte G per 10 minuti e conservare il pellet cellulare a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo.
Il terzo giorno, misurare le quantità di tamponi necessari per la loro purificazione e aggiungere TCEP a tutti loro come indicato nel testo. Conservare i buffer rimanenti senza TCEP a quattro gradi Celsius per future purificazioni. Equilibrare la colonna carica con 30 millilitri di tampone A.Dopo aver attraversato 25 millilitri di tampone A, chiudere la colonna dal basso.
Scongelare le celle e utilizzare una pipetta sierologica per risusciere il pellet cellulare in 7,5 millilitri di tampone A.Lyse le celle utilizzando una sonda da 130 watt. Se la sonicazione ha successo, la soluzione diventerà più scura. Assicurati di mantenere le cellule sul ghiaccio e posiziona la sonda abbastanza in profondità senza toccare il tubo.
Rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione a 21, 130 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius e mantenere il lisiato sul ghiaccio. Aggiungete il surnatante alla colonna equilibrata. Chiudi la colonna dall'alto e assicurati che non ci siano perdite.
Incubare la colonna per tre ore a quattro gradi Celsius in rotazione utilizzando un rotatore a tubo. Eluire i componenti non legati dalla colonna e lavare con 25 millilitri di tampone A.Lavare la colonna con 25 millilitri di tampone imidazolico da 25 millimolari. Eluire le proteine con cinque millilitri di tampone imidazolo da 450 millimolari e mantenere le proteine eluite sul ghiaccio in ogni momento.
Diluire l'eluato con 25 millilitri di tampone HT e mantenere la miscela su ghiaccio. Aggiungere 15 millilitri a un filtro centrifugo da 15 millilitri e concentrare fino a un volume di 1,5 millilitri. Aggiungere i restanti 15 millilitri al filtro con la soluzione concentrata e concentrare nuovamente a 1,5 millilitri.
Aggiungere 10 millilitri di tampone HT al campione concentrato e concentrare a un millilitro. Recuperare il campione concentrato e aggiungere una quantità uguale di buffer di riserva B e conservare a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Durante lo scambio del buffer, ripristinare la colonna come specificato nel testo.
Il quarto giorno, misurare la concentrazione proteica utilizzando il test bradford. Concentrare il campione con 0,5 millilitri di tre kilodalton cutoff filtro centrifugo a 20 milligrammi per millilitro. Verificare la composizione proteica onePot PURE utilizzando la pagina SDS.
Diluire 2,5 microlitri del campione con 7,5 microlitri di acqua miscelati con 10 microlitri di due tamponi X Laemmli, quindi caricare cinque microlitri e 2,5 microlitri dei campioni sul gel. Eseguire la pagina SDS come specificato nel testo. Inserisci la concentrazione e la lunghezza del DNA nelle corrispondenti cellule gialle nel foglio di calcolo usando da due a 10 nanomolari di DNA per la reazione.
Riempire il volume di reazione totale desiderato in microlitri. Rimuovere i reagenti necessari dal congelatore e scongelarli sul ghiaccio. Quindi, pipettare le quantità calcolate di acqua, DNA e soluzione energetica su un lato del tubo PCR o un angolo di un pozzo sulla piastra del pozzo 384.
Pipettare le quantità calcolate di proteine e soluzione di ribosomi all'altro lato di un tubo PCR o all'angolo opposto della piastra del pozzo 384. Ruotare per circa 30 secondi per unire i componenti della reazione. Per evitare l'evaporazione durante gli esperimenti con il lettore di lastre, aggiungere 35 microlitri di cera liquida e sigillare la piastra con un sigillante trasparente.
Incubare per un minimo di tre ore a 37 gradi Celsius. Per la lettura su un lettore di lastre, misurare l'intensità di fioritura alla lunghezza d'onda richiesta ogni due minuti. La sovraespressione di successo in tutti i singoli ceppi utilizzati successivamente per la preparazione proteica OnePot è mostrata qui.
La composizione complessiva della soluzione proteica finale onePot PURE è stata analizzata dalla pagina SDS. È evidente che EFTU è presente in una concentrazione più elevata rispetto alle altre proteine, come previsto. I rendimenti di sintesi della soluzione proteica OnePot combinati con i ribosomi His-tagged o non-tagged sono stati analizzati monitorando la fluorescenza eGFP nel tempo.
I livelli di espressione di tre diverse proteine etichettate utilizzando il sistema di etichettatura in vitro tRNA della lista verde, o colorazione Kumasi, sono stati analizzati su un gel di pagina SDS. Per un sistema PURE funzionale, è assolutamente fondamentale che tutti i ceppi esprimano bene le rispettive proteine. Questa tecnica facilita l'implementazione del sistema PURE all'ingegneria del sistema biologico, consentendo lo sviluppo di nuove reti genetiche, diagnostica molecolare, terapie e kit educativi.
