La preparazione standard del campione rende difficile ottenere un buon segnale-rumore durante gli esperimenti di diffrazione a raggi X dei microcristalli. Questo protocollo mira a ridurre le fonti di cristalli formati dallo sfondo in modo controllato. L'uso della robotica di congelamento dei punzoni e delle griglie crioTEM fornisce una solida piattaforma per manipolare ripetutamente i microcristalli, riducendo il volume del liquido circostante e fornendo una rapida vetrificazione del campione.
La destrezza necessaria per gestire le griglie è simile a quella necessaria per la tradizionale raccolta dei cristalli. Un altro fattore importante è la determinazione dei parametri iniziali di blotting utilizzando la soluzione di cristallizzazione, che è la chiave per ridurre l'utilizzo del campione. Per iniziare, impostare e raffreddare il congelatore a immersione automatica secondo le istruzioni del produttore.
Poco prima dell'uso, scaricare le griglie crioTEM per 25 secondi con una corrente di 15 milliampere e una pressione di 0,39 millibar, quindi mantenere le griglie di scarico del bagliore in una capsula di Petri coperta. Impostare l'umidità relativa della camera del campione al 90% e il tempo di blotting a cinque secondi. Assicurarsi che il congelatore a immersione sia impostato in modo da immergere automaticamente il campione al termine del blotting.
Aprire il sigillo del pozzo di cristallizzazione e del serbatoio. Aggiungere rapidamente da due a cinque microlitri della soluzione del serbatoio nella goccia di cristallo per mantenere il volume della goccia. Trasferire 10 microlitri della soluzione del serbatoio in un tubo da 0,5 millilitri per un uso successivo e richiacciare il pozzo per evitare che la goccia di cristallizzazione si secchi.
Utilizzare la pinna di congelamento a tuffo per scegliere una singola griglia di scarico a bagliore e caricare la griglia nello strumento con il lato in carbonio rivolto lontano dal braccio di blotting. Ruotare la pinna tenendo la griglia in modo che il lato in carbonio sia rivolto verso il braccio di blotting. Utilizzare una pipetta da 2,5 microlitri per applicare due microlitri di soluzione di serbatoio sul lato non di supporto della griglia crioTEM.
Ruotare la griglia con il lato in carbonio rivolto verso l'altro dal braccio di blotting e applicare con attenzione il liquido del serbatoio sul lato di supporto del film di carbonio della griglia. Avviare il processo di blotting e osservare il liquido prelevato dalla superficie del carbonio fino a quando l'onda di popping attraverso la superficie della griglia è visibile. Se l'ondata di popping non è visibile, aumentare il tempo di blotting di uno o due secondi prima che il braccio di blotting si ritiri dalla griglia.
Posizionare la piastra di cristallizzazione sotto il microscopio ottico e posizionare il bersaglio ben all'interno del campo visivo. Posizionare una griglia di scarico a bagliore fresco nel congelatore a tuffo e applicare il liquido del serbatoio sul lato non di supporto della griglia, come precedentemente dimostrato. Ruotare la griglia con il lato di supporto del film di carbonio rivolto verso la porta campione del congelatore a immersione.
Staccare la guarnizione temporanea dalla piastra di cristallizzazione e utilizzare la pipetta impostata su due microlitri per aspirare delicatamente la goccia di cristallizzazione ripetutamente. Trasferire due microlitri del liquame microcristallino aspirato al congelatore a tuffo e applicare tutto il campione sul lato carbonio della griglia crioTEM. Inizia il blotting e osserva l'ondata di popping, quindi avvia immediatamente il congelamento del tuffo.
Trasferire rapidamente la griglia dall'etano liquido alla scatola della griglia immersa nell'azoto liquido. Dopo aver tamponato e immerso il congelamento della griglia, ritrarre la griglia immersa dall'etano liquido ripristinando il congelatore a tuffo. Rimuovere la pinca che tiene la griglia dal congelatore a tuffo e posizionare la griglia sotto il microscopio ottico.
Regola la messa a fuoco fine e valuta la densità dei cristalli attraverso la griglia. Dopo aver caricato la griglia crioTEM nel SEM, allineare il campione e accendere il fascio di elettroni. Inizialmente valutare l'intera griglia con un ingrandimento di 45X e registrare l'immagine, quindi aumentare l'ingrandimento per un'ispezione più ravvicinata dei singoli quadrati della griglia fino a quando i singoli cristalli non sono chiaramente osservati.
Muoviti intorno alla griglia e cattura le immagini fisse, assicurandoti che le griglie siano piatte e che la pellicola di supporto in carbonio sia in gran parte intatta. Assicurarsi che ci siano numerosi cristalli singoli con uno stretto alone di liquido vetrificato che circonda il cristallo e che i fori siano visibili nel film di supporto in carbonio. Mentre osservi e catturi le immagini della griglia, assicurati che le grandi regioni di liquido vetrificato siano assenti, che il ghiaccio esagonale o il ghiaccio superficiale non siano sparsi sulla griglia e che i cristalli non si sovrappongano e non siano distribuiti uniformemente sulla pellicola di supporto.
In un dewar di schiuma di grandi dimensioni, raffreddare il numero richiesto di portaes campioni VMXm caricati nella cartuccia del campione. Aggiungere azoto liquido sopra la posizione del campione nel caricatore del campione. Trasferire rapidamente la scatola della griglia contenente griglie caricate con microcristalli nella rientranza della scatola della griglia sul caricatore del campione e svitare leggermente il coperchio per mantenere il coperchio allentato e ruotabile.
Sollevare la griglia dalla casella della griglia e ruotare la griglia per posare la griglia piatta sul supporto del campione. Posizionare rapidamente lo strumento circlip pre-raffreddato sulla griglia nell'apertura della griglia e premere il pulsante per installare il circlip. Aggiungere azoto liquido a circa 1,5 centimetri sopra il portase campioni.
Utilizzare la pinza campione VMXm per sollevare con attenzione il portaes campioni caricato e ricollegarlo nella cartuccia campione. Sostituire il coperchio della cartuccia, assicurandosi che il perno sulla parte superiore della cartuccia si innesti con il foro nel coperchio. Le micrografie elettroniche a scansione di microcristalli preparati su griglie crioTEM hanno mostrato una dispersione di fondo minima.
La griglia era priva di liquidi in eccesso e uno stretto alone di liquido è stato osservato intorno ai cristalli. I cristalli poliedrici sono stati osservati individualmente e in ciuffi. I cristalli di insulina leggermente più grandi hanno anche mostrato alcuni raggruppamenti insieme a cristalli isolati.
Anche microcristalli molto grandi sono stati montati con successo su griglie crioTEM. I fori nel film di supporto in carbonio erano chiaramente visibili, indicando un forte blotting. Molti campioni hanno richiesto un'ulteriore ottimizzazione a causa della variazione del tempo di blotting e della concentrazione dei microcristalli.
Le griglie sovraccariche di cristalli riducono l'efficienza di blotting e più reticoli sono stati registrati in una singola immagine di diffrazione. Un breve tempo di blotting per soluzioni di cristallizzazione altamente viscose può causare un campione eccessivamente bagnato. Per una soluzione di cristallizzazione a viscosità inferiore, un breve tempo di blotting provoca il furto di microcristalli su un lato delle griglie.
La preparazione ottimale dei campioni consente di sfruttare tutte le funzionalità di VMXm per raccogliere dati di diffrazione a raggi X di alta qualità alla massima risoluzione possibile con un elevato rapporto segnale-rumore. Determinare il blotting iniziale di una soluzione di cristallizzazione è la chiave per utilizzare un campione minimo. Se il campione è molto limitato, saltare la valutazione della densità.
In definitiva, è meglio avere un campione diluito. Questi campioni sono ora pronti per esperimenti di diffrazione a raggi X presso la VMXm Beamline, diffrazione elettronica microcristallina o fresatura a fascio iodico focalizzato prima della micro ED.
