<html> Qui discutiamo le procedure sperimentali che sono coinvolti nella LUCAS [1-3]. Per illustrare la prova del concetto di LUCAS verrà descritto il processo di imaging per un campione di sangue intero. A. Imaging Set-up La piattaforma LUCAS Imaging presenta notevoli vantaggi per fornire un&#39;alternativa conveniente e compatto agli attuali point-of-care citometria e strumenti di diagnostica medica, soprattutto per le risorse limitate. Invece di rilevare l&#39;immagine delle celle, LUCAS cattura invece ologrammi digitale delle cellule che vengono creati dalla interferenza della luce diffusa da ogni cellula con la luce dello sfondo. Attento controllo della coerenza parziale spaziale della luce è fondamentale per attivare la registrazione olografica. 1. Sensore Array digitale La piattaforma LUCAS utilizza una matrice di sensori optoelettronici per la registrazione digitale ologrammi singola cella. A tal fine, pagano due dispositivi (CCD; modelli di esempio: KAI-11002, KAF-39000, da Kodak) o Complementary Metal-Oxide Semiconductor chip (CMOS, Modello Esempio: MT9P031, Micron) possono essere utilizzati. Le dimensioni dei pixel per il Kodak carica dispositivi coppia, KAI-11002, KAF-39000, e sensori di immagini CMOS Micron sono 9 micron, 6,8 micron e 2,2 micron, con un FOV attivo di 10 cm2, 18 cm2, e il 24,4 mm2, rispettivamente. [1-2]. 2. Fonte di luce A differenza di molti altre modalità di imaging microscopico, LUCAS non necessita di un laser e quindi anche un semplice diodo ad emissione luminosa (LED) può essere utilizzato per l&#39;illuminazione. Al fine di consentire l&#39;illuminazione regolabili lunghezza d&#39;onda, possiamo anche utilizzare un monocromatore con una lampada allo xeno (Cornerstone T260, Newport Corp.) insieme ad uno standard di qualità in fibra di silice fusa che consiste in un fascio di fibre (77.564, Newport) e foro stenopeico di ~ diametro di 100 micron trova in ~ 5-10 cm sopra la superficie del sensore. Questo parametro sintonizzabile configurazione illuminazione lunghezza d&#39;onda fornisce una piattaforma flessibile in cui le firme olografica delle cellule può essere regolata, e ibridi firme digitali possono essere sintetizzati per migliorare il rapporto segnale-rumore per una precisione migliore caratterizzazione e la specificità. [3] B. Preparazione del campione e Imaging Un proof of concept di LUCAS basati su chip di imaging sarà dimostrata utilizzando una soluzione eterogenea come descritto di seguito. Un protocollo simile potrebbe essere applicata per vari altri tipi di cellule [1-3]. 1. Diluizione del sangue intero e preparazione della soluzione eterogenea <ol><li> Per iniziare il processo, ottenere un campione di sangue intero e microsfere di polistirolo di vari diametri (micron 5, 10, e 20. Duke scientifico), e portare tutti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2 ml di RPMI 1640 liquidi classico (Fisher Scientific) come diluente in una sterile 5 ml tubo in polipropilene. </li><li> Dopo l&#39;incubazione del campione di sangue intero per 30 minuti, pipetta fino a 10 ml di eritrociti sedimentati campione e trasferirlo nella soluzione RPMI. </li><li> Aggiungere un volume totale di 20 microlitri microsfere di polistirolo in eritrociti diluizione RPMI, e agitare la soluzione delle cellule pipettando gentilmente o con agitatore magnetico con ancoretta. </li><li> Posizionare un volume totale di 5-15 ul di soluzione eterogenea su una copertina slip e un secondo posto, scivolare identica copertura rispetto alla soluzione utilizzando pinze. Il campione deve essere inserita tra i due coprioggetto in modo uniforme. </li><li> Quindi, utilizzando una penna a vuoto (NT57-636, Edmund Optics) caricare il campione attraverso la regione attiva della matrice di sensori per l&#39;imaging. </li></ol> 2. Sangue colorazione intero <ol><li> A partire dalla preparazione di una miscela di 0,1% tamponata eosina Y e una soluzione diluita di metilene New sfruttando l&#39;energia di tipo puro eosina Y (PM = 691,85, Acros Organics), senza zinco puro New colorante blu di metilene (PM = 347,90, Acros Organics), e Monoidrato di ossalato di potassio (ACS reagente 99,0%, Acros Organics), ogni soluzione è purificato con una dimensione di 0,45 micron pori Syringless filtro (Whatman) per acquosa colorazione dei globuli bianchi. </li><li> Poi, mescolare delicatamente un reagente sciolto colorazione acquosa con il campione di sangue intero con un rapporto 1:1 in volume di un bicchiere in polipropilene utilizzando un agitatore magnetico per 2 minuti e incubare per 10 minuti. </li><li> Trasferire una soluzione macchiato del sangue di 50 microlitri in un tubo di polipropilene 5 ml e diluire con RPMI 1640 classica soluzione liquida (Fisher Scientific) di 1,95 ml di acquisire un rapporto tra volume di 1:200. Poi, il vortice di diluizione per 30 secondi. Un tasso di diluizione diverse possono essere introdotti anche in questa fase. </li><li> Pipettare una soluzione macchiato cellula di 10-100 microlitri tra coprioggetto o all&#39;interno di un serbatoio microfluidica. Quindi, utilizzando una penna a vuoto (NT57-636, Edmund Optics), posto il campione sulla zona attiva di matrice di sensori. </li></ol> RAPPRESENTANTE RISULTATI ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1: LUCAS consente il conteggio accurato digitale e la differenziazione di cellule diverse e micro-oggetti in base alla loro firme 2D olografica senza l&#39;uso di lenti, laser o altri componenti ottici ingombranti. Caratteristica firme LUCAS di vari micro-oggetti sono illustrati in questa figura e sono confrontati con un microscopio convenzionale immagine ottenuta con una lente obiettivo 40X. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1650/1650Fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (a sinistra) l&#39;immagine raw di una miscela eterogenea contenente i globuli rossi, 10um, 5um e 3 particelle um. (Destra) completamente automatizzato LUCAS risultati di caratterizzazione per lo stesso campo di vista sono illustrati. Si noti che l&#39;algoritmo di decisione è solido nel caratterizzare le regioni ad alta densità così come particelle con basso rapporto segnale rumore, come le perline 3um. <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /> Figura 3: L&#39;interfaccia LUCAS personalizzato è illustrato. LUCAS software basato su Java permette ingressi per le varie condizioni sperimentali, quali le dimensioni dei pixel del sensore o la lunghezza d&#39;onda della luce. Selezione di uno specifico campo di vista l&#39;immagine può anche essere fatte e gli schemi delle cellule bersaglio può essere definita dall&#39;utente per costruire una biblioteca di statistica ombra delle cellule. L&#39;immagine acquisita LUCAS possono essere caratterizzati sulla base di questi dati di formazione (ad esempio, la biblioteca ombra delle cellule) e la marcata (contati) immagine viene visualizzata per l&#39;utente. Le statistiche dei risultati contano sono inoltre memorizzate in un file XML per ulteriori analisi.

<ol>
	<li>Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Lensfree+Holographic+Imaging+for+On-Chip+Cytometry+and+Diagnostics".">"Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics".</a> Lab Chip. , (2009).</li><li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="High-throughput+Imaging+and+Characterization+of+a+Heterogeneous+Cell+Solution+on+a+Chip"+.">"High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" .</a> Biotechnology and Bioengineering. , (2008).</li><li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Multi-color+LUCAS:+Lensfree+on-chip+cytometry+using+tunable+monochromatic+illumination+and+digital+noise+reduction".">"Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction".</a> Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).</li></ol>

Abbiamo mostrato che la piattaforma LUCAS può contare e identificare con precisione micro-objects/cells varie su un chip in base alla loro firma olografica, e fornisce uno strumento promettente per point-of-care diagnostica medica e high-throughput di biologia cellulare. Al fine di elaborare con precisione gli schemi registrato olografica, abbiamo implementato una custom-software sviluppato decisione LUCAS. Questo algoritmo, che utilizza un database di immagini di diffrazione statistica creata da formazione di immagini...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Charged couple device (CCD)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KODAK</td>
<td>KAI-11002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Charged couple device (CCD)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KODAK</td>
<td>KAF-39000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Micron</td>
<td>MT9P031</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenon Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport Corp.</td>
<td>Cornerstone T260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edmund Optics</td>
<td>NT57-636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5, 10, and 20 &mu;m Microbeads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>4000 Series</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pure Eosin Y</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>MW=691.85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>New Methylene Blue(NMB) Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>MW=347.90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Oxalate Monohydrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>99.0% Reagent ACS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

lensless on-chip imaging of cells provides a new tool for high-throughput cell-biology and medical diagnostics

Tradizionali microscopi ottici celle di immagine mediante l&#39;uso di lenti dell&#39;obiettivo che lavorano insieme con altri obiettivi e componenti ottici. Anche se molto efficace, questo approccio classico ha alcune limitazioni per la miniaturizzazione della piattaforma di imaging per renderlo compatibile con lo stato avanzato dell&#39;arte in microfluidica. In questo rapporto, vi presentiamo i dettagli sperimentali di una senza lenti on-chip concetto di imaging chiamata LUCAS (<strong<em&gt; L</em</strong&gt; Ensless<strong<em&gt; U</em</strong&gt; LTRA-ampio campo di vista<strong<em&gt; C</em</strong&gt; Ell monitoraggio<strong<em&gt; A</em</strong&gt; Rray piattaforma basata su<strong<em&gt; S</em</strong&gt; Hadow imaging) che non richiede alcuna obiettivi microscopio o altri componenti ottici ingombranti per l&#39;immagine di una soluzione eterogenea di cellule nel corso ultra-ampio campo di vista che può estendersi a grandi come ~ 18 centimetri<sup&gt; 2</sup&gt;. Inoltre, a differenza dei microscopi tradizionali, LUCAS può immagine una soluzione eterogenea di cellule di interesse su una profondità di campo di ~ 5 mm senza la necessità di riorientare che corrisponde a un massimo di ~ 9 ml del campione. Questa piattaforma di imaging registra le ombre (cioè, senza lenti ologrammi digitali) di ogni cella di interesse all&#39;interno del suo campo visivo, e automatizzata elaborazione digitale di queste ombre delle cellule in grado di determinare il tipo, il numero e le posizioni relative delle celle all&#39;interno della soluzione. Perché non richiede alcun componente ingombranti optical o meccanico fasi di scansione offre una piattaforma di dimensioni decisamente miniaturizzato che al tempo stesso di ridurre i costi, il che è molto importante soprattutto per i punti di assistenza strumenti diagnostici. Inoltre, la velocità di imaging di questa piattaforma è ordini di grandezza maggiore rispetto ai tradizionali microscopi ottici, che potrebbe essere estremamente utile per high-throughput di biologia cellulare, esperimenti.

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Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

Lensfree on-chip di imaging e caratterizzazione di cellule è illustrata. Questo approccio on-chip di imaging cellulare fornisce uno strumento compatto e conveniente per la diagnostica medica e applicazioni ad elevato throughput biologia cellulare, che lo rende particolarmente adatto per le impostazioni delle risorse poveri.

Senza lenti on-chip Imaging di celle fornisce un nuovo strumento per High-throughput Cell-Biologia e diagnostica medica

Conventional optical microscopes image cells by use of objective lenses that work together with other lenses and optical components. While quite ...

lensless-on-chip-imaging-cells-provides-new-tool-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Views.  University of California, Los Angeles. Lensfree on-chip di imaging e caratterizzazione di cellule è illustrata. Questo approccio on-chip di imaging cellulare fornisce uno strumento compatto e conveniente per la diagnostica medica e applicazioni ad elevato throughput biologia cellulare, che lo rende particolarmente adatto per le impostazioni delle risorse poveri.