Sono grato a Ronald L. Calabrese, Dieter Jaeger (Emory University) e Ward Yuhas (Axon Instruments) per utili discussioni tecniche.

<ol><li> Sezioni di cervello ipotalamici sono preparati, incubate e trasferiti alla camera di registrazione come precedentemente dettagliato (9) negli animali il cui neuroni GnRH esprimere una proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore peptide GnRH (10). Dopo la rimozione del cervello dall&#39;animale, il cervello è bloccato con una lama di rasoio per eliminare le regioni che non sono di interesse. Al fine di determinare le regioni di rimuovere, il cervello è posto sulla sua superficie dorsale in modo che l&#39;ipotalamo possono essere visualizzati. Per entrambi gli orientamenti fetta coronale e sagittale, il cervelletto viene rimosso. Per la preparazione fetta coronale, la porzione rostrale della corteccia è stato rimosso. In questo orientamento fetta, le regioni della corteccia laterale forniscono il supporto per affettare il cervello e fornire spazio sufficiente di cervello per il posizionamento di fili d&#39;argento per proteggere il cervello nella camera di registrazione. Per la preparazione fetta sagittale, le regioni laterali del cervello vengono rimossi e la parte rostrale della corteccia fornisce il supporto per il cervello affettare e per il posizionamento di fili d&#39;argento per proteggere il cervello nella registrazione bene. Nel corso della procedura di blocco, il cervello è continuamente inumidito con il freddo liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) usando una pipetta di vetro. </li><li> Una piccola quantità di colla è posto sulla piattaforma di taglio. Il cervello viene sollevato con una spatola. ACSF eccesso viene rimosso da portare un Kimwipe alla superficie della spatola e il disegno ACSF in eccesso dal cervello. Il cervello è dolcemente scivolare in avanti sulla colla. E &#39;importante non toccare il cervello o spingere verso il basso su di esso per fissarlo. Il peso del cervello stesso è solitamente sufficiente per assicurarsi che sia sicuro. </li><li> Il cervello e la piattaforma di taglio è poi fissato per il microtomo vibrante e il taglio bene è pieno di freddo ACSF. La soluzione fredda entrambe le aziende il cervello e può proteggere da eventuali danni durante la procedura di taglio. Differenti regioni del cervello variano nel grado di freddezza che ottimizza fette di qualità. La temperatura del ACSF per la preparazione di fette ipotalamo è generalmente 0 ° C. </li><li> Fette devono essere tagliate ogni fetta lentamente e dovrebbe fluttuare liberamente lontano dal cervello. Se le slice cominciano ad arricciarsi durante il taglio, la velocità con cui avanza la lama deve essere rallentato. Si può utilizzare un piccolo pennello di vernice a fette uncurl ma questo non rischia di danneggiare le fette e, quindi, dovrebbe essere evitato. Lentamente, la velocità di avanzamento della lama è preferibile usare un pennello. </li><li> Come ogni fetta è tagliato dal cervello, si è ritirato dalla camera di taglio e posto in una camera di incubazione fetta in un bagno di acqua calda (circa 32 ° C). La fetta incubatore è continuamente fornito con l&#39;ossigeno con una miscela di 95% O 2 e il 5% di CO 2. In generale, pre-registrazione va incubazione fetta da 30 minuti a 2 ore. </li><li> Pipette di vetro (3-6 MΩ) sono realizzati come descritto in precedenza (9) con un estrattore verticale. La temperatura e la durata della trazione varia in base al tipo di pipetta estrattore si usa, il tipo di vetro si usa e la durata del filamento di riscaldamento l&#39;estrattore. La forma del puntale può anche variare a seconda delle preferenze dell&#39;utente. Abbiamo raggiunto un buon successo con una punta uniformemente conica con un&#39;apertura di 0,1 mm. Grandi aperture nella pipetta tendono a danneggiare i neuroni, mentre le aperture più piccole non riescono a portare a registrazioni di lunga durata. </li><li> Pipette rivestito con Sylgard per ridurre la capacità. Puntali sono leggermente tirato rivestiti con Sylgard 184 con una pipetta secondo. Suggerimenti Sylgarded sono poi calore curato con una pistola di calore. Queste pipette vengono poi riempite con il perfusato bagno. Per aumentare la visualizzazione dei puntali, una piccola quantità di Alexa-568 si aggiunge alla parte della soluzione da bagno da utilizzare come soluzione pipetta prima di riempire le pipette. Noi non pesare i Alexa-568, ma piuttosto l&#39;uso abbastanza per girare la rosa soluzione ad occhio. Il puntali possono poi essere visualizzate sotto il filtro rosso Texas. </li><li> Abbiamo sviluppato un approccio per ottenere corrente-clamp registrazioni per l&#39;individuazione di potenziali d&#39;azione con guarnizioni a bassa resistenza (vedi Discussione). Le registrazioni vengono effettuate a potenziale endogeno di riposo della cellula con Axoclamp 2B non applicata attuale Strumento Axon utilizzando il. Tuttavia, a causa della tenuta bassa resistenza, non in grado di rilevare potenziali d&#39;azione con il solo amplificatore 2B. Per aumentare il segnale, un secondo amplificatore (AM Sistemi 3000) viene utilizzato in serie con la 2B Axoclamp. Questo approccio ha la facilità di foche sciolti e l&#39;utilità di lungo periodo delle registrazioni. Tecnicamente, si può misurare direttamente i potenziali di azione, aggirando in tal modo i problemi con l&#39;approccio del voltage-clamp modalità di registrazione (vedi Discussione). </li><li> Si prende due pipette alla superficie dei due neuroni selezionati in precedenza allo stesso tempo, in modo simile come approccio per l&#39;intera configurazione di registrazione delle cellule. Avvicinandosi entrambi neurons allo stesso tempo è stato più riuscito ad ottenere le registrazioni duale che tentare ogni neurone della coppia in modo indipendente. Durante questo tempo, gli impulsi di iniezione di corrente sono passati da amplificatore 2B come si fa durante l&#39;avvicinamento per intero a cellule registrazioni. </li><li> Pressione positiva deve essere mantenuta da entrambe le pipette per evitare l&#39;intasamento della punta. Pressione positiva per le registrazioni duale è meglio generata utilizzando un vuoto non riempito siringa da 3 ml legata al titolare pipettare con una lunghezza del pezzo di tubo. Utilizzando siringhe permette di mantenere la pressione su entrambe le pipette. Pressione positiva dovrebbe essere applicato non appena la pipetta è stata posta nella soluzione bagno della camera di registrazione. Ci si avvicina alla neuroni selezionati con le pipette in modo sequenziale. Dopo aver posizionato la pipetta prima direttamente sopra la più grande superficie del neurone, si mantiene positivo da parte lasciando la siringa in posizione e lascia la pipetta in questa posizione. Si ritorna poi alla cima della camera di registrazione e abbassa la pipetta secondi di registrazione in posizione. Neuroni selezionati sono spesso a diversi livelli della fetta. La pipetta primo dovrebbe essere posizionato sopra il neurone che è più profondo nella fetta e posizionare la pipetta secondo al neurone più superficiali. Questo impedisce il posizionamento della pipetta secondo dal spostando il posizionamento della pipetta secondo come la fetta si sposta leggermente sul piano verticale come pipette inserire la fetta. </li><li> Guarnizioni allentate (18-30 MΩ) verrà utilizzato. La pressione positiva indurrà una piccola fossetta sulla superficie di ogni cellula. Un tentativo di sigillare il primo neurone rilasciando pressione positiva e applicando molto lieve pressione negativa. La pressione positiva viene rilasciato rimuovendo la siringa. Aspirazione per via orale viene poi applicato alla estremità libera del tubo. Membrana Un neurone sano che rispondere rapidamente al rilascio di pressione positiva e di aderire alla pipetta. Aspirazione leggera formerà un sigillo con resistenza appropriata in un neurone sano. </li> <li> Quando si tenta di sigillare un neurone e non riesce, la pipetta non può essere riutilizzato dal membrane solo sigillo per pulire molto vetro. Invece, si solleva la pipetta (e obiettivo microscopio) di distanza dalla superficie della fetta nella parte superiore della perfusione bene, toglie la pipetta dal bagno, si trasforma in una pipetta pulita e poi torna alla fetta per tentare di sigillare un&#39;altra cella . Per queste ragioni, è importante per selezionare più neuroni potenziale per le registrazioni. Per le fette con neuroni di registrazione meno di 4-6 qualità tra cui scegliere, il successo ad ottenere le registrazioni doppio è limitata. </li><li> Dopo aver stabilito un sigillo sciolto in base alla resistenza, gli impulsi di iniezione di corrente dall&#39;amplificatore 2B sono terminati. L&#39;amplificatore 2B è posto in serie con l&#39;amplificatore serie 3000. In questa configurazione, l&#39;uscita del amplificatore 2B serve come ingresso per l&#39;amplificatore serie 3000. L&#39;amplificatore Quest&#39;ultimo fornisce il segnale per l&#39;acquisizione dati. </li><li> La tenuta (punto 4) e la riconfigurazione di amplificatori (punto 5) viene quindi ripetuto per il neurone secondo. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1678/1678fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. Un periodo di maggiore cottura in due neuroni a piede libero con GnRH configurazione di registrazione allegata sigillo in un preparato fetta sagittale. La fetta è stata derivata da un maschio castrato. Ogni deviazione verso l&#39;alto indica un potenziale d&#39;azione. Si noti che un neurone GnRH (traccia in alto) mostra cottura quasi continuo, mentre il secondo neurone GnRH presenta scoppi intermittenti. Questo modello di attività di singoli neuroni GnRH è simile a quella di singole unità estratte da più unità registrazioni durante la secrezione dell&#39;ormone in vivo (7). Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1678/1678fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1.

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L&#39;attività di interesse in alcuni neuroni compresi i neuroni GnRH (basato sulla secrezione ormonale) si verifica su scale di tempo di ore (5-7). Pertanto, la configurazione di cellula intera non è la scelta migliore per alcuni obiettivi sperimentali a causa della dialisi di messaggeri intracellulari in modalità intera registrazione delle cellule. Secondariamente, a cellula intera registrazioni sono generalmente limitata agli animali meno di circa 120 giorni di età. Con l&#39;età, membrane neuronali sembrano irrigidirsi, rendendo guarnizioni ad alta resistenza difficile da raggiungere. Inoltre, se si ottiene un sigillo ad alta resistenza, rompendo la patch rompe il sigillo, lasciando un buco tra la pipetta e la membrana. Questo porta ad una registrazione inutilizzabile e un neurone che presto morirà a causa di squilibri ionici. Cicli ovarici normali e, quindi, l&#39;attività stabile del generatore di impulsi GnRH non si verifica fino a quando nel corso della vita (7-10 mesi di età in C57Bl6 femmine, 11, 12), oltre l&#39;età in cui si può ragionevolmente prevedere di ottenere cellule intere registrazioni affidabile. Infine, a cellula intera registrazioni distruggere i rapporti endogena di concentrazioni di ioni interne ed esterne. Con le registrazioni cellula intera, la concentrazione interna di ogni ione è uguale alla concentrazione dello ione nella soluzione pipetta. Questo perché il volume della soluzione di pipetta è relativamente grande raggiunge rapidamente l&#39;equilibrio con / sostituisce il volume relativamente piccolo endogena della cellula. L&#39;approccio delle cellule perdere attaccato aggira molte delle limitazioni di cellule intere registrazioni. In primo luogo, una tenuta bassa resistenza (15-30 MΩ) può essere utilizzato. Queste sono relativamente facili da formare, anche nei neuroni di animali più vecchi. In secondo luogo, non si rompe la patch di membrana sigillata. Pertanto, le registrazioni delle cellule perdere allegato sono tecnicamente molto più facile rispetto a cellule intere registrazioni. Inoltre, poiché la membrana cellulare è intatto, la dialisi di componenti intracellulari non si verifica e endogeni rapporti ionici sono conservati. Non si può utilizzare l&#39;approccio sciolto cellulare attaccato per studiare le correnti sinaptiche, ma è l&#39;ideale per le registrazioni a lungo termine da parte dei neuroni in maniera relativamente non invasiva. La cellula-attached registrazioni possono essere eseguite anche utilizzando qualsiasi soluzione standard intracellulare nella pipetta. Questo offre l&#39;ulteriore vantaggio di rottura della patch membrana quando la registrazione a lungo termine è completato e l&#39;etichettatura del neurone con un marcatore intracellulare. L&#39;approccio delle cellule perdere allegato è stato utilizzato in voltage-clamp modalità di registrazione. Tuttavia, voltage-clamp registrazione nella configurazione della sciolto attaccato ha diversi problemi metodologici. In primo luogo, il segnale registrato è una misura indiretta di attività. Il segnale che viene misurato (come la cosiddetta azione in corso) è la corrente capacitiva, che spese la membrana (13). Si tratta di una questione estremamente importante metodologico. La capacità e la resistenza di una pipetta di registrazione in grado di filtrare il segnale registrato. E &#39;molto probabile che le correnti piccola azione si perdono nella carica la capacità della pipetta che, non possono essere adeguatamente compensata con maggior parte degli amplificatori, a causa della resistenza del headstage. Quando questi segnali non essere rilevati, il modello cottura apparente del neurone non riflette il vero modello di cottura. Allo stesso modo, non compensata pipetta e resistenze sigillo causare errori significativi nelle misurazioni durante i cambiamenti come quando le correnti di azione sono espressi (13). Alcuni amplificatori fornire capacità e della resistenza &quot;compensazione&quot; per la pipetta e la guarnizione, che limita la perdita di segnale, ma ad alta resistenza fasi capo della maggior parte degli amplificatori ostacolare compensazione ottimale. In secondo luogo, una situazione artificiale è imposto sulla cellula. In voltage-clamp modalità, l&#39;area intorno alla membrana cellulare è tenuto a un potenziale fisso, in questi studi, 0 mV. Questo non significa che non c&#39;è corrente applicata alla membrana cellulare. Il segnale misurato in voltage-clamp è in realtà la quantità di corrente applicata alla membrana per mantenere il potenziale fisso. Pertanto, questa corrente applicata può alterare l&#39;attività delle cellule. Registrazioni doppia nel sistema del GnRH sono particolarmente impegnativo a causa del numero limitato di neuroni GnRH e la loro distribuzione diffusa. Per le registrazioni doppio per avere successo, il manipolatore deve essere estremamente stabile. Anche leggero movimento degli elettrodi può causare la pipetta di scivolare fuori dal neurone e terminare la registrazione. Inoltre, il movimento della pipetta sulla cellula (per esempio, ri-posizionamento per compensare il movimento) possono alterare gli schemi di tiro. Alcuni canali ionici quali di tipo N canali del calcio sono meccanicamente sensibili: tratto membrana cause attività ripetitive in entrambe le configurazioni di registrazione intero-cellula e cellula-attached (14). Infine, il sistema manipolatore deve essere in grado di movimento estremamente sottile e liscia. Come notato sopra, con le registrazioni doppio, si prende due pipette alla superficie dei due neuroni selezionati in precedenza allo stesso tempo e cerca di sigillareun neurone. In caso di successo, poi si cerca di sigillare la seconda cella. In generale, non si può aspettare per sigillare e avere una registrazione di alta qualità con ogni tentativo. Questo, però, crea un problema particolare con le registrazioni doppio. Se uno è successo con il primo neurone ma non riesce con il secondo, si deve cambiare la pipetta e provare una cella diversa. Pertanto, si deve essere in grado di muoversi sia l&#39;obiettivo ad immersione del microscopio e la pipetta alla parte superiore della perfusione bene (per cambiare la pipetta) senza interrompere il neurone con successo sigillato. Il nostro sviluppo e l&#39;uso del cell-attached allentato per le registrazioni approccio duale è un importante progresso tecnico per lo studio dei neuroni GnRH. E &#39;in grado di produrre risultati utili che aiuteranno spostare il campo in avanti nel contesto della questione critica di quali meccanismi alla base delle attività coordinata che si traduce nella secrezione ormonale pulsatile.

dual somatic recordings from gonadotropin-releasing hormone (gnrh) neurons identified by green fluorescent protein (gfp) in hypothalamic slices

Gonadotropina-Releasing Hormone (GnRH) è un piccolo neuropeptide che regola liberazione ipofisaria di ormone luteinizzante (LH) e ormone follicolo-stimolante (FSH). Queste gonadotropine sono essenziali per la regolazione della funzione riproduttiva. Il GnRH contenenti neuroni sono distribuiti capillarmente in tutta l&#39;ipotalamo e il progetto per l&#39;eminenza mediana dove rilascio GnRH dai loro terminali degli assoni nel sistema portale hypophysiotropic (1). Nei capillari portale, GnRH viaggia alla ghiandola pituitaria anteriore di stimolare il rilascio di gonadotropine in circolazione sistemica. Rilascio del GnRH non è continua ma avviene invece in impulsi episodici. E &#39;ben noto che il modo intermittente del rilascio di GnRH è essenziale per la riproduzione (2, 3). Coordinamento delle attività dei neuroni GnRH più probabilmente alla base di impulsi di GnRH. Peptide contenuto totale in neuroni GnRH è di circa 1,0 pg / cell (4), di cui il 30% comprende probabilmente la piscina rilasciabili. I livelli di GnRH durante un impulso (5, 6), suggeriscono più neuroni GnRH sono probabilmente coinvolti in neurosecretion. Allo stesso modo, l&#39;attività singola unità estratto da ipotalamo multi-unità registrazioni durante LH rilascio indicano cambiamenti nell&#39;attività dei neuroni più (7). Gli elettrodi con attività registrate durante gli impulsi LH sono associati sia con somata GnRH o fibre (8). Quindi, almeno alcune di queste attività nasce da neuroni GnRH. I meccanismi che provocano la cottura sincronizzati nei neuroni GnRH ipotalamici sono sconosciuti. Chiarire i meccanismi che coordinano la cottura nei neuroni GnRH è un problema complesso. In primo luogo, i neuroni GnRH sono relativamente poco numerosi. Nei roditori, ci sono 800-2500 neuroni GnRH. Non è chiaro che tutti i neuroni GnRH sono coinvolti nel rilascio del GnRH episodica. Inoltre, i neuroni GnRH sono diffusamente distribuite (1). Questo ha complicato la nostra comprensione di coordinamento di cottura e ha fatto molti approcci tecnici intrattabile. Abbiamo ottimizzato perdere cellula-attached registrazioni in current-clamp modalità per la rilevazione diretta dei potenziali d&#39;azione e ha sviluppato un metodo di registrazione che permette di registrazioni simultanee da coppie di neuroni GnRH.

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Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

L&#39;attività in sistemi neuronali spesso richiede scariche azione sincrona potenziale da parte dei neuroni all&#39;interno di una popolazione specifica. Per esempio, gli impulsi di gonadotropina-releasing hormone (GnRH) probabilmente bisogno di una attività coordinata tra i neuroni GnRH. Vi presentiamo il nostro approccio metodologico affidabile per ottenere simultanea registrazioni elettrofisiologiche da neuroni diffusamente distribuite GnRH.

Doppio registrazioni somatica da Gonadotropina-Releasing Hormone (GnRH) Neuroni Identificato da una proteina fluorescente verde (GFP) in fette ipotalamici

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

dual-somatic-recordings-from-gonadotropin-releasing-hormone-gnrh

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

22.1K Views.  University of Texas San Antonio - UTSA. L'attività in sistemi neuronali spesso richiede scariche azione sincrona potenziale da parte dei neuroni all'interno di una popolazione specifica. Per esempio, gli impulsi di gonadotropina-releasing hormone (GnRH) probabilmente bisogno di una attività coordinata tra i neuroni GnRH. Vi presentiamo il nostro approccio metodologico affidabile per ottenere simultanea registrazioni elettrofisiologiche da neuroni diffusamente distribuite GnRH.

Video: Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

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Neuroscienze

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

La registrazione dell&#39;attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...