Finanziamento concesso dalla Southern Arizona Veterans Affairs Health Care sistema VA Merito Recensione concedere 0142 e Arizona Ricerca Biomedica Commissione concede 0803.

Preparazione tessuti per essere visualizzati su vetrini <ol><li> Un colonscopio possono essere passati nel colon attraverso il retto. Il colonscopio è un lungo tubo che ha illuminazione e una videocamera in testa, la capacità di passare l&#39;aria nel colon farlo saltare in aria come un pallone lungo per consentire una migliore visualizzazione del colon, e ha un passaggio per pinze da biopsia che può estendono oltre la videocamera per pizzicare fuori uno 3-5 zona millimetro di superficie interna della &quot;pelle&quot; o strato di mucosa del colon per darci un campione bioptico. Le pinze da biopsia può essere utilizzato anche per rimuovere potenzialmente pre-cancerose trovati polipi nel colon. </li><li> Abbiamo ottenuto normali biopsie di tessuti della mucosa del colon di pazienti, con il consenso informato. Questi pazienti sono stati sottoposti a una colonscopia di screening in una clinica gastrointestinale. Il nostro biopsie sono stati collocati in vasi di formalina. Dopo 4 ore, la formalina è stato sostituito dal 70% di alcol. </li><li> Campioni simili di tessuto sono stati prelevati da zone di resezione del colon, rimosso durante l&#39;intervento, che sono stati 1 cm e 10 cm di distanza da tumori del colon o adenomi con neoplasia in fase avanzata. Questi campioni di tessuto sono stati anche messi in formalina, e se i campioni di tessuto sono stati grandi, alcuni sono stati conservati in formalina per un periodo più lungo prima di essere immessi nel 70% di alcol. </li><li> I campioni di tessuto vengono portati in un laboratorio di istologia per essere elaborati e messi in blocchi di paraffina. </li><li> Blocchi di paraffina vengono raffreddati in un frigorifero per renderli più facilmente tagliata da un microtomo. </li><li> Sezioni di tessuto di 4 micron di spessore vengono tagliate dai blocchi del tessuto, utilizzando un microtomo, e galleggiare sull&#39;acqua. </li><li> Per confrontare l&#39;espressione di due proteine, per esempio ERCC1 e PMS2, si alternano sezioni di tessuto può essere ritirato su due slitte, fino a quando ci sono tre sezioni di tessuto su ciascuna delle due diapositive. Per esempio, sezioni 1, 3, e 5 possono essere immessi in una diapositiva etichettati ERCC1 e le sezioni 2, 4 e 6 può essere posizionato su una diapositiva etichettati PMS2. Avere tre sezioni di tessuto immunostained per una proteina su una singola diapositiva può permettere di vedere se un pattern di colorazione insolita di una cripta è un artefatto o è reale, dal momento che gli artefatti non si sarebbe ripetuto in più di una sezione di tessuto in una diapositiva. Cripte del colon sono circa 60 micron di diametro, in modo che circa il 15 sezioni di tessuto potrebbe essere ridotto attraverso una cripta, e la cripta stessa potrebbe essere vista su sezioni di tessuto più per vetrino. </li></ol> Immunostaining sezioni di tessuto <ol><li> I vetrini vengono poi sottoposti a procedura di etichettatura immunoistochimica. Si tratta di una procedura di 8 ore, ed è abbastanza standard. Le parti della procedura che usiamo, che non sono standard, sono l&#39;uso di contenitori Sequenza per la colorazione, e l&#39;uso di una soluzione per ridurre la colorazione di fondo chiamato &quot;Sniper&quot;. La soluzione &quot;Sniper&quot;, viene venduto come una formula brevettata da Biocare Medical, Concord CA. </li><li> Alcuni dei passi delle nostre procedure sono riportate qui. </li><li> A titolo di esempio, per PMS2 immunoistochimica, diapositive vengono prima deparaffinate mettendo in 3 cambi di xilene (3 minuti ciascuno), seguiti da 2 cambiamenti in 100% etanolo (2 minuti ciascuno), seguiti da 2 variazioni di etanolo al 95% (2 minuti ciascuno), seguiti da 2 cambi di acqua distillata (2 minuti ciascuno). Queste procedure sono svolte sotto una cappa chimica con pressione dell&#39;aria negativa in modo che lo sperimentatore non è esposto ai vapori. </li><li> Quando formalina è stato inizialmente utilizzato per fissare il tessuto, parti delle proteine ​​nel campione di tessuto divenne reticolato. Ora abbiamo bisogno di rompere i legami incrociati in modo che un anticorpo in grado di riconoscere la proteina di interesse. I vetrini sono posti in una soluzione tampone, che viene portato ad ebollizione in un forno a microonde. Questo è seguito da 10 minuti l&#39;impostazione media, seguito da un raffreddamento per 20 minuti in ghiaccio. Questo passo deve essere testato e regolato per microonde diversi, fino a quando si ottengono buoni risultati. Si noti che per immunocolorazione CcOI o Ku86 abbiamo usato un tampone citrato di sodio realizzati con 9 ml di acido citrico + citrato di sodio 41mL 450ml + H 2 O (un buffer tra gli ioni di sodio) che ha un pH di circa 6.0, per ERCC1 abbiamo usato un tampone citrato fatto con 2,1 g di acido citrico + 1 litro H 2 O + ~ 5 ml di idrossido di sodio per portare il pH a 6.1 (un buffer con un minimo di ioni di sodio aggiunto), e per PMS2 abbiamo usato una soluzione a base di soluzione 5mL Unmasking Antigen (da VECTOR) + 533mL H 2 O. Buffer differenti sono necessari per aumentare l&#39;interazione degli anticorpi con particolari epitopi di proteine. </li><li> I vetrini vengono poi messi in perossido di idrogeno al 3% (diluito in metanolo) per 20 minuti seguito da un risciacquo in acqua distillata per 3 minuti, e lavati in PBS (chiamato PBS) per 5 minuti. </li><li> Le diapositive vengono poi inseriti in rack colorazione piatta stretto chiamato Sequenza (Shandon sistema immunocolorazione Sequenza da Thermo Scientific) e sciacquati con PBS. </li><li> Le slide sono immunostained per ERCC1 o PMS2 vengono poi esposti a 10 minsce l&#39;esposizione ad un trattamento aggiunta di 3 gocce di una soluzione proprietaria, ottenuto da Biocare, chiamato &quot;Sniper&quot;, che agisce per ridurre la colorazione aspecifica di proteine ​​di fondo. </li><li> Le diapositive vengono sciacquati con un &quot;TBST&quot; tampone che è di 1 ml di Tween + 100 ml 10x Tris + 900 ml di acqua distillata [dove 10x Tris è pari al 24,2 grammi Trizma + 80 grammi di NaCl + 1.000 ml di acqua distillata e deionizzata + HCl concentrato (circa 15 ml) per portare la soluzione a pH 7,6]. </li><li> Le diapositive vengono poi lavata tre volte con tampone, e 100 microlitri di anticorpo secondario biotinilato DAKO a diluizione 1:100 (in 2% di albumina sierica bovina confezionati in tampone TBST) si aggiunge alle diapositive e incubate per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> A questo punto, Vectastain ABC (complesso avidina biotina) (da Vector Laboratories) reattivo si prepara, con 2,5 ml di PBS, 1 goccia soluzione A, 1 B soluzione goccia, e la soluzione è lasciato riposare per 30 minuti. </li><li> I vetrini sono risciacquati 3 volte con tampone TBST. </li><li> Poi 3 gocce di reagente Vectastain ABC è aggiunto e le diapositive sono incubati a temperatura ambiente per 30 minuti, seguita da risciacquo 2 volte con TBST. </li><li> Le diapositive vengono poi immersi in DAB (diammino-benzamide) (2,9 ml di DAB + 400 microlitri di PBS + 250 microlitri di perossido di idrogeno) per circa 5 minuti. </li><li> Le diapositive vengono poi risciacquati 2 volte con acqua distillata, acqua deionizzata. </li><li> Controcolorazione è fatto con una soluzione diluita di ematossilina per 10 secondi. Le diapositive sono sciacquati accuratamente con acqua corrente e poi con acqua deionizzata. </li><li> Le diapositive vengono poi disidratate 2 volte per 2 minuti in etanolo al 95%, 2 volte per 2 minuti in 100% di etanolo e 2 volte per 2 minuti in xilene. </li><li> Un paio di gocce di Cytoseal XYL (Richard Allan-scientifico), sono poi aggiunte le diapositive e un coprioggetto applicata. </li><li> Valutazione immunoistochimica di ERCC1, Ku86 e CcOI vengono eseguite utilizzando lo stesso protocollo per PMS2, ma sostituendo l&#39;anticorpo PMS2 con gli anticorpi per ERCC1, Ku86 e CcOI descritti nella tabella seguente. </li></ol> Valutare sezioni di tessuto per cripte carenti di espressione di ERCC1, PMS2, Ku86 e CcOI <ol><li> Ci primo sguardo sezioni di tessuto sotto un Motic (DM-BA300) photomicroscope per l&#39;espressione di PMS2 e ERCC1 nelle cripte della mucosa del colon. </li><li> PMS2 e ERCC1 sono entrambi gli enzimi di riparazione del DNA, e così si trovano dove il DNA è, nei nuclei delle cellule delle cripte. Questo è indicato nella figura 1, dove i due punti che rappresentano colorazione marrone per ERCC1, avviene nei nuclei delle cellule in una cripta. La cripta normale che prima mostra al microscopio è stato macchiato per ERCC1, e la macchia marrone mostra la posizione di ERCC1. Segnaliamo i tipi di cellule nelle cripte, dove &quot;cellule caliciformi&quot; hanno la forma un po &#39;come un bicchiere di vino, con i nuclei in una piccola area alla base delle celle al bordo esterno della cripta, e una mongolfiera fuori sezione, riempito con granuli mucina bianco nella parte della cellula all&#39;interno della cripta. Gli altri due tipi di cellule guardare un po &#39;simile nelle nostre sezioni colorate, e sono i enterociti e cellule enteroendocrine, ed i loro nuclei sono anche sul bordo esterno della cripta, alla base delle cellule. In biopsie prelevate da pazienti che non hanno mai avuto una neoplasia del colon, o nelle biopsie lontano da qualsiasi sito di cancro al colon, quasi tutti i nuclei in tutte le cripte mostrare normale alto livello di espressione di ERCC1 come mostrato qui. </li><li> Per orientare le nostre osservazioni, sezioni di tessuto ottenuti da biopsie di pazienti affetti da neoplasia del colon non sono stati osservati per i livelli di espressione di PMS2, ERCC1, CcOI o Ku86 nel normale mucosa del colon. Siamo in grado di osservare tutte le cripte in una sezione di tessuto normale, con una lente obiettivo 40x, mentre lentamente passare attraverso una sezione di tessuto intero e sottolineare le cripte, le cellule interstiziali, qualsiasi noduli linfoidi sul vetrino, e la tonaca muscolare (se presente nella biopsia). </li><li> Si segnala inoltre che ci sono solo diverse celle alla base della cripta che sono le cellule staminali. Queste cellule staminali generare tutti i circa 2.000 cellule della cripta completo. Una cellula staminale con una mutazione o un epimutation può assumere la nicchia tutta cellule staminali. Poi la cripta tutto può aver alterato colorazione per un enzima di interesse (conversione cripta), come mostriamo in questa nuova diapositiva in cui vediamo cripte tutto carenti per CcOI accanto alla cripta che hanno alta espressione di CcOI. </li><li> Allora mostriamo una diapositiva da un paziente con un cancro al colon o un adenoma con neoplasia in fase avanzata. Su questa diapositiva, alcune cripte sono normali alto livello di espressione per ERCC1 e alcuni hanno più bassi livelli di espressione. Tutte le cripte all&#39;interno della sezione di tessuto sono fotografati a bassa risoluzione con un obiettivo obiettivo 10x, e le immagini sono piastrellati in modo che l&#39;intera sezione di tessuto è visto in una sola immagine. Le cripte sono poi numerate. </li><li> Le cripte con alta espressione di un enzima, tipica di cripte nelle biopsie di gran lunga indietrom qualsiasi tipo di cancro, sono chiamati livello di colorazione &quot;4&quot;. Altri livelli sono &quot;0&quot; se non c&#39;è espressione rilevabile, &quot;1&quot; se l&#39;espressione appena rilevabile è evidente, &quot;2&quot; se non vi è presente l&#39;espressione, ma ad un livello molto inferiore rispetto al livello 4, e &quot;3&quot; se l&#39;espressione è presente a un livello inferiore a 4, ma abbastanza forte. Ci puntino ogni diapositiva sulla blu a bassa risoluzione dell&#39;immagine per 4, verde per 3, per 2 giallo, arancione e rosso per 1 a 0. Qui vi mostriamo attraversando una sezione da una biopsia utilizza un obiettivo 40x obiettivo. Noi puntino le cripte sulle immagini a bassa risoluzione. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Una cripta del colon che mostra alta espressione di ERCC1 nei nuclei delle cellule cripta. Tutti i colori in questa immagine sono stati ugualmente rafforzata in contrasto e saturazione, con Paint Shop Pro 5. Rappresentante Risultati <ol><li> Le sezioni di tessuto si alternano su vetrini separati ci permettono di guardare le cripte del colon stesso, con l&#39;espressione di due proteine ​​diverse dimostrato da immunoistochimica. L&#39;immagine di un colorato cripta per PMS2 e macchiato cripta stessa ERCC1 viene visualizzato sul microscopi adiacenti con i monitor dei computer adiacenti. Questo ci permette di determinare se vi è carenza congiunta per due proteine ​​o se le carenze in ciascuna delle proteine, mentre ciascuno è frequente, si verifica in maniera indipendente. Abbiamo tre sezioni di tessuto per vetrino, in modo che qualsiasi carenza evidente nell&#39;espressione di una proteina può essere verificata come carente su più di una sezione, e non a causa di un artefatto. Nei tessuti circostanti tumori del colon, dove c&#39;è un difetto del campo dando origine al cancro, vi è una alta frequenza di cripte carente per ERCC1 e PMS2. </li><li> Abbiamo anche utilizzato immunoistochimica per trovare la frequenza delle cripte carente per Ku86 e CcOI. Su questa diapositiva, andiamo attraverso una sezione di tessuto per l&#39;intero immunostained Ku86, con un obiettivo 40x obiettivo, e possiamo vedere che alcune cripte sono carenti per Ku86 in questa sezione di tessuto. </li><li> Allo stesso modo, in questa diapositiva, andiamo attraverso una sezione di tessuto per l&#39;intero immunostained CcOI, con un obiettivo 40x obiettivo, e possiamo vedere che solo un numero limitato di cripte sono carenti per CcOI. </li></ol>

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<ol><li> E &#39;molto importante avere 3 sezioni di tessuto per vetrino. Le bolle possono verificarsi quando si applica i media portando l&#39;anticorpo, in modo che alcune cripte o porzioni di cripte non può essere colorato in modo adeguato solo perché una bolla impedito l&#39;anticorpo di reagire con la sezione di tessuto. Cripte sono circa 60 micron di diametro, e sezioni di tessuto sono 4 micron di spessore, quindi ci potrebbero essere ben 15 sezioni di tessuto attraverso la cripta stessa. Di solito è possibile trovare la cripta stessa, con morfologia della cripta come una guida, su sezioni di tessuto più posto su un vetrino. </li><li> Nei nostri studi recenti, per i campioni di tessuto di grandi dimensioni, in una colorazione Sequenza non può dare una buona copertura anticorpale al tessuto. In questi casi, si può preferire di usare la mano colorazione del tessuto, dove una goccia di supporto contenente l&#39;anticorpo è a mano posta sopra ogni campione di tessuto. </li><li> Di vedere chiaramente la colorazione marrone che mostra l&#39;espressione della proteina immunostained, e la colorazione blu che mostra DNA nucleare sul monitor del computer, il software photomicroscope Motic è regolata come segue: Guadagno 0, offset 0, Enhance 0, 255, Gamma 1.00, 0, Nitidezza 1, correzione del colore 7, R, G, B Gain 1.00, e R, G, Luminosità B 0. La risoluzione è impostata a 1024 x 768, e del bilanciamento del bianco è abilitata. </li><li> Il nostro metodo può essere utilizzato con qualsiasi proteine ​​ritenute importanti nella progressione del cancro del colon, per valutare la loro frequenza di carenza, o forse l&#39;iperespressione, a difetti del campo che circonda i tumori del colon o adenomi con neoplasia in fase avanzata. </li><li> Difetti del campo sono una parte di sviluppo del cancro Il termine &quot;campo di cancerizzazione&quot; è stata la prima volta da Slaughter et al. Nel 1953 da 1 a descrivere un&#39;area o &quot;campo&quot; di epitelio che è stato condizionato dai processi in gran parte sconosciuto (al momento) in modo da predisporre per lo sviluppo del cancro. L&#39;utilizzo iniziale è stata, nel contesto di tumori orali. Da allora, il &quot;campo di cancerizzazione&quot; e &quot;difetto di campo&quot; sono state utilizzate più ampiamente per descrivere qualsiasi pre-neoplastiche del tessuto in cui nuovi casi di tumore hanno maggiori probabilità di verificarsi, e il concetto di cancerizzazione di campo in oncologia clinica ha ricevuto un&#39;attenzione crescente 2 . Recentemente abbiamo esaminato le evidenze di difetti del campo nel cancro gastrointestinale 3. Inclusi in questa revisione sono stati i risultati di una dozzina di studi fornire la prova di difetti del campo nel colon. Difetti del campo nella mucosa del colon probabilmente derivano dalla selezione naturale delle cellule mutanti o cellule alterate epigeneticamente tra le cellule staminali di una cripta in modo che una cellula staminale sopravvive successione 4 di nicchia. Instabilità genetica o di un fenotipo mutatore, forse a causa della riduzione di riparazione per escissione dei nucleotidi del DNA o DNA mismatch repair, dovrebbe accelerare questo processo (e un difetto frequente nei PMS2 era precedentemente rilevato nelle zone circostanti i tumori del colon 5). Se, in una popolazione normale di cellule staminali nella mucosa del colon, una cellula acquisisce un vantaggio selettivo attraverso una mutazione o un epimutation, tenderà ad espandersi clonale a spese delle cellule staminali vicini. Nella mucosa del colon, la nicchia delle cellule staminali è occupato da ≤ 5 celle 6 che poi danno luogo a tutti (circa 2.000) delle cellule della cripta. Una acquisizione della nicchia delle cellule staminali da un risultato cellula mutante o epigeneticamente alterati tipo di &quot;conversione cripta&quot; 7. La diffusione di cloni mutato (cripte convertito) nell&#39;epitelio del colon può più spesso si verifica per fissione cripta 8. Un esempio di fissione cripta è illustrato nella figura 2. In questo modo una zona di tessuto anomalo si pone. All&#39;interno di tale patch, una seconda mutazione quali possono verificarsi in modo che una cripta dato acquisisce un vantaggio rispetto ad altre cripte all&#39;interno della patch, e questa cripta si espanderà clonale formando una patch secondaria all&#39;interno della patch originale. All&#39;interno di questa nuova patch, il processo può essere ripetuto più tempo diversi, forse per decenni, fino a quando una cellula staminale maligno che si espande nasce clonale in un cancro. Se questo è il processo generale attraverso il quale sporadici adenocarcinomi del colon sorgono, poi adenocarcinomi del colon in genere devono essere associati, ed essere preceduto da, campi di anormalità. Così un pezzo di cripte convertito ci si potrebbe aspettare di avere difetti rilevabili nell&#39;area circostante un adenoma con neoplasia avanzata, o attorno ad un cancro del colon. Da questo modello di pre-progressione del tumore, ci si aspetterebbe di trovare alterazioni genetiche o epigenetiche relative al pre-tumorali progressione tra i campioni di tessuto prelevati dal non-neoplastici mucosa del colon nelle aree circostanti le lesioni neoplastiche del colon che possono progredire a cancro . In particolare, i difetti degli enzimi di riparazione del DNA o delle proteine ​​necessarie per l&#39;apoptosi, contribuirebbe alla progressione aumentando l&#39;instabilità genomica, e ci si potrebbe aspettare di trovare in un campo difettoso. </li><li> Selezione per carenza di PMS2 quando le cellule sono deficient per ERCC1 e sottoposti ad un agente che danneggiano il DNA Nara et al. 9 sono cresciute del 25 colture di cellule ovariche di criceto cinese 43-3B, tutti con una mutazione inattivando il gene di riparazione del DNA ERCC1, le culture e trattati con un agente che danneggiano il DNA, MNNG. Tra le cellule sopravvissute al trattamento danni al DNA, una singola cellula è stato isolato da ogni cultura e ha permesso di formare un clone. Tutti i cloni isolati sono stati circa 10 volte più resistente di aver ucciso dai MNNG rispetto al ceppo parentale. Dei cloni isolati, 22 sono stati dimostrato di essere difettoso in riparazione mancata corrispondenza del DNA (MMR). Cinque di questi 22 cloni sono stati analizzati mediante sequenziamento, e tre dei cinque sono stati carenti per PMS2. Questa selezione per difetto PMS2 era presumibilmente perché PMS2 deficit causato resistenza all&#39;apoptosi, e quindi la capacità di sopravvivere al danno al DNA nelle cellule aggiunto ancora quando ERCC1 era assente. (Normalmente, PMS2 sensi livelli di danno al DNA, e induce le cellule per apoptosi quando danno al DNA è eccessivo.) Così, una carenza di PMS2 è stato selezionato per quando ERCC1-deficienti cellule sono sottoposte a danno al DNA. Cloni difettosi sia ERCC1 e PMS2 hanno mostrato di avere su un 500 a 1000 volte maggiore tasso di mutazione in caso di irradiazione con raggi UV rispetto alle cellule parentali. </li><li> Acidi biliari causano stress ossidativo, sono agenti che danneggiano il DNA e sono importanti nella progressione del cancro del colon Desossicolico acido, un acido biliare, aumenta lo stress ossidativo attraverso la generazione di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) da più processi, compresi danneggiamento dei mitocondri 10. Vi è stato recentemente dimostrato che ROS causano cambiamenti epigenetici 11 e almeno 15 studi hanno dimostrato che gli acidi biliari, presso l&#39;aumento delle concentrazioni che accompagna una dieta ricca di grassi, causa danni al DNA 12. Come recensione da Bernstein et al. 12, vi è una correlazione positiva tra il consumo di grassi nella dieta e incidenza del cancro del colon. Acidi biliari sono secreti nel tratto intestinale in risposta al grasso nella dieta, e gli acidi biliari agiscono come detergenti per facilitare la digestione dei grassi. Quindi, una dieta ricca di grassi è associata ad un aumento della secrezione della bile acida. Fecale concentrazioni di acidi biliari sono elevati in popolazioni con un&#39;alta incidenza di cancro al colon, e l&#39;eccessiva esposizione agli acidi biliari è considerata come un importante fattore di rischio per la carcinogenesi del colon 13. Acidi biliari può essere una causa di difetti del campo nel colon. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Fissione Una cripta del colon in 3 cripte. Conclusione Abbiamo trovato una frequenza elevata di cripte carente nei geni di riparazione del DNA e ERCC1 PMS2 (PMS2 è necessario anche per apoptosi) in difetti del campo che circonda i tumori del colon. Carenze di ERCC1 e PMS2 (a causa di cambiamenti epigenetici o mutazioni) possono essere primi passi nel instabilità genetica centrale di sviluppo del cancro del colon.

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		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<td>PMS2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ERCC1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>MS-671-P1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ku86 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotech.</td>
<td>SC-9034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CcO1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>459600</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated secondary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAKO</td>
<td>E0413</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22% BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Informagen, Inc.</td>
<td>2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sniper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocare Medical</td>
<td>BS966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectastain ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>34001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>20605</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal XYL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48212-196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer

Nella carcinogenesi, il &quot;difetto di campo&quot; è riconosciuto clinicamente a causa della propensione dei sopravvissuti di alcuni tumori per sviluppare altri tumori maligni dello stesso tipo di tessuto, spesso in zona. Difetti del campo quali sono stati indicati nel cancro del colon. Le alterazioni molecolari che sono responsabili di un difetto del campo nei due punti dovrebbero essere rilevabili ad alta frequenza nel tessuto istologicamente normale che circonda un adenocarcinoma del colon o circonda un adenoma con neoplasia avanzata (sulla buona strada per un cancro al colon), ma a bassa frequenza nella mucosa del colon di pazienti senza neoplasia del colon. Utilizzando immunoistochimica, cripte intero entro 10 cm su ogni lato degli adenocarcinomi del colon o avanzato neoplasie del colon sono risultate spesso ridotta o assente espressione di due proteine ​​di riparazione del DNA, PMS2 e / o ERCC1. PMS2 è una proteina duplice ruolo, attivo nella riparazione del DNA mancata corrispondenza così come necessario in apoptosi delle cellule con danno al DNA in eccesso. ERCC1 è attiva in riparazione per escissione dei nucleotidi del DNA. L&#39;espressione ridotta o assente di entrambi ERCC1 e PMS2 avrebbe creato cellule sia con maggiore capacità di sopravvivere (resistenza apoptosi) e aumento del livello di mutabilità. L&#39;espressione ridotta o assente di entrambi ERCC1 e PMS2 è probabile che un primo passo nella progressione del cancro del colon. Gene di riparazione del DNA Ku86 (attivo nel DNA non omologhe fine giunzione) e citocromo c ossidasi subunità I (coinvolti in apoptosi) erano stati entrambi segnalati per essere ridotta a espressione nelle aree vicino ai tumori della mucosa del colon. Tuttavia, la valutazione immunoistochimica dei livelli di espressione hanno mostrato solo a basse frequenze modeste di cripte ad essere carenti nella loro espressione in un difetto del campo che circonda il cancro del colon o circostanti neoplasia del colon avanzato. Mostriamo, qui, il nostro metodo di valutazione delle cripte per l&#39;espressione di ERCC1, PMS2, Ku86 e CcOI. Abbiamo dimostrato che la frequenza delle cripte tutto carenti per PMS2 e ERCC1 è spesso così grande come il 70% al 95% nel 20 centimetri lungo le zone circostanti una neoplasia del colon, mentre la frequenza delle cripte carente in Ku86 ha un valore medio del 2% e la frequenza delle cripte carenti in CcOI ha un valore mediano del 16% in questi settori. Tutto il colon è di 150 cm di lunghezza (circa 5 metri) e dispone di circa 10 milioni di cripte nel suo strato mucoso. Il difetto di PMS2 e ERCC1 che circondano un tumore del colon in tal modo possono includere milione cripte. E &#39;da una cripta difettoso che il cancro al colon deriva.

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Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Ridotta espressione / assenza di PMS2 e / o ERCC1 nelle cripte intero è un evento frequente nel raggio di 10 cm su ogni lato degli adenocarcinomi del colon, probabilmente in base ad un difetto del campo con elevata mutevolezza e la progressione del cancro. Carenza di Ku86 o CcOI è molto meno frequente in questi difetti del campo.

PMS2 carente, ERCC1, Ku86, CcOI in Difetti del campo durante la progressione a tumore del colon

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

deficient-pms2-ercc1-ku86-ccoi-field-defects-during-progression-to

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  University of Arizona, Tucson. Ridotta espressione / assenza di PMS2 e / o ERCC1 nelle cripte intero è un evento frequente nel raggio di 10 cm su ogni lato degli adenocarcinomi del colon, probabilmente in base ad un difetto del campo con elevata mutevolezza e la progressione del cancro. Carenza di Ku86 o CcOI è molto meno frequente in questi difetti del campo.

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Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

L&#39;impianto di Ferumoxides etichetta cellule staminali mesenchimali in difetti della cartilagine

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Ricerca

Biologia

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Determinare il contributo dei sistemi di energia durante l&#39;allenamento

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

La murino colina-carenti, etionina-completati (CDE) dieta modello della lesione epatica cronica

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction defects can be assessed by tracking methylene blue dye flow within the urinary system. Methylene blue dye is injected into the renal pelvis of perinatal embryonic kidneys and dye flow is monitored from the renal pelvis of the kidney through the ureter and into the bladder lumen after applying hydrostatic pressure. Dye accumulation will be evident in the bladder lumen of the normal perinatal urinary tract, but will be constrained between the renal pelvis and the end point of an abnormal ureter, if urinary tract obstructions occur. This method facilitates the confirmation of urinary tract junction obstructions and visualization of hydronephrosis and hydroureter. This manuscript describes a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis to confirm urinary tract junction obstructions.

Methylene blue dye injection into the renal pelvis facilitates the assessment of urinary tract junction obstruction defects during mouse embryonic urinary tract development. Here, a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis is described.

Valutazione difetti di ostruzione delle vie urinarie Junction iniettando colorante blu di metilene

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...