Il nostro protocollo utilizzava RNA-Seq e strumenti bioinformatici per scoprire rapidamente i geni driver sovraespressi che contribuiscono alla formazione di tumori colorettali simili a staminali. Questo protocollo viene utilizzato per migliorare le vie geniche e di segnale espresse in modo differenziato per studiare un meccanismo molecolare per la staminalità tumorale in un cancro colorettale selettivo. Il settimo giorno di coltura, utilizzare un microscopio invertito con un sistema di imaging cellulare digitale per osservare e misurare il diametro delle tumorisfere.
Quando le tumorisfere raggiungono un diametro superiore a 100 micrometri, trattare la coltura con lo 0,25% di tripside. Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, neutralizzare la tripside con due volte il volume del mezzo di crescita e contare le cellule usando un emocitometro. Raccogliere le cellule per centrifugazione.
E rimospendò il pellet a un cinque per 10 alle quattro cellule per 100 microlitri di media concentrazione. Aggiungere due microlitri dell'anticorpo primario di interesse per ogni tubo e incubare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente e 200 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, lavare ogni tubo con 900 microlitri di PBS e analizzare le cellule per l'espressione della proteina di interesse per citometria di flusso secondo protocolli standard.
Per l'isolamento dell'RNA dopo la raccolta della tripsina, come appena dimostrato, rimescolare le cellule a due volte 10 alla quinta colonna per 50 microlitri di concentrazione di PBS e lyse ogni campione con 200 microlitri di tampone di lysis integrati con due microlitri di beta mercaptoetanolo per tubo. Dopo un breve vortice e un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, raccogliere i lisati per centrifugazione e aggiungere 200 microlitri di 70% di etanolo a ciascun tubo. Trasferire i campioni in colonne rapide e rimuovere il solvente mediante centrifugazione.
Lavare i campioni con 400 microlitri di soluzione di lavaggio uno e 600 microlitri di soluzione di lavaggio due per rimuovere completamente qualsiasi non RNA per centrifugazione, seguito da una centrifugazione aggiuntiva di due minuti nelle stesse condizioni di centrifugazione per rimuovere qualsiasi etanolo residuo. Quindi rimospendare i pellet in 50 microlitri di acqua distillata per tubo e centrifugare il campione per un minuto prima di raccogliere l'RNA contenente supernanti. Studiare l'espressione genica differenziale tra le cellule tumorali rispetto alle cellule tumorali parentali dopo l'analisi del sequenziamento dell'RNA.
Selezionare i geni con un cambiamento da più di uno a meno una variazione di log2 volte con conteggi di lettura maggiori di 100 nella tumorsfera e nei gruppi parentali. E usa i comandi come indicato. Per ottenere un grafico vulcano dei dati per determinare l'espressione genica differenziale.
Per la selezione del gene di azionamento nell'analista di rete, selezionare l'input di un singolo gene e copiare e incollare i geni sovraespressi selezionati con l'essere umano specificato come organismo e il simbolo genico ufficiale come tipo id. Fare clic su Carica e procedere. Per inserire e analizzare i dati utilizzando l'interazione proteina-proteina, a seguito dell'interazione proteina-proteina genetica, utilizzare il database interactome STRING con un punteggio di confidenza di 900 per mostrare i geni dei semi.
Cross-linking dei geni caricati. I geni dei semi associati a più geni individuali possono essere selezionati come geni driver che possono essere coinvolti nel mantenimento della formazione della tumorsfera. Selezionate Procedi nella panoramica della mappatura bianca nella manopola Sfondo e Force Atlas nella manopola Layout.
Quindi selezionare la coppia di basi PANTHER per analizzare il gruppo genico di upregulation. Le tumorisfere di diametro superiore a 100 micrometri si formano entro sette giorni dalla coltura. L'analisi citometrica del flusso rivela un aumento dell'espressione LGR5 e CD133 nelle tumorisfere derivate da HT29 rispetto alle cellule HT29 parentali.
Dopo il sequenziamento dell'RNA, i geni con un cambiamento di 2 volte maggiore nella loro up o downregulation con un valore P inferiore a 0,05 come determinato dalla mappa termica possono essere tracciati per distinguere i geni significativi tra le tumorsfere derivate da HT29 e le cellule parentali HT29. In questo esperimento rappresentativo, l'analisi dei geni upregolati con una piega superiore a un log2 ha portato a 10 geni di semi, incrociando le reti geniche. L'analisi della coppia di basi PANTHER ha indicato che due geni erano associati alla regolazione negativa dell'apoptosi.
Inoltre, i geni selezionati sono stati di conseguenza convalidati dalla PCR quantitativa confermando la loro maggiore espressione nelle tumorisfere derivate da HT29. La selezione genica differenziale è la fase più importante delle procedure. Ricordarsi di utilizzare una modifica di piegatura log2 maggiore di una con riconteggi maggiori di 100 come criteri.
Utilizzando questo protocollo, i geni selezionati dalle tumorsfere derivate dal colon-retto possono essere abbattuti o sovraespressi per scoprire i loro potenziali ruoli nella formazione della tumorsfera.
