Questo metodo permette di rilevare, con un approccio non invasivo, paziente con lesione neoplastica colorettale. In particolare, questo test consente, in associazione con i test attualmente utilizzati nel programma di screening del cancro colorettale, di prevedere meglio la presenza di cancro o un rischio maggiore di lesioni anomale. Per iniziare questo protocollo, centrifuga un'aliquota di ogni controllo positivo, DNA standard e DNA spike-in, in un formato asciutto per 10 secondi su una mini centrifuga.
Resuspend il controllo positivo con 750 microlitri d'acqua. Resuspend il DNA spike-in, utilizzato come controllo interno esogeno, per testare la presenza di inibitori, con 100 microlitri di acqua. Per la curva standard, rimorsi allo standard secco con 100 microlitri d'acqua e effettuare quattro diluizioni 1:5 a partire dalla soluzione stock.
Quindi, vortice attento i reagenti per 15 secondi e centrifuga in una mini centrifuga per 10 secondi. Per una sospensione completa, conservare i reagenti liquidi a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso. Per preparare il controllo del DNA 1x spike-in, mescolare cinque microlitri di picco FL-DNA con 45 microlitri di acqua sterile.
Per i campioni, mescolare 75 microlitri di ciascun campione con 50 microlitri di 1x spike-in DNA, producendo un volume totale di 125 microlitri. Aprire innanzitutto il software operativo qPCR. Per impostare la piastra, impostare il tipo di pozzo per tutte e otto le posizioni nella prima colonna, come standard.
Impostare il tipo di pozzo per i pozzi A2 e B2 e NTC. Impostare il tipo di pozzo per i controlli positivi, C2 e D2, come sconosciuto. E impostare il tipo di pozzo per tutte le altre posizioni come Sconosciuto.
Seleziona tutte le 96 posizioni. Aggiungete i coloranti FAM e HEX e fate clic su Sync Plate. Quindi impostare il profilo termico, come previsto.
Preparare il numero desiderato di strisce da 8 pozzi contenenti miscele complete di amplificazione liofilizzata, con primer e sonde specifiche che prendono di mira il DNA umano e il controllo interno. Per portare il contenuto sul fondo dei tubi, centrifugare le strisce per 10 secondi. Rimuovere delicatamente le guarnizioni dalle strisce, assicurandosi di non perdere pellet.
Quindi aggiungere 25 microlitri di acqua ai pozzi di controllo negativi. 25 microlitri di DNA campione per campionare pozzi e 25 microlitri di DNA di controllo positivo ai pozzi di controllo positivi. Per la curva standard, aggiungere 25 microlitri di standard 1, 2, 3 e 4 in ogni pozzo dedicato.
Utilizzare tappi ottici piatti a 8 strisce per chiudere con cura tutte le strisce e il vortice per alcuni secondi. Centrifugare le strisce per 10 secondi, caricarle nello strumento e iniziare la corsa. Alla fine della corsa, per FAM FL-DNA A e HEX IC, selezionare colonne, A, C, E e G.Per FAM FL-DNA B e HEX IC, selezionare colonne, B, D, F e H.Per le quantità standard quantità di partenza, impostare 10 nanogrammi per reazione per i pozzi A1 e B1, due nanogrammi per reazione per C1 e D1, punto quattro nanogrammi per reazione per E1 e F1 , e punto zero otto nanogrammi per reazione per G1 e H1. Quindi, sia per i canali FAM che HEX impostare i valori di fluorescenza soglia su 150.
Nella casella Tabella risultati fare clic su Opzioni colonna, quindi selezionare Tutto e quindi Ok per ottenere i risultati in entrambi i canali con i rispettivi valori Cq e delta R, forniti dal software dello strumento qPCR in tempo reale. Delta R ultimo corrisponde al valore di fluorescenza normalizzato all'ultimo ciclo di amplificazione. Nella casella Tabella risultati fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella per aprire il menu di scelta rapida.
Fare clic su Invia a Excel per esportare i dati non elaborati. Quindi caricare il file Excel sul software di analisi dedicato per il calcolo automatizzato della quantità fl-DNA. Dalla combinazione di valori iFOBT e FL-DNA stima per ogni paziente, il rischio di cancro del colon-retto.
Le curve di fluorescenza di un campione positivo adatto mostrano il segnale campione sul canale HEX, che è il controllo interno, entro l'intervallo accettabile. Il segnale positivo è al di sopra della soglia sul canale FAM, che mostra l'amplificazione dei geni bersaglio. Le curve di fluorescenza di un campione negativo adatto mostrano il segnale campione all'interno dell'intervallo accettabile sul canale HEX.
Il segnale di controllo negativo è al di sotto della soglia sul canale FAM. D'altra parte, le curve di un campione non adatto mostrano il segnale campione che non rientra nell'intervallo accettabile sul canale HEX. Molto probabilmente a causa di una potenziale inibizione.
Pertanto, questo campione deve essere ripetuto, a partire dall'estrazione. La tabella di output dell'analisi software mostra i dati sia per Mix A che per Mix B in termini di concentrazione fl-DNA per controlli di reazione, campioni clinici ed eseguire risultati di controllo qualità. L'esempio numero quattro non ha alcun risultato perché non ha superato il controllo di qualità.
Deve essere ripetuto e rianalizzato. Si prega di fare attenzione quando si rimospendato il DNA per il controllo spike-in alla curva standard. E quando si distribuiscono diversi DNA a strisce a 8 pozzi, così come durante il rilevamento molecolare nella sezione di analisi dei risultati.
Questo metodo deve essere eseguito in combinazione con il test iFOBT per consentire una migliore valutazione delle lesioni neoplastiche colorettali, deve essere effettuato con lo stesso campione fecale.
