Inizia sterilizzando i vetrini rivestiti in politetrafluoroetilene o PTFE immergendoli in etanolo al 70% per 10 minuti in un armadio di biosicurezza. Lasciare asciugare i vetrini all'aria in un piatto di coltura cellulare sterile da 100 millimetri. Posizionare ogni vetrino in 1 nuovo piatto di coltura cellulare da 100 millimetri e aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura cellulare contenente siero in ciascun rettangolo.
Quindi posizionare una luce UV portatile da 254 nanometri sul piatto di coltura cellulare da 100 millimetri con la lampadina direttamente rivolta verso il vetrino per 20 minuti. Scongelare le aliquote congelate dei segmenti esterni, o OS, in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quindi ruotare il sistema operativo a 2, 400G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aspirare immediatamente il surnatante nell'armadio di biosicurezza utilizzando una pipetta e risospendere il sistema operativo in PBS. Ora, aspirare il mezzo dalle diapositive e posizionare fino a 500 microlitri della soluzione PBS 2 x 10 all'8 ° OS per millilitro della soluzione PBS da 2 x 10 all'8 ° sistema operativo per millilitro su ciascun rettangolo di diapositiva. Posizionare una luce UV portatile a 254 nanometri sopra il piatto di coltura cellulare con la lampadina rivolta direttamente verso il sistema operativo per 40 minuti.
Raccogliere la soluzione OS-PBS in un tubo da 1,5 millilitri. Lavare il rettangolo del vetrino rivestito con 200-500 microlitri di PBS e raccogliere ogni lavaggio nel tubo della microcentrifuga. Quindi ruotare la soluzione OS-PBS a 2, 400G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aspirare il PBS nell'armadio di biosicurezza con un pipetter e risospendere il pellet in 500 microlitri di mezzo standard da utilizzare per l'epitelio pigmentato retinico o colture RPE. Posizionare 10 microlitri della sospensione in una nuova provetta da microcentrifuga. Diluire da 50 a 100 volte con più terreno di coltura cellulare e contare l'OS con un emocitometro.
Diluire il sistema operativo fotoossidato, o sospensione OxOS, a una concentrazione di 5,6 x 10 al 7 ° OS per millilitro in un mezzo RPE standard. Aggiungere ligandi ponte per la fagocitosi, che facilitano l'assorbimento di OS e l'accumulo di lipofuscina. Quindi aliquote OxOS in scorte monouso e congelamento a scatto in azoto liquido.
Scongelare le aliquote di OxOS diluendo l'aliquota congelata in 45 microlitri di terreno di coltura cellulare prima di aggiungerla ai transwell RPE per indurre l'accumulo di lipofuscina. Quindi caratterizzare il sistema operativo ossidato misurando lo spettro di emissione OxOS utilizzando la scansione Lambda su un microscopio confocale. L'imaging confocale ha mostrato che l'OS trattata aveva un aumento dell'autofluorescenza rispetto all'OS non trattato.
