Eseguire il protocollo all'interno di una cabina di biosicurezza sul topo soppresso, opportunamente rasato e disinfettato con etanolo al 70%. Crea un'incisione superficiale di 0,5 pollici nell'addome dell'animale usando le forbici. Tagliare longitudinalmente lungo la linea mediana verso il collo e il basso addome.
Inoltre, fai dei tagli laterali per aprire la pelle. Usando una pinza smussata, separa delicatamente la pelle dai tessuti circostanti, mentre gira intorno al busto dell'animale tagliando la pelle lateralmente intorno al collo e al basso addome. Posizionare con cura la pelle con il lato del derma rivolto verso il basso in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri.
E assicurati che la pelle sia il più tesa possibile. Aggiungere sei millilitri di soluzione di Dispase alla piastra, assicurandosi che la pelle sia completamente coperta. Quindi, copri il piatto.
Avvolgere il piatto con Parafilm. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti per appiattire l'espianto. Il giorno successivo, utilizzando una pipetta, rimuovere il liquido dalla piastra contenente la pelle isolata.
Quindi, con l'aiuto di una pinza, separare il derma dall'epidermide rimuovendo da essa il tessuto adiposo visibile. E posizionare il derma isolato in una piastra di coltura tissutale pulita. Aggiungere un millilitro di DMEM contenente 1X soluzione antibiotico-antimicotica al derma nella piastra di coltura.
Inclinare la piastra per accumulare il liquido su un lato della piastra. Quindi, tritare il derma in pezzi di uno o due millimetri quadrati. E trasferiscili in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.
Aggiungere 10 millilitri di soluzione di collagenasi di tipo II al tubo. Incubarlo per due ore a 37 gradi Celsius con agitazione continua a 30-50 giri/min per digerire il derma. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micron.
E centrifugare a 250 g per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 10 millimetri di DMEM contenente soluzione antibiotico-antimicotica. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micron prima della centrifugazione, come dimostrato in precedenza.
Risospendere il pellet di cella risultante in un millilitro di terreno LEC completo. Quindi, piastrate le cellule in un terreno LEC completo in una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri rivestita di collagene. Sostituire il terreno ogni due giorni lavando due volte le celle con PBS e aggiungendo nuovi terreni LEC.
Le immagini a basso ingrandimento delle cellule isolate dal derma murino hanno mostrato una popolazione cellulare mista.
