Preriscaldare un millilitro di brodo LB e una piastra di agar LB più gentamicina per ciascun campione e controllare in un incubatore statico impostato a 37 gradi Celsius. In un volume combinato di cinque microlitri o meno, aggiungere da 100 a 200 nanogrammi ciascuno del plasmide helper pTNS2 e del plasmide di inserzione adeIJK di gentamicina pUC18-Tmini-Tn7-Tlac a un'aliquota di cellule elettrocompetenti. Miscelare con la punta delle dita per garantire la completa miscelazione dei plasmidi con le cellule elettrocompetenti senza introdurre bolle.
Aggiungere un volume equivalente di acqua distillata sterile nell'aliquota della cella di controllo negativo e mescolare delicatamente come mostrato prima. Incubare i campioni su ghiaccio per 20 minuti. Trasferire l'intero campione di cellule in una cuvetta per elettroporazione ghiacciata, quindi riposizionare la cuvetta sul ghiaccio.
Per elettroporare il campione di celle, accendere l'elettroporatore e impostarlo a due kilovolt. Pulire la superficie della cuvetta con un panno morbido per rimuovere il ghiaccio o l'umidità aderenti. Inserire la cuvetta nell'elettroporatore ed erogare la scossa elettrica.
Aggiungere immediatamente 0,9 millilitri di brodo LB preriscaldato alle cellule nella cuvetta e pipettare delicatamente su e giù per mescolare le cellule con il terreno. Trasferire l'intera sospensione cellulare in una nuova provetta da 1,5 millilitri a temperatura ambiente. Quindi controllare il valore della costante di tempo sull'elettroporatore.
Per ottenere i migliori risultati, questo valore dovrebbe essere compreso tra quattro e sei. Incubare i campioni elettroporati a 37 gradi Celsius per un'ora a 250 giri/min per consentire il recupero delle cellule. Dopo un'ora, distribuire 100 microlitri di ciascun campione su una piastra di agar LB più gentamicina preriscaldata, utilizzando uno spandiconcime di inoculazione.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 16-18 ore. Controllare le piastre per elettroporazione. Usando degli stuzzicadenti sterili, prelevare fino a 10 colonie singole dalle piastre di agar LB più gentamicina e metterle su una piastra di agar LB più gentamicina fresca.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 16-18 ore. Il patching delle colonie di piastre di trasformazione su terreni selettivi preserva il ceppo trasformato e fornisce il materiale di partenza per lo screening PCR delle colonie. Il prodotto PCR per i primer di screening, ABglmS2 forward new e Tn7 reverse è di 382 coppie di basi.
I controlli negativi per la reazione includono A.baumannii ATCC 17978, AB 258 e nessun modello.
