Il nostro metodo risponde a domande chiave, come ad esempio qual è il carico complessivo di batteri resistenti agli antibiotici nel campione d'acqua? Qual è l'identità di questi batteri e quali sono i diversi tipi di tratti e geni resistenti agli antibiotici che stanno portando? Il vantaggio del nostro protocollo è che può rilevare anche i batteri che non possono essere coltivati in laboratorio, che costituiscono una percentuale significativa dei batteri totali nel campione d'acqua.
Quindi, teoricamente, nessun batterio o i suoi tratti resistenti sono lasciati fuori. Questa tecnica combinatoria che coinvolge sia tecniche basate sulla coltura che indipendenti dalla coltura può essere replicata e personalizzata per qualsiasi campione ottenuto da effluenze fognarie, farmaceutiche o ospedaliere, impostazioni cliniche e non cliniche e altro ancora. Insieme a Devika, a dimostrare le procedure sperimentali saranno Harshali Shinde e Maitri Mishra, entrambi ricercatori senior del mio laboratorio.
Per iniziare, elaborare il campione d'acqua in modo asettico filtrandolo attraverso un panno sterile di mussola per rimuovere qualsiasi particella. Quindi, diluire in serie il campione di acqua filtrata per ulteriori analisi. Per determinare la carica batterica totale, posizionare 100 microlitri delle diluizioni appropriate del campione di acqua filtrata sulle piastre di agar R2A solidificate e sui duplicati e distribuire uniformemente.
Incubare tutte le piastre di diffusione del campione a 35-37 gradi Celsius per 48 ore. Dopo il periodo di incubazione, contare le colonie ed esprimere la carica batterica totale in unità formanti colonie per millilitro. Per determinare la conta batterica resistente agli antibiotici, aggiungere gli antibiotici separatamente in provette contenenti 20 millilitri di agar R2A fuso sterile modificato approssimativamente a 40 gradi Celsius.
Agitare per mescolare uniformemente e versare su piastre di Petri sterili prima che l'agar si solidifichi. Per il controllo di qualità e per verificare l'efficacia degli antibiotici, distribuire 100 microlitri di sospensione batterica sui rispettivi antibiotici contenenti piastre modificate con agar R2A. Incubare le piastre a 35-37 gradi Celsius per 48 ore, quindi determinare la conta batterica.
Per preparare il modello di DNA dagli isolati per la PCR, usando uno stuzzicadenti sterile, prendi una singola colonia pura isolata dell'isolato che cresce su una piastra di Petri. Sospendere la colonia batterica in 100 microlitri di acqua sterile bidistillata in un tubo di microcentrifuga e farla bollire in un bagno di acqua bollente o in un bagno asciutto per 10 minuti a 100 gradi Celsius. Centrifugare la sospensione a 10.000 g per due minuti per pellettare i detriti e trasferire il surnatante in un tubo di microcentrifuga sterile fresco da utilizzare come modello di DNA grezzo.
Per amplificare la regione V3 del gene rRNA 16S mediante PCR, preparare 40 microlitri della miscela di reazione in una provetta per PCR. Posizionare il tubo nel blocco termico ed eseguire il programma appropriato nel termociclatore PCR. Per risolvere e visualizzare gli ampliconi PCR, mescolare 10 microlitri del prodotto PCR amplificato in due microlitri di tampone di carico gel 6x e caricare questa miscela nei pozzetti di un gel di agarosio da 1,5% insieme a una scala di DNA accoppiata a 100 basi per stimare le dimensioni degli ampliconi.
Eseguire l'elettroforesi del gel nel tampone del serbatoio TAE a 80-100 volt fino a quando il colorante tracciante esegue 3/4 del gel. Quindi visualizzare le bande di ampliconi sotto un transilluminatore UV. Per preparare l'inoculo, inoculare asetticamente una singola colonia isolata purificata di resistenza agli antibiotici utilizzando un anello sterile in due millilitri di brodo Luria-Bertani, o LB, senza alcun antibiotico e incubare a 37 gradi Celsius a 80 giri / min durante la notte.
Il giorno seguente, aggiungere da 100 a 150 microlitri della coltura coltivata durante la notte a due millilitri di brodo LB fresco non selettivo e incubare per due o quattro ore fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,4-0,5. Diluire la sospensione di coltura appena coltivata utilizzando una soluzione salina sterile allo 0,85% e mescolare delicatamente per distribuire uniformemente le cellule per raggiungere una densità di coltura equivalente allo standard di 0,5 McFarland. Entro 15 minuti dalla diluizione, immergere un batuffolo di cotone sterile nell'inoculo e rimuovere la sospensione in eccesso per evitare l'inoculazione eccessiva delle piastre.
Quindi distribuire uniformemente la cultura sulla piastra di agar Mueller Hinton preparata, partendo dall'alto e andando avanti e indietro da un bordo all'altro. Quindi ruotare la piastra di 60 gradi e iniziare a tamponare di nuovo. Per posizionare i dischi antibiotici, utilizzare una pinza sterilizzata a fiamma e trasferire asetticamente i dischi antibiotici sulle piastre di agar inoculate.
Premere delicatamente i dischi per garantire un livello completo di contatto con l'agar. Posizionare il numero appropriato di dischi di antibiotico sulla piastra di agar considerando l'organismo utilizzato dall'antibiotico e le dimensioni della piastra per evitare sovrapposizioni alle zone di inibizione. Entro 15 minuti dall'applicazione del disco antibiotico, capovolgere le piastre e incubarle a 37 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno seguente, misurare la zona del diametro di inibizione in millimetri e interpretarla secondo i valori di breakpoint forniti da EUCAST. La carica batterica totale nel campione d'acqua è risultata essere 3,0 x 10 al nono CFU/mL e la carica batterica resistente agli antibiotici è risultata elevata. Gli isolati colturali di resistenza agli antibiotici sequenziati appartenevano alla famiglia delle Enterobacteriaceae e la maggior parte dei quali erano Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae.
Inoltre, sono stati identificati anche rari batteri opportunisti. Il test di sensibilità agli antibiotici mediante metodo di diffusione del disco ha mostrato un indice di resistenza agli antibiotici multipli di circa 0,2 per otto isolati, indicando un alto grado di resistenza. Tuttavia, le specie Comamonas e Arthrobacter non hanno mostrato resistenza a nessuno degli antibiotici testati.
Gli isolati coltivabili hanno rivelato la presenza di geni di resistenza agli antibiotici che codificano i fattori contro beta-lattamici, trimetoprim e aminoglicosidi. L'analisi metagenomica del DNA per la diversità batterica totale ha portato all'identificazione di 50 phyla, indicando l'elevata diversità batterica in cui i proteobatteri erano il phylum più dominante, costituito dalle classi Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria e Gammaproteobacteria. A livello di ordine, Burkholderiales era il più diffuso, appartenente alla classe dei Betaproteobacteria.
A livello generale, Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium e Comamonas erano alcuni dei batteri abbondanti. L'analisi metagenomica del DNA ha anche rivelato più geni di resistenza agli antibiotici. In questo metodo, la fase di diluizione seriale è fondamentale in quanto qualsiasi errore può portare a un'interpretazione errata del CFU totale e della carica batterica resistente agli antibiotici.
Inoltre, il diametro della zona di inibizione deve essere misurato attentamente per interpretare correttamente se l'isolato è resistente o sensibile. Utilizzando questi protocolli, oltre al campione d'acqua, qualsiasi altro campione, sia esso ambientale, alimentare o clinico, può essere studiato. Inoltre, oltre ai batteri, anche altre popolazioni microbiche in qualsiasi ecosistema possono essere studiate utilizzando approcci simili.
