Questo studio è stato sostenuto dalla Agence Nationale de la Recherche (progetto ANR-2010-BLAN-1535) e da una sovvenzione da Région Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).

1. Proteine ​​produzione e purificazione <ol><li> MEXA, MexB da Pseudomonas aeruginosa <ol><li> Trasforma i plasmidi che ospitano i geni MEXA e MexB in E. coli ceppo di produzione (ad esempio C43 DE3). Piatto su LB Agar supplementato con l&#39;antibiotico appropriato. Scegli una singola colonia per inoculare un precoltura O / N. La mattina dopo, inoculare il precoltura in 1 L di LB e di crescere a 37 ° C sotto agitazione (240 rpm). </li><li> Una volta che le cellule hanno raggiunto la fase esponenziale (OD 600 = 0,6-0,8) inducono con 1 mM IPTG. Eseguire di induzione per 2-3 ore a 30 ° C sotto agitazione. </li><li> Centrifugare le cellule (9.000 xg per 20 min) e risospendere in 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mm. </li><li> Distruggere le cellule utilizzando una pressa francese (10.000 psi, 4 pass). Eliminare le celle continue e corpi di inclusione per centrifugazione a 9.000 xg per 20 min. </li><li> Membrane pellet 1 ora a 100.000 xg e resuspend ciascun pellet in 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 20% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM. </li><li> Determinare la concentrazione totale di proteine ​​di membrana utilizzando il saggio colorimetrico BCA e solubilizzare le membrane O / N con 2% maltoside dodecil (DDM) in un volume finale determinata in modo tale detergente: proteina è 1:1,5 (w / w). </li><li> Ultracentrifuga a 100.000 xg per 1 ora di disfarsi del materiale non solubilizzato e aggregati. </li><li> Incubare il supernatante per 2 ore a 4 ° C con una resina al nichel (Mexa purificazione) o una resina di cobalto (MexB purificazione) equilibrata con Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mm, DDM 0,2%. </li><li> Versare la resina in una colonna vuota. Raccogliere il flusso attraverso. </li><li> Lavare la resina con 50 ml di Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 20% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%, poi con 25 ml di Bis-Tris 10 mM pH 6, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. </li><li> Eluire il protein con 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. </li><li> Concentrare la proteina di un dispositivo di ultrafiltrazione fino a 3 ml e il carico su una colonna dissalazione equilibrata con un buffer libero-imidazolo. Poco prima di ricostituzione (vedi sotto), Ultracentrifuge le proteine ​​solubilizzate (100.000 xg per 20 min) per sbarazzarsi di lipidi e proteine ​​unsolubilized. Poi ancora alla concentrazione della proteina di 0,3 ml. </li></ol></li><li> Batteriorodopsina da Halobacter Salinarium <ol><li> Crescere le cellule Salinarium Halobacter sotto illuminazione a 37 ° C per 10 giorni in un mezzo di crescita liquido contenente NaCl 4 M, MgSO4 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, estratto di lievito 5 g / L, e peptone 5 g / L. </li><li> Distruggere le cellule da dialisi contro acqua deionizzata. </li><li> Purificare la membrana viola su un 30-40% (w / v) gradiente di saccarosio (100.000 xg per 17 hr). </li><li> Solubilizzare la sospensione membrana con 2% octylglucoside per 24 ore a 37 ° C (volume per la solubilizzazione per risospendere membrana a 2:1 (w / w) di detergenti: rapporto di proteina). Stimare la concentrazione di BR solubilizzato con ε (570 nm) = 54.000 M -1 cm -1. Poco prima di ricostituzione (vedi sotto), Ultracentrifuge BR solubilizzato (100.000 xg per 20 min) per sbarazzarsi di lipidi e proteine ​​unsolubilized. Nota: Le membrane native sono naturalmente arricchite in BR quindi non è necessario ulteriore purificazione. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di proteoliposomi <ol><li> Formazione di liposomi: Mettere 400 ml di DOPC disciolti in cloroformio (25 mg / ml) in un bicchiere di vetro e aggiungere 1,5 mg di colesterolo memorizzato come polvere. Asciugarle appena prima manipolazione sotto un vapore di azoto o sotto vuoto per almeno 1 ora in un bicchiere di vetro. Il DOPC: rapporto molare colesterolo è 3.3:1. <ol><li> Dopo che si sono asciugati, idratare i lipidi di 1 ml di HEPES 25 mM pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM pyranine. La sospensione dovrebbe apparire torbida in questa fase. </li><li> Riscaldare la soluzione per 10 minuti a 37 ° C. Ultrasuoni per 10 min a 40 W con 30 sec impulsi, 30 cicli di pausa sec a RT. La sospensione dovrebbe apparire chiaro in questa fase. </li><li> Per ottenere una popolazione monodisperse di liposomi, eseguire due cicli di estrusione e per ogni ciclo, passare la sospensione di liposomi attraverso il filtro almeno 11x. Per il primo ciclo, utilizzare una dimensione dei pori di membrana di 200 nm e per il secondo ciclo, utilizzare una dimensione dei pori di membrana di 100 nm. Misure di scattering di luce dinamici possono essere eseguite in questa fase per verificare l&#39;omogeneità della sospensione. </li></ol></li><li> Proteine ​​incorporazione Principio: membrana proteine ​​possono essere ricostituiti in liposomi per effetto solubilizzante dei detergenti. Liposomi detergente-solubilizzati vengono incubati con la proteina di membrana detergente-solubilizzato e formazione del proteoliposomes è innescato da una rapida eliminazione del detergente con perle di polistirene 9. <ol><li> Aggiungere 28 mg di Triton X-100 (0,56% finale) e incubare O / N a 4 ° C (la temperatura di solubilizzazione può essere adattato alla proteina studiata). </li><li> Aggiungere il detersivo proteina-solubilizzato (BR, MexB e Mexa) ai liposomi solubilizzate e incubare 15 min a 4 ° C. Aggiungere le proteine ​​per la sospensione di liposomi solubilizzato i seguenti rapporti (w / w): lipidi / MexB = 20, MexB / MEXA = 2.5, e lipidi / BR = 30. </li><li> Aggiungere perle di polistirene ad un 30:1 branelli: rapporto detergente (w / w, considerando il peso totale di detersivo, compreso detersivo aggiunto con le proteine ​​purificate) e incubare 5 ore, al buio (a causa della BR) a temperatura ambiente sotto leggera mescolando. Prima di questa procedura, attivare i biobeads con metanolo ed etanolo incubazione e ampiamente lavare con acqua. </li><li> Purificare la proteina proteoliposomi e substrati gratuitamente utilizzando un PD-10colonna dissalazione equilibrata con HEPES pH 25 mM 7, K 2 SO 4 e 100 mM MgCl 2 2 mM. </li><li> Conservare le proteoliposomi a 18 ° C al buio per un massimo di 2-3 settimane. </li></ol></li><li> Valutazione dell&#39;efficacia ricostituzione su gradiente di saccarosio. Per controllare che sia il MexB e BR sono stati ricostituiti in liposomi, purificare la sospensione proteoliposome su un gradiente di saccarosio discontinuo. <ol><li> Depositarsi delicatamente i proteoliposomi su un gradiente cinque strati di saccarosio (60%, 20%, 10%, 5% e 2,5%, w / v). </li><li> Ultracentrifuga per 17 ore a 100.000 xg (con l&#39;accelerazione minima e decelerazione). </li><li> Raccogliere accuratamente le varie frazioni gradiente (in particolare le interfacce tra ogni strato di saccarosio) e analizzarli su SDS-PAGE (10%) con Coomassie colorazione o Western blotting. Proteine ​​aggregate si trovano nella parte inferiore del tubo, mentre, proteine ​​detergenti-solubilizzato nonincorporated si trovano nella parte superioreil tubo. Proteoliposomi e liposomi sono disponibili all&#39;indirizzo interfacce saccarosio corrispondenti alla loro densità intrinseca. Liposomi vuoti sono recuperate più in alto nel gradiente rispetto alle proteoliposomi. </li></ol></li></ol> 3. Fluorescenza di misura <ol><li> Effettuare misure di fluorescenza a 25,0 ° C usando un spettrofluorimetro consentendo misure a doppia lunghezza d&#39;onda (lampada Xe, 150 W). Periodi di illuminazione alternativi (per attivare BR con lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione di 550 nm / 550 nm) e misure di fluorescenza con lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione di 455 nm / 509 nm per 2 secondi per misurare la fluorescenza pyranine. Impostare eccitazione e di emissione larghezze di banda di 5 nm. Effettuare le misure in presenza di 50 nM valinomicina per impedire la formazione di un potenziale di membrana ΔΨ inverso. Nota: Infatti, poiché il BR pompe protoni, ci sono più cariche positive all&#39;interno del liposoma che all&#39;esterno. Questa caricagradiente può essere eliminata utilizzando valinomicina, che è un K + ionoforo selettiva. Una volta aggiunto alla valinomicina liposomi sospensione, come una molecola idrofobica, inserirà nella membrana del liposoma, passivamente trasportare K +, e quindi dissipare il potenziale ΔΨ membrana. </li></ol>

<ol>
	<li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us?+(Review).">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug+resistance+in+bacteria.">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li><li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump.">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li><li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism.">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li><li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism.">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li><li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134 (2009).</li><li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli.">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li><li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps.">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li><li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli.">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li><li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes:+caveats+and+keys.">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li><li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis,+edited+by+iConcept+Press.">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li><li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps.">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li></ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

Descriviamo una procedura di ricostituzione progettato per saggiare trasporto delle proteine ​​di membrana. Una volta stabilita, la procedura di ricostituzione proteina causa di misure che sono molto riproducibili. Tuttavia, le condizioni esatte per ricostituire la proteina variano da una proteina all&#39;altra. Molta cura deve essere presa per ottimizzare i seguenti parametri: i) qualità della purificazione (purezza e l&#39;assenza di materiale aggregato); ii) l&#39;efficienza della fase di detersivo solubilizzante (quando possibile, partire detersivo CMC dovrebbe essere preferito perché sono più facili da ottenere liberati); iii) desorbimento del detersivo (è ad esempio possibile combinare l&#39;uso di perle di polistirene con una fase di dialisi ma puo influenzare la velocità di desorbimento, un parametro critico per la successiva attività della proteina, vedi rif [ 9]); iv) ricostituzione lipidica (la natura chimica del lipide, il lipide rapporto proteina, la presenza di ulteriori amphiphiles sono parametri critici che devono essere varia e ottimizzati). In aggiunta la temperatura e il tempo di incubazione influenzare tutti questi problemi. Il controllo di qualità è quindi primordiale in ogni fase della procedura di ricostituzione. Da questo punto di vista, dispersione della luce è una tecnica molto conveniente perché è rapida, non distruttiva, e richiede solo 20 ml di campione ad una concentrazione nel range micromolare. Una volta formati i proteoliposomi, gradiente di saccarosio è anche di grande aiuto perché apre la strada alla verifica sistematica della ricostituzione: qualitativa (è la proteina effettivamente incorporato nella membrana del liposoma) e quantitativa (quante proteine ​​in un liposoma). Questi ultimi sarebbero trattate misurando precisamente la proteina e concentrazioni lipidiche. Il nostro test non si basa sulla titolazione del substrato stesso e questo evita considerazioni disagio per quanto riguarda possibili diffusione passiva artefatta di<html> la molecola causa di partizionamento idrofobico nelle membrane. Il test sfrutta le proprietà di pyranine come sonda affidabile e quantitativa per modifiche monitoraggio del pH. I nostri risultati sono in accordo con i risultati ottenuti con un altro procedimento in cui la formazione gradiente protonico è stato eseguito utilizzando valinomicina 10, ma consente una più robusta e riproducibile gradiente 11. Inoltre, il gradiente protonico può essere regolato con precisione, semplicemente variando la concentrazione del tampone (per maggiori dettagli si veda Verchere et al. 12). Nella procedura una misurazione di controllo viene eseguita prima in assenza del substrato (questo dà accesso all&#39;attività passiva della proteina). L&#39;attuale attività del trasportatore proteina di membrana viene misurata dopo il substrato è stato aggiunto nella stessa cuvetta. Questo è veramente un bene perché l&#39;esperimento può essere considerato un autentico, risultato, non ambiguo substrato indotta. ent &quot;&gt; Il protocollo potrebbe essere adattato per il throughput medio-alta (ad esempio 96-pozzetti misurazioni) automatizzazione perché illuminando il campione innesca la reazione. Automazione e parallelizzazione consisterebbe nel preparare una grande serie di proteoliposome, e nel dispensare aliquote in 96 -pozzetti piastra. Substrati (e anche possibili inibitori) sarebbero poi aggiunti e dopo incubazione al buio per 45 minuti il ​​piatto sarebbe stato sottoposto a cicli di misurazione della fluorescenza illuminazione / pyranine su un lettore di micropiastre. Per ulteriori informazioni sul protocollo, i lettori sono invitati a leggere Verchere et al. 12,13

Proteine ​​integrali di membrana rappresentano fino al 30% dei geni codificati in genomi eucariotici. Essi condividono un ruolo fondamentale come mantenimento del cancello (recettori), trasporto di nutrienti, ioni o composti nocivi (trasportatori) o il mantenimento della permeabilità attraverso doppi strati di membrana (canali) tra tutte le cellule viventi 1. Efflux pompe hanno un ruolo centrale nella resistenza contro la terapia antibiotica 2. Nei batteri Gram-negativi Pseudomonas aeruginosa, che è protetto da una membrana esterna, trasportatori di efflusso sono organizzati come sistemi tripartito dove MexB, la pompa di efflusso si trova nella membrana interna, funziona in combinazione con Mexa, una proteina periplasmatico, e OprM e delle canale membrana esterna. La proteina citoplasmatica membrana interna agisce come una pompa energia-dipendente con un&#39;ampia specificità di substrato. La proteina di membrana esterna funge porina mentre il terzo si trova nello spazio periplasmatico ed è pensato per stabilizzare l&#39;intero complesso <sup&gt; 3. In seguito, ci si concentra sulla progettazione di un saggio funzionale per l&#39;assemblaggio MEXA MexB. Informazioni strutturali ha accumulato negli ultimi cinque anni grazie alla determinazione di raggi X della proteina AcrB omologa da Escherichia coli 4-7. Anche se è chiaramente importante accoppiare queste informazioni con i dati dinamici e cinetici, la progettazione di un saggio funzionale per questo trasportatore è una vera sfida 8. Infatti, le proteine ​​di membrana devono essere mantenuti in un ambiente membranosa e un vano chiuso devono essere mantenuti per un trasporto vettoriale di substrato da raggiungere. Ricostituzione di proteine ​​di membrana in proteoliposomi è stato ampiamente presentato e recensito (vedi Rigaud e Levy 9). Tali protocolli consentono il monitoraggio della membrana proteine ​​attività, ad esempio seguendo i substrati attraverso la membrana del liposoma. In questo caso le limitazioni derivano dal unvailability di substrati titolabili (fluorescente, radioattivi, ecc.) e dal fatto che molto spesso questi substrati sono idrofobi e hanno la tendenza ad attraversare le membrane indipendentemente dalla presenza del trasportatore. In alternativa, si può seguire le variazioni spettroscopiche di un colorante notifica sensibile ai cambiamenti chimici che si verificano a seguito di trasporto. Come detto sopra, i protoni energizzare il trasporto via MexB. Quindi, un&#39;opzione rilevante è quello di monitorare le variazioni spettroscopiche di una segnalazione colorante sensibile al pH di seguire le variazioni di pH dovute al trasporto substrato protone-driven. La scelta di un colorante fluorescente evita qualsiasi effetto artefatti dovuti alla natura idrofoba del substrato. Un&#39;ulteriore difficoltà è la generazione di un gradiente protonico. Diversi protocolli sono disponibili in letteratura. Tra questi, l&#39;uso della tecnica valinomicina è molto diffusa ma abbiamo dimostrato che è noioso per eseguire 10-11. Inoltre ènon riproducibile e non è reversibile. Abbiamo ricorso all&#39;uso di batteriorodopsina (BR), una pompa protonica fotoattivabile da Halobacter Salinarium, un halophilic marino Gram-negativi obbligato archaeon aerobico. Questa proteina è coreconstituted nei liposomi con MexB e, sotto illuminazione, BR pompe protoni all&#39;interno dei liposomi e quindi crea il ΔpH (acido all&#39;interno) necessario per la proteina di trasporto del substrato 12-13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1051">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">850375C</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">B2261</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:344px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">93427</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Valinomycin</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">V-1644</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)</td>
			<td style="width:344px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">H-348</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">DDM (n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside)</td>
			<td style="width:344px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:344px;">D310LA</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)</td>
			<td style="width:344px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:344px;">610000</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Biobeads SM-2 Adsorbents</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Econo-Pac Chromatography empty column</td>
			<td style="width:344px;">Biorad</td>
			<td style="width:344px;">732-1010</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Desalting columns</td>
			<td style="width:344px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:344px;">54805</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Dynamic light scattering instrument</td>
			<td style="width:344px;">Wyatt Technology</td>
			<td style="width:344px;">DynaPro NanoStar</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Fluorometer JASCO FP-6200</td>
			<td style="width:344px;">JASCO</td>
			<td style="width:344px;">6816-J002A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro investigation of the mexab efflux pump from pseudomonas aeruginosa

C&#39;è un bisogno emergente scientifico di strumenti affidabili per il monitoraggio del trasporto delle proteine ​​di membrana. Presentiamo una metodologia che porta alla ricostituzione di pompe di efflusso da batteri Gram-negativi Pseudomonas aeruginosa in un ambiente biomimetico che consente una accurata indagine della loro attività di trasporto. Siano soddisfatte tre condizioni preliminari: compartimentazione in un ambiente lipidico, l&#39;uso di un indice rilevante per i trasporti, e la generazione di un gradiente protonico. Il trasportatore proteina di membrana viene ricostituito in liposomi insieme con batteriorodopsina, una pompa protonica attivato dalla luce che genera un gradiente protonico che sia robusto e reversibile e regolabile. L&#39;attività della proteina è dedotto dalle variazioni di pH che si verificano all&#39;interno del liposoma, utilizzando pyranin, una sonda fluorescente pH-dipendente. Descriviamo una procedura passo-passo dove purificazione di proteine ​​di membrana, la formazione di liposomi, proteine ​​ricostituzione, e un trasportonalisi sono rivolte. Anche se sono stati progettati specificamente per un trasportatore RND, i metodi descritti potrebbero potenzialmente essere adattati per l&#39;uso con qualsiasi altra proteina di membrana trasportatore alimentato da un gradiente protonico.

Il test consiste nel monitorare pyranine fluorescenza in funzione del tempo, mentre viene generato un gradiente protonico. A questo scopo, i campioni sono sottoposti, in alternativa all&#39;illuminazione (quindi protoni di pompaggio dalla BR è attivato) e poi a fluorescenza misurazione con l&#39;eccitazione e l&#39;emissione lunghezze d&#39;onda della pyranine (λ ex = 455 nm e λ em = 509 nm). La Figura 1 mostra un controllo rappresentativo ottenute con il test, in assenza di Mexa / MexB, verificare che il gradiente protonico generato dalla BR è reversibile. Dopo un ciclo di acidificazione, proteoliposomi vengono tenuti al buio per 45 minuti in modo che il BR di smettere di pompare protoni (protoni diffondono lentamente e passivamente attraverso doppi strati lipidici dopo il loro gradiente di concentrazione). Dopo questo tempo di recupero, l&#39;attivazione di BR è possibile, semplicemente illuminando di nuovo la stessa sospensione. Figura 2corrisponde ad una misura effettiva trasporto. Un controllo negativo con proteine ​​liposomi gratuite mostra che, come previsto, il pH è costante su di illuminazione (Figure 2A e 2B, cerchi arancioni). Tuttavia, proteoliposomi contenenti BR nelle loro membrane non pompa protonica, quindi il pH all&#39;interno diminuisce liposomi e un gradiente stabile è costruito (Figure 2A e 2B, piazze viola). Triangoli grigi e diamanti rossi (Figura 2A) rappresentano pH all&#39;interno di proteoliposomi contenenti BR e MexB, in presenza o in assenza di Hoechst 33342, rispettivamente. Osserviamo un&#39;attività substrato-indipendente dove il gradiente di protoni è solo parzialmente dissipata dal MexB contro-trasporto. Noi attribuiamo questa osservazione ad una attività basale di MexB. Al fine di testare l&#39;effetto di Mexa sull&#39;attività di MexB, Mexa stato aggiunto alla ricostituzione, prima in assenza di qualsiasi substrato ( <strong&gt; Figura 2B, diamanti blu). Ancora una volta, il gradiente protonico generato dalla BR è solo parzialmente dissipata. La misurazione effettiva trasporto è realizzata sul campione stesso. Precedentemente, il gradiente protonico deve essere inizializzato, il substrato deve essere aggiunto nella sospensione per raggiungere suo sito di legame della proteina. Per questo scopo la sospensione viene incubata al buio in presenza del substrato per 45 min. Al successivo illuminazione, si può vedere che il gradiente protonico generato dalla BR è ora totalmente dissipata dal MexAB (Figura 2B, triangoli verdi), in conseguenza del trasporto substrato dalla pompa. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . Figura 1 Reversibilità del gradiente protonico costruito da illuminazione BR: Pyranine fluorescence di proteoliposomi BR misurati in funzione del tempo. Da 0-15 min, BR pompe protoni a seguito dell&#39;attivazione luce. Da 15-60 min, proteoliposomi vengono incubati al buio, durante questo tempo, protoni passivamente muovono fuori dei liposomi fino a pH intravesicular e pH extravesicular sono uguali. Dal 60-75 min, BR è ancora funzionante e pompe di protoni su illuminazione. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . Figura 2 Transport saggio: pyranine fluorescenza, convertito nel corrispondente variazioni di pH, in funzione del tempo A) pH all&#39;interno dei liposomi di controllo (cerchi arancione); pH all&#39;interno di proteoliposomi contenenti BR nella membrana (quadrati viola); pH all&#39;interno. di proteoliposomi contenenti BR, e MexB nella membrana senza Hoechst 33342 (rosso diamonds); pH interno del proteoliposomi contenenti BR e MexB nella membrana con Hoechst 33342 (triangoli grigi) B) pH all&#39;interno dei liposomi di controllo (cerchi arancioni);. pH all&#39;interno del proteoliposomi contenenti BR nella membrana (piazze viola); pH interno di proteoliposomi contenenti BR, MexB e MEXA nella membrana, senza Hoechst 33342 (diamanti blu); pH interno del proteoliposomi contenenti BR, MexB e MEXA nella membrana con Hoechst 33342 (triangoli verdi).

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In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

Vi presentiamo un protocollo per lo studio in vitro delle pompe di efflusso da Pseudomonas aeruginosa. Questo protocollo consente la generazione di un robusto, reversibile e regolabile gradiente protonico all&#39;interno della membrana del liposoma e quindi dovrebbe essere adattabile a qualsiasi proteina di membrana eccitato dalla forza protomotive.

In vitro Indagine della MexAB Efflux pompa da Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

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In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

11.8K Views.  CNRS & Université Paris Descartes.  Vi presentiamo un protocollo per lo studio in vitro delle pompe di efflusso da Pseudomonas aeruginosa. Questo protocollo consente la generazione di un robusto, reversibile e regolabile gradiente protonico all'interno della membrana del liposoma e quindi dovrebbe essere adattabile a qualsiasi proteina di membrana eccitato dalla forza protomotive. 

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Ricerca

Biologia

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

MALDI-Mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Root noduli

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Sincronizzazione di<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Per Indagine del ciclo cellulare batterica

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Misure contrattilità isolati su muscoli papillari per le inchieste sui Cardiac inotropo nei topi

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Migliorare l'accuratezza del flusso Valutazione citometrica del potenziale della membrana mitocondriale nelle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici attraverso l'inibizione delle pompe di efflusso

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Isolamento dei nuclei dal rene di topo adulto per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Isolamento di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali per studi elettrofisiologici

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Analisi unicellulare dell'espressione dei geni di Pseudomonas syringae all'interno del tessuto vegetale

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Studio del meccanismo di trasporto dello zinco nelle cellule di mammifero con il saggio FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Autore in primo piano: Esplorare la regolazione cellulare dello zinco attraverso la funzionalità ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Caratterizzazione dei trasportatori di zinco nei mammiferi mediante un saggio di trasporto dello zinco in vitro

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...