L&#39;autore desidera ringraziare tutta la mia laurea di Ricerca Indipendente Studenti e tutti i miei microbica Fisiologia studenti laureati che hanno testato le mie idee trasposone mutagenesi durante i semestri di primavera 2010-2014. Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento di Scienze Biologiche presso Youngstown State University.

1. elettroporazione di cellule competenti 5,11 <ol><li> Diluire un O / N cultura LB di Enterobacter sp. YSU 1/20 in 50 ml di terreno LB fresco e crescere con agitazione a 120 rpm e 30 ° C ad un OD (600 nm) tra 0,4 e 0,6. Facoltativamente, crescere altri ceppi batterici alla loro temperatura di crescita ottimale. </li><li> Raffreddare le cellule in ghiaccio per 5 min e centrifugare a 4 ° C e 7.000 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere le cellule in 50 ml di acqua ghiacciata sterile e centrifugare a 4 ° C e 7.000 xg per 5 min. Ripetere questo passaggio. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in un volume di acqua ghiacciata pari al volume pellet. Per la conservazione a lungo termine, lavare le cellule con 10 ml di ghiaccio freddo 10% (v / v) glicerolo, risospendere in un volume uguale di pellet di ghiaccio freddo 10% (v / v) glicerolo, conservare a -80 ° C, e disgelo in ghiaccio prima elettroporazione. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di transposome a 40 ml dicellule. La soluzione transposome disponibile in commercio viene fornito ad una concentrazione di DNA di 0,33 mg / mL. Sebbene 0,33 mg è raccomandato, 0,165 mg DNA è sufficiente. </li><li> Posizionare la miscela di cellule / transposome in ghiacciata, 0,2 mm, elettroporazione cuvetta e toccare la miscela sul fondo della cuvetta. Shock le cellule a 25 uF, 200 Ω, e 2,5 kV. Al fine di garantire che le cellule rimangono refrigerati, memorizzare le cuvette elettroporazione in un freezer -20 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Immediatamente, aggiungere 960 ml di filtro sterilizzati brodo eccellente ottimale con la repressione da cataboliti (SOC) di media. Mescolare pipettando su e giù e trasferire le cellule ad una sterile 1,5 ml provetta da microcentrifuga. NOTA: Le cellule iniziano a morire dopo lo shock, ma il sale nel mezzo SOC permette loro di recuperare. Per risparmiare, non è necessario aggiungere transposome o urti cellule di controllo negativo. Basta aggiungere 960 ml di mezzo SOC sterile ad esso. </li><li> Incubare le cellule a 30 ° C fo 45-60 min con agitazione a 120 rpm. Ciò fornisce il tempo per la transposome di ricombinarsi con il genoma ospite e per le celle di esprimere la resistenza alla kanamicina. </li><li> Distribuire 100 microlitri di cellule su una piastra di agar LB-kan e incubare la piastra di O / N a 30 ° C. Conservare la miscela trasformazione rimanente in frigorifero a 4 ° C. Stendere importi aggiuntivi in ​​un secondo momento fino a 2 settimane dopo l&#39;elettroporazione iniziale, se necessario. </li></ol> 2. Gridding di trasformanti <ol><li> Nastro una griglia al coperchio di un piatto 100 x 15 mm di Petri vuota. Copiare una griglia da &quot;Un corso breve in Genetica batterica&quot; ​​12. </li><li> Tracciare una linea sul fondo di una piastra di agar LB-kan. Utilizzare un piccolo pezzo di nastro per ancorarlo al coperchio con griglia in modo che la griglia è visibile attraverso l&#39;agar. Assicurarsi che la linea sulla parte inferiore della piastra è allineata con la parte superiore, centro della griglia. Ancoraggio del piatto con del nastro impedisce di scivolare, consentendo anche gridding. La linea facilita l&#39;identificazione delle colonie dopo la replicazione delle piastre. </li><li> Scegliere un singolo trasformante con uno stuzzicadenti sterile e posto nel centro di un quadrato nella griglia. Basta toccare la colonia e il posto. Non scavare il stuzzicadenti nel agar. Per evitare di contaminare la piastra, gestire lo stuzzicadenti ad una sola estremità. </li><li> Spot altro trasformante in una casella adiacente come al punto 2.3. Quando la piastra è pieno, incubare O / N a 30 ° C. Questa è la piastra master. </li></ol> 3. Replica Plating determinare il fenotipo Auxotroph 12 <ol><li> Per ogni piastra che è stato grigliata; fare una pila di tre piastre di agar fresco numerati da uno a tre: uno per LB-kan, due per M-9-kan e tre per LB-kan. Essiccare le piastre a testa in giù, O / N a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Tracciare una linea sulla parte superiore di ciascuna piastra come al punto 2.2. </li><li> Pulire lo strumento replicazione delle piastre con il 70% di etanolo, posizionare un quadrato di velluto sterile in cima alla replicazione delle piastre diolo e bloccare la piazza velluto verso il basso. Le mani sono ricchi di microbi anche dopo il lavaggio loro. Evitare l&#39;introduzione di contaminanti microbi gestendo la piazza velluto dal bordo. </li><li> Allineare la linea sulla piastra principale con una linea tracciata sul morsetto e posizionare la piastra di sopra del quadrato velluto. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri dalla piastra alla piazza velluto. Fare attenzione a non imbrattare i batteri. Rimuovere la piastra principale dalla piazza velluto. </li><li> Allineare la linea tracciata su una targa con la linea sulla pinza e posizionarlo sulla parte superiore della piazza velluto. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri dalla piazza velluto alla piastra. Rimuovere un numero di targa. </li><li> Eliminare la piazza velluto in un bicchiere di acqua e mettere un pulito, sterile, velluto piazza sullo strumento di replicazione delle piastre come descritto al punto 3.3. Questo passaggio impedisce over-inoculazione che causa la crescita svolta e dei risultati falsi positivi. </li><li> Allineare illine sul numero uno piastra con la linea sul morsetto e posizionarlo sulla parte superiore della nuova piazza velluto. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri di targa uno alla piazza velluto. Rimuovere un numero di targa. </li><li> Allineare la linea tracciata sul numero due piastra con la linea sul morsetto e posizionarlo sulla parte superiore della piazza velluto. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri dalla piazza velluto di numero due piatto. Rimuovere numero due piatto. </li><li> Ripetere il punto 3.8 per il numero di targa tre. La terza piastra è un controllo per il trasferimento completo dalla piastra master agli altri due piastre. Eliminare la piazza velluto in un bicchiere d&#39;acqua. Per riutilizzare le piazze di velluto, sterilizzare in autoclave il bicchiere contenente le piazze di velluto contaminati, lavarli, asciugarli, avvolgerli in un foglio di alluminio e li ri-sterilizzare in autoclave. </li><li> Incubare le piastre a 30 ° CO / N. Le colonie che crescono su entrambe le piastre di agar LB-kan, ma non riescono a crescere su piastre M-9-kan sono considerati auxotrofi ( <strong&gt; Figura 2). </li><li> Streak fuori auxotrofi da un numero di targa su una piastra di agar LB-kan fresca e incubare la piastra a 30 ° CO / N. </li><li> Streak per isolamento 3 colonie dalla piastra striscia al punto 3.11 su una piastra LB-kan fresco. Incubare la piastra a 30 ° CO / N. Questo assicura che il mutante è ben isolato. Dividere il piatto in tre parti e strisciare fuori ogni colonia in una sezione. </li><li> Colonie Spot dalle colonie strisciate derivanti dal passaggio 3.12 su una piastra di LB-kan fresca per formare una griglia, come nei passaggi 2.1-2.4. Ogni mutante viene ri-testato in triplicato. </li><li> Replicare nuovo piatto come nei passaggi 3,1-3,10 per confermare il fenotipo auxotroph. </li></ol> 4. Gene Rescue <ol><li> Grow 3 ml O / N di una coltura isolata colonia mutante dal punto 3.13 nel mezzo liquido LB-kan a 30 ° C. Purificare il DNA genomico da 1 ml di coltura usando un kit di purificazione del DNA genomico disponibile in commercio. </li><li> Impostare una miscela di 0.025 UBFU CI endonucleasi di restrizione e 14 microlitri di 1 mg / mL di DNA genomico in una reazione di 20 microlitri su ghiaccio. Poiché BFU CI taglia il trasposone a dodici siti diversi, può essere più efficiente utilizzare endonucleasi di restrizione, Bfa I o Hae III, che taglia il trasposone a due e tre siti diversi, rispettivamente. </li><li> Incubare la reazione a 37 ° C per 25 min e poi a 80 ° C per 20 minuti per inattivare l&#39;enzima. Analizzare 3 ml di DNA parzialmente digerito su un gel di agarosio 0,8% (Figura 3). Un successo i risultati di digestione parziali in uno striscio di superiori a 10 kb fino al fondo del gel. </li><li> Legare 15 microlitri di DNA genomico parzialmente digerito con 800 unità di T4 DNA ligasi in una reazione 500 microlitri. Incubare la reazione di O / N a 4 ° C. Il volume di reazione ampio massimizza la legatura dei singoli frammenti a se stessi e minimizza le interazioni tra due o più frammenti di DNA. </li><li> Precipitazionite il DNA ligato aggiungendo 50 ml di 3 M acetato di sodio, pH 5,5, e 1 ml di etanolo al 95% e incubando è a -20 ° C per 20 min. </li><li> Microcentrifuga il DNA a 4 ° C e 13.500 xg per 10 min, lavare il pellet con il 70% di etanolo, asciugare in un concentratore a vuoto centrifuga, e risospendere in 10 ml di acqua priva di nucleasi. In alternativa, il DNA può essere essiccato all&#39;aria a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Utilizzare 4 ml di DNA risospeso per trasformare E. coli ceppo ECD100D pir o ECD100D pir116 mediante elettroporazione come nel paragrafo 1. L&#39;origine di replica γ R6k richiede un ceppo batterico con un gene pir per replicare 6. I risultati di deformazione pir in plasmidi copia bassi, e il ceppo pir116 contiene un gene mutante pir che si traduce in plasmidi alta copia. Ogni trasformante contiene un nuovo plasmide con il trasposone e una regione del cromosoma interrotto (Figura 1E). </li><li> Inoculate 5 ml di terreno LB-kan con una singola colonia, crescere O / N con agitazione a 120 rpm e 37 ° C, e purificare DNA plasmidico dal / coltura intera O N utilizzando un kit commerciale. </li><li> Digest 14 ml di plasmide usando l&#39;endonucleasi di restrizione Xho I. Assicurarsi che il volume finale della reazione è di 20 microlitri. Questo enzima riconosce un sito della metà del trasposone all&#39;estremità 5 &#39;del gene di resistenza alla kanamicina. Analizzare 10 ml di non digerito e digerito plasmide su un gel di agarosio 0,8% (Figura 3). Il plasmide è costituito dal 2 kb trasposone più accompagnamento DNA ospite. </li></ol> Sequencing 5. DNA <ol><li> Sequenza plasmide utilizzando un kit disponibile in commercio sequenziamento, primer che sono omologhe a ciascuna estremità del trasposone, e un sistema di analisi di sequenziamento capillare. In alternativa, il plasmide può essere spedito in un istituto esterno per il sequenziamento. </li><li> Utilizzare lo standard di peso molecolare (1 kb scala) inil gel di stimare le dimensioni del plasmide. Poi, stimare il numero di nanogrammi (ng) di plasmide che è necessario per il 50 fmol. </li><li> Misurare la concentrazione del DNA plasmidico utilizzando uno spettrofotometro a lunghezze d&#39;onda di 260 nm (A 260) e 280 nm (A 280). Assicurarsi che la lunghezza del percorso della luce attraverso la cuvetta è di 1 cm. Determinare la concentrazione moltiplicando l&#39;assorbanza a 260 nm da 50 ng / ml. Alta qualità DNA plasmidico avrà un A 260 / A 280 Rapporto tra 1,8 e 2,0. </li><li> Il volume di DNA richiesto per ogni reazione di sequenziamento è il numero di ng necessario per il 50 fmol divisa per la concentrazione del plasmide. Mescolare il volume del plasmide richiesto con acqua per portare il volume totale di 10 microlitri. </li><li> Riscaldare la miscela di DNA plasmidico / acqua a 96 ° C per 1 min e poi raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 8 ml di master mix dal kit di sequenziamento e 2 ml di 1,6 mM di uno dei primer di sequenziamento. </li><li> Folbasso il protocollo del kit di sequenziamento per il programma termociclatore e la reazione di pulizia. </li><li> Analizzare ogni campione utilizzando un sistema di analisi del DNA capillare. </li><li> Utilizzare un pacchetto software disponibile in commercio per visualizzare la sequenza del DNA. Ricercare la sequenza &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;&quot;, che è l&#39;ultimo 7 bp del trasposone (Figura 4). La sequenza prima estremità 5 &#39;di questo segmento 7 bp appartiene al trasposone. La sequenza dopo all&#39;estremità 3 &#39;di questo segmento 7 bp appartiene al gene interrotto. </li><li> Determinare la possibile funzione del gene interrotto utilizzando il Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 di base. Utilizzare la seguente link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Incollare la sequenza di interrupted gene nella casella di ricerca, selezionare &quot;Altro&quot; sotto la base di dati e clicca su &quot;BLAST&quot; in fondo alla pagina. Quando viene visualizzato il risultato, scorrere la pagina per visualizzare i risultati di allineamento (Figura 5). </li></ol>

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L&#39;autore non ha nulla da rivelare.

Mutagenesi trasposone utilizzando un transposome è uno strumento efficace per la generazione di auxotrofi in Enterobacter sp. YSU e altri tipi di Gram-negativi e batteri Gram-positivi 3,4. Il processo è stato avviato con l&#39;introduzione della Tn 5 transposome -derived nell&#39;ospite mediante elettroporazione. Per identificare colonie con inserti, il ceppo di destinazione non trasformata doveva essere sensibili alla kanamicina per la selezione per il marcatore di resistenza portata dal ...

Prototrofici batteri crescono in M-9 sali minimi terreno contenente glucosio (M-9 medio), la conversione del glucosio attraverso percorsi metabolici carbonio centrali per generare precursori, come amminoacidi, acidi nucleici e vitamine, per biosintesi 1. M-9 terreno contiene cloruro di ammonio come fonte di azoto, sodio e fosfato di potassio come buffer e fonte di fosforo, solfato di magnesio come fonte di zolfo e glucosio come fonte di carbonio e di energia. Luria-Bertani (LB) mezzo è ricco di aminoacidi da tryptone e di vitamine e fattori di crescita da estratto di lievito. Esso supporta la crescita di auxotrofi che non possono sintetizzare aminoacidi, vitamine e altri fattori di crescita necessari per la crescita su M-9 medie. Così, prototrofi cresceranno in LB e M-9 medie, che auxotrofi cresceranno in terreno LB ma non in M-9 medie. Con l&#39;introduzione di mutazioni in una popolazione prototrofici di batteri e di identificare geni mutati che causano fenotipi auxotrofi, è possible per ottenere una migliore comprensione del metabolismo in un ceppo batterico. Transposon mutagenesi può essere utilizzato per identificare molti dei geni necessari per la crescita su glucosio nel M-9 medie. I trasposoni si inseriscono in modo casuale nel genoma dell&#39;ospite 2. Individuando trasformanti trasposoni su piastre di agar LB e replica li placcatura su piastre M-9 agar, è possibile selezionare per auxotrofi. Geni interrotti sono identificati attraverso il salvataggio del gene. Questo studio utilizza un Tn disponibile in commercio 5 -derived transposome che viene fornito come una soluzione di un segmento di DNA trasposone lineare mescolato con proteine ​​trasposasi. Il segmento di DNA manca un gene trasposasi, ma contiene un gene per la resistenza alla kanamicina, una origine di replicazione γ R6K e due motivi mosaico che sono sequenze di DNA per trasposasi vincolanti a ciascuna estremità del segmento 3,4. Poiché la proteina trasposasi viene aggiunto direttamente al DNA, il segmento di DNA da solodefinito come il trasposone, e il complesso proteico DNA / trasposasi è definito come il transposome. Il transposome viene trasformato mediante elettroporazione 5 in un kanamicina ospitante sensibile (Figura 1A). Le colonie che crescono su piastre di agar LB contenenti kanamicina (LB-kan) hanno inserti di trasposoni (Figura 1B), e replica placcato trasformanti che non riescono a crescere su M 9-piastre di agar contenenti kanamicina (M-9-kan) sono auxotrofi (Figire 1C). DNA genomico da un mutante è purificata e parzialmente digerito con 4-base restrizione taglio endonucleasi, BFU CI (Figura 1D). Il DNA ligato si trasforma in un ceppo di Escherichia coli (E. coli) che contiene il gene pir (Figura 1E). Questo gene permette il nuovo plasmide contenente il trasposone e fiancheggiante regione cromosomica ospite di replicare in E. coli 6. Il gene di resistenza alla kanamicina funge damarcatore eleggibile per il nuovo plasmide. Infine, sequenziamento usando primers complementari a ciascuna estremità del trasposone e Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Analisi 7,8 della sequenza risultante viene utilizzata per determinare l&#39;identità dei geni interrotti. Questa strategia transposome mutagenesi offre tre vantaggi 3. In primo luogo, poiché la proteina trasposasi è legato direttamente al trasposone, inserimento non dipende espressione del gene trasposasi all&#39;interno dell&#39;ospite. Una volta che il trasposone in sé incorpora nel genoma dell&#39;ospite, la trasposasi è degradato, impedendo il movimento addizionale del trasposone. Tuttavia, il movimento supplementare non può essere evitata se l&#39;host possiede un elemento endogeno Tn 5 traspositivo. In secondo luogo, l&#39;introduzione del transposome mediante elettroporazione permette di utilizzarlo in un&#39;ampia varietà di ospiti. Inoltre, elimina la necessità di introdurre il trasposone per coniugazione batterica o viinfezione ral. Entrambi i processi richiedono suscettibilità dell&#39;ospite. Terzo, l&#39;inserimento del gene per la resistenza alla kanamicina e l&#39;origine di replicazione γ R6K nel transposome rende più facile identificare il gene interrotto. Regioni trasposone-interrotto possono essere memorizzati e sequenziati come plasmidi, eliminando la necessità di utilizzare la reazione a catena della polimerasi inversa (PCR) per l&#39;identificazione del gene. Il protocollo presentato in questo video descrive ogni passo per trasposone mutagenesi di Enterobacter sp. YSU 9 utilizzando un transposome dalla sua introduzione nelle cellule batteriche per l&#39;identificazione del gene putativo è interrotto. Oltre ai protocolli precedentemente pubblicati 3,4,10, metodi dettagliati per l&#39;utilizzo di replicazione delle piastre per lo screening auxotrofi sono presentati. Questa tecnica di mutagenesi possono essere utilizzate per indagare altri fenotipi, quali antibiotici e metallo resistenze, in diversi tipi di batteri, per identcando il numero minimo di geni necessari per la crescita in condizioni di coltura definiti in studi di biologia sintetica, o per l&#39;insegnamento di un componente di un laboratorio di genetica o corso di fisiologia microbica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Tn5 R6K&#947;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">TSM08KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">ECP09500</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a low copy number</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">EC6P095H</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a high copy number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5X M-9 Salts</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF048517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lennox LB Broth</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J637-1KG</td>
			<td style="width:227px;">Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kanamycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0408-25G</td>
			<td style="width:227px;">When required, media contained 50 &#956;g/ml kanamycin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose Monohydrate</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J850-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;">0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BfuC I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0636S</td>
			<td>Partial digestion of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xho I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td>Plasmid digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">E476-1L</td>
			<td style="width:227px;">For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">608120</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1460</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica Plating Block</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen Squares</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-2</td>
			<td>Replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PetriStickers</td>
			<td style="width:145px;">Diversified Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PSTK-1100</td>
			<td>Grid for replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II</td>
			<td style="width:145px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electroporation Cuvettes &#8211; 2 mm</td>
			<td style="width:145px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-5010-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td>
			<td style="width:145px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970010</td>
			<td>Drying DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CEQ 2000XL DNA Analysis System</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NTI Advance 11.5.0</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12605099</td>
			<td>DNA sequence analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Prototrofici batteri crescono su M-9 sali minimi mezzo addizionato con glucosio (M-9 medio), che viene utilizzato come fonte di carbonio e di energia. Auxotrofi possono essere generati utilizzando un transposome. Il commercialmente disponibile, Tn 5 transposome -derived utilizzato in questo protocollo è costituito da un segmento lineare di DNA contenente una origine di replicazione γ R6K, un gene per la resistenza alla kanamicina e termina due sequenze mosaico, che servono come siti di legame trasposasi. Il transposome, fornito come un complesso proteico DNA / trasposasi, viene introdotta mediante elettroporazione nel ceppo prototrofici, Enterobacter sp. YSU, e si inserisce in modo casuale nel genoma di questo host. I trasformanti sono placcati in replica su Luria-Bertani agar piastre contenenti kanamicina, (LB-kan) e su piastre di agar M-9 medie contenenti kanamicina (M-9-kan). I trasformanti che crescono su piastre LB-kan, ma non su piastre M-9-kan sono considerati auxotrofi. Genomico purificatoDNA da un auxotroph è parzialmente digerito, legata e trasformato in un pir + Escherichia coli (E. coli) ceppo. L&#39;origine di replicazione R6Kγ permette il plasmide di replicare in pir + E. ceppi di coli, e il marcatore di resistenza alla kanamicina consente per la selezione plasmide. Ogni trasformante possiede un nuovo plasmide contenente il trasposone affiancato dalla regione cromosomica interrotto. Sanger sequenziamento e il Local Alignment Search Tool di base (BLAST) suggeriscono una identità putativo del gene interrotto. Ci sono tre vantaggi nell&#39;utilizzo di questa strategia mutagenesi transposome. In primo luogo, non si basa sulla espressione di un gene trasposasi dall&#39;host. In secondo luogo, il transposome viene introdotto nel host di destinazione mediante elettroporazione, piuttosto che per coniugazione o trasduzione e quindi è più efficiente. In terzo luogo, l&#39;origine di replicazione R6Kγ rende facile identificare il g mutatoene che è parzialmente recuperato in un plasmide ricombinante. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare i geni coinvolti nelle altre caratteristiche di Enterobacter sp. YSU o di una più ampia varietà di ceppi batterici.

Trasformazione di Enterobacter sp. YSU mediante elettroporazione con il transposome avviato inserimento genoma casuale nel genoma dell&#39;ospite (Figura 1A, B). Un elettroporazione di successo ha prodotto diverse migliaia di trasformanti che crescono su piastre LB-Kan. Per ottenere 300-400, colonie per piastra ben distanziati, la quantità di trasformazione miscela diffusione su ciascuna piastra di agar LB-kan è stato ottimizzato. Ogni trasformante conteneva almeno un inserto trasposoni, ma n...

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Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU cresce in glucosio sali minima quantità di terreno. Auxotrofi sono generati trasformandola con transposome che si inserisce in modo casuale nel genoma dell&#39;ospite. Mutanti si trovano di replicazione delle piastre da medie complesso terreno minimo. Geni interrotti sono identificati da salvataggio e sequenziamento del gene.

Generazione di<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofi Utilizzando Transposon Mutagenesi

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K Views.  Youngstown State University.  Enterobacter sp. YSU cresce in glucosio sali minima quantità di terreno. Auxotrofi sono generati trasformandola con transposome che si inserisce in modo casuale nel genoma dell'ospite. Mutanti si trovano di replicazione delle piastre da medie complesso terreno minimo. Geni interrotti sono identificati da salvataggio e sequenziamento del gene. 

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Ricerca

Biologia

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenesi sito fatto in casa Regia di Plasmidi Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generazione di DNA / RNA ibrido nel DNA genomico da trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Singolo ovociti Mutagenesi bisolfito

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Un protocollo per la valutazione funzionale del Whole-Protein Saturazione mutagenesi biblioteche Utilizzando High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...