Per iniziare, prelevare il campione di tessuto tumorale digerito e pidocchiare i globuli rossi. Centrifugare il campione a 450 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il supporto, risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di isolamento.
Dopo aver ripetuto la centrifugazione, risospendere il pellet in 100 microlitri di terreno di isolamento. Trasferire 100 microlitri di campione in un pozzetto di una provetta per PCR da 0,2 millilitri. In una cappa di biosicurezza, aggiungere al campione 10 microlitri ciascuno di cocktail di annessina V e cocktail di selezione della biotina.
Pipettare, miscelare la soluzione e incubare a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi, agitare le particelle magnetiche rivestite di destrano per 30 secondi. Mescolare 20 microlitri di microsfere e 60 microlitri di terreno isolante con il campione.
Dopo tre minuti, posizionare la provetta a strisce su un separatore magnetico 10x Genomics sull'impostazione alta per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi trasferire il liquido dalla provetta a strisce senza disturbare le perle in una nuova provetta per microcentrifuga a basso legame da 1,5 millilitri. Centrifugare la provetta come dimostrato in precedenza e risospendere il pellet in un volume appropriato del nostro media PMI in base alla dimensione del pellet.
Infine, contare le cellule in un emocitometro. Dopo la rimozione delle cellule morte, la conta delle cellule vive era di 4,9 volte 10 alla potenza di 5 per millilitro, con una vitalità superiore al 90%
