Trasfezione del parassita malarico allo stadio anulare con plasmidi funzionali al ricablaggio del trascrittoma

Per iniziare, procurati i parassiti dello stadio ad anello sincronizzato con sorbitolo di plasmodium falciparum. Preparare 50 millilitri di tampone 2x cytomix e diluirlo 1 a 1 con acqua sterile. Quindi, lavare due volte 100 microlitri di globuli rossi parassitati ad anello impaccati con 5 millilitri di tampone citomix 1X e centrifugarli a 994 G per tre minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso il tampone, aggiungere 50 microgrammi di ciascun plasmide nelle cellule, seguiti da un volume appropriato di tampone 2x. Regolare il volume a 400 microlitri con 1x tampone prima di trasferire la soluzione preparata in cuvette da 0,2 centimetri per ogni trasfezione. Quindi, elettroporare le celle con cura.

Dopo l'elettroporazione, mescolare e incubare le cellule con un mezzo RPMI completo in un pallone T25 con un volume totale di 15 millilitri. Quindi, centrifugare i parassiti trasfettati in una provetta conica da 50 millilitri a 994 G per tre minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, lavare i parassiti con 10 millilitri di RPMI incompleto.

Coltivali con RPMI completo fresco per due giorni, reintegrando il terreno dopo 24 ore. Dopo 48 ore, rimuovere l'indice di massima pressione dal pallone. Risospendere la coltura in RPMI completo additivato con farmaci.

Incubare la coltura in una fiaschetta T75 insieme a 400 microlitri di globuli rossi freschi per due settimane Il giorno 14, aliquotare 200 microlitri della coltura trasfettata in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare la provetta a 500 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aspirato il surnatante, trasferire le cellule su un vetrino e posizionare un altro vetrino su di esso con un angolo di 45 gradi per fare uno striscio.

Dopo la fissazione con metanolo, immergere il vetrino nel colorante Giemsa per 20 minuti. Lavare lo scivolo sotto l'acqua corrente e asciugarlo accuratamente. Osservare il vetrino al microscopio ottico con un ingrandimento di 100x dopo aver applicato l'olio da immersione.

Una volta visualizzati i parassiti, reintegrare il terreno ogni giorno per due o tre giorni.