Questo protocollo dimostra come la microscopia In Vivo Two-Photon possa essere utilizzata per eseguire la visualizzazione ripetitiva della dinamica cellulare, nella stessa posizione cerebrale per lunghi periodi di tempo. Il vantaggio di questa tecnica è che, permette di immaginere i cambiamenti a lungo termine negli elementi cellulari del cervello, compresa la disposizione, la morfologia e le interazioni fisiche tra il diverso tipo di cellula del SNC. Questa tecnica può essere particolarmente utile per suscitare interazioni cellula-cellula, dinamica cellulare e cambiamenti morfologici durante la plasticità cerebrale e la neurodegenerazione.
Inizia preparando un giovane o giovane adulto, dai quattro ai 10 settimane, un topo eterozigote CX3CR1 GFP, che pesa da 17 a 25 grammi, per un impianto cranicio della finestra. Dopo aver anestetizzato il topo, usa un trimmer per capelli per radere i capelli sulla testa, tra le orecchie, approssimativamente, dal livello degli occhi, alla parte superiore della regione del collo. Spostare il mouse nella stazione di chirurgia stereotassia, cono del naso e stabilizzare la testa usando le barre dell'orecchio.
Mantenere il mouse sulla pastiglia di riscaldamento, durante tutta la procedura. Lubrificare entrambi gli occhi con unguento ad olio, quindi iniettare 100 microlitri dello 0,25% di bupivacaina e 100 microlitri di quattro milligrammi per millilitro desametasone, per via sottocutanea nel sito di incisione. Attendere almeno cinque minuti prima di procedere.
Sanguinare la testa rasata, con tre tamponi alternati di betadina e il 70% di alcol. Quindi fare un'incisione del cuoio capelluto della linea mediana con una lama chirurgica o forbici. Si estende dalla parte posteriore della regione del cranio, tra le orecchie, all'area frontale tra gli occhi.
Tagliare la pelle rimanente per esporre il cranio. Sanguinare il tessuto connettivo situato tra il cuoio capelluto e il cranio sottostante con il 3% di perossido di idrogeno e localizzare l'area cerebrale da visualizzare con coordinate stereotattiche. Forare un'apertura circolare, circa quattro millimetri nel cranio, usando una punta di perforazione dentale.
Durante la perforazione, inumidire regolarmente il cranio con tamponi soluzione salini e di cotone sterili per raffreddare il cervello. Sgombro via i detriti ossei e ammorbidisci l'osso del cranio. Al termine, rimuovere con cura questa porzione del cranio con forcep appuntite.
Dopo che il cranio è stato rimosso, posizionare con cura un piccolo vetro di copertura, inumidito con soluzione salina nella craniotomia. Asciugare la salina in eccesso usando una salvietta sterile. Usando un applicatore appuntito, applicare la colla cianoacrilato intorno alla finestra e consentirgli di attaccarsi al cervello e al cranio.
Applicare la colla primer sul resto del cranio e polimerirla con una luce di polimerizzazione per 20-40 secondi. Creare un pozzo intorno alla finestra con la colla finale e curarlo con una luce di polimerizzazione per 20-40 secondi. Incollare una piccola piastra della testa sul cranio, sull'emisfero contralto, la craniotomia, con la colla del primer, e quindi con la colla finale, polimerindo entrambi per 20-40 secondi.
Dopo che il topo si è svegliato, iniettare una dose sottocutanea di buprenorfina SR come analgesia postoperatoria, che sarà sufficiente per 72 ore. Ravvivare il topo con cibo salato extra per facilitare un sano recupero. L'imaging può essere eseguito già due settimane dopo l'intervento chirurgico di impianto.
Utilizzare viti per montare la piastra della testa sullo stadio del microscopio a due fotoni, che dovrebbe essere mantenuto a 35 gradi Celsius con una piastra riscaldante. Iniettare il topo per via sottocutanea con 100 microlitri di colorante per vasi sanguigni, come rhodamine B.Pulire delicatamente la superficie della finestra craniciale con un batuffolo di cotone, tamponato al 70% di etanolo. Metti alcune gocce d'acqua o soluzione salina sulla finestra e abbassa l'obiettivo nella soluzione.
Assicurati che il laser sia spento mentre l'obiettivo si sta abbassando e disegna una mappa del corso per indicare i principali punti di riferimento dei vasi sanguigni, mentre guardi attraverso l'oculare. Utilizzare questo disegno per identificare le aree specifiche durante l'imaging a due fotoni. Raccogli immagini di celle fluorescenti e vasi utilizzando l'imaging a due fotoni.
Vedi il manoscritto testuale per i parametri di imaging, prendi appunti attenti con le coordinate appropriate, per assicurarti che le regioni precise possano essere rivisitate per un'immagine successiva. Disegna come diversi campi visivo in questa sessione di imaging iniziale, Alla fine dell'imaging, togli il mouse dal palco, permettigli di svegliarsi dall'anestesia e restituirlo alla sua gabbia di casa. Utilizzare le note e le immagini ottenute per ri-imaging delle aree durante le sessioni successive.
Questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare Microglial Dynamics In Vivo, a Taiwan YFP-H line mice. Dendriti specifici, servivano come punti di riferimento stabili per la mappatura fine delle regioni cerebrali. Mentre i dendriti sono stabili, alcune microglia si muovono ogni giorno.
Singoli topi transgenici CX3CR1/GFP, sono stati utilizzati per seguire microglia per un massimo di otto settimane. Le iniezioni di rodiammina B sono state utilizzate per etichettare la vascuola, durante ogni sessione di imaging. Mentre la vascucolatura rimane stabilmente fissa, le microglia sono dinamiche.
I topi CX3CR1/GFP, sono stati utilizzati per seguire le microglia prima e dopo gravi convulsioni. La struttura del letto vascolare è stata mantenuta, ma la rete cellulare microgliale e il paesaggio di posizione erano transitori. Cambiamenti maggiori sono stati osservati entro 24-48 ore da convulsioni.
I doppi topi transgenici CX3CR1/GFP e NG2DS-Red sono stati utilizzati per tracciare le microglia e NG2 per le cellule positive in Vivo. Senza etichettare la vascucolatura, sono state identificate microglia e parassiti associati ai vasi e cellule precursori degli oligodendrociti, o OPC. I parassiti hanno processi allungati che seguono lungo la parete vascolare, e gli OPC mostrano tipicamente corpi cellulari più grandi che risiedono nel parenchima cerebrale, lontano dalla vascolarizzazione.
Quando è stata utilizzata la rodiammina B, la fluorescenza più luminosa dei parassiti poteva essere distinta dalla fluorescenza più debole della rodiammina luminare, nonostante un'eccitazione simile durante l'imaging. L'imaging quotidiano ha mostrato che i parassiti erano posizionati stabilmente, mentre gli OPC e le microglia erano dinamici. È importante fare un'attenta osservazione dell'area da visualizzare, disegnare una mappa rappresentativa il più accurata possibile e indicare i passi compiuti per raggiungere le altre località rispetto al punto di partenza.
Nelle sessioni di imaging successive, questi passaggi, le mappe disegnate a mano e le immagini scattate in precedenza saranno fondamentali per identificare ripetutamente le stesse posizioni. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori di chiarire interazioni neuronali-gliali, interazioni neuro-immunitarie e dinamiche neuro-cellulari di lunghi periodi di tempo sia in salute che in patologia.
