Questo lavoro è supportato da Il Laboratorio pilota di Grant Jackson Cancer Center e The Maine Cancer Foundation.

1. Protocollo <ol><li> Anestetizzare il mouse con chetamina e xilazina alla dose di 0,1 mg di ketamina e 0,01 mg di xilazina per 1 g di peso corporeo. Carprofen (0,005 mg per 1 g di peso corporeo) è utilizzato per analgesia e viene somministrato prima dell&#39;intervento. </li><li> Tutti gli strumenti chirurgici, compresa la punta dentale, sono sterilizzati a vapore in autoclave. Se ambulatori lotti devono essere eseguite, le punte di strumenti chirurgici devono essere sterilizzati con una perlina di vetro sterilizzatore (Belle Scienza Strumenti FST 250) prima di ogni intervento chirurgico successivo. </li><li> Una volta che il mouse ha raggiunto un piano chirurgico di anestesia, valutato da mancanza di una risposta a una presa punta, viene posto su un dischetto di cotone che viene poi posto su un pad riscaldato per mantenere una temperatura corporea di ~ 37 ° C. La profondità di anestesia viene monitorata frequentemente durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Pelliccia viene rimossa dalla testa dorsale in una zona approssimativamente triangolare ~ 3 mm caudale alle narici ed estendendo caudalmente al cervical vertebre. Pomata oftalmica è applicato occhi per proteggerli da disidratazione e irritazione. </li><li> Il mouse viene posizionato in recumbancy ventrale e la pelle viene disinfettato con iodio chirurgica, 70% di etanolo, e tamponi sterili. Un x 0,8 1,0 cm pattina di pelle che ricopre il dorso delle ossa frontali e parietali del cranio viene rimosso con le forbici sottili. </li><li> Un analgesico topico, 0,5% lidocaina, viene applicato localmente sul periostio e tessuti esposti alla periferia della ferita. Il periostio viene rimosso delicatamente raschiando il cranio con una lama di bisturi; questo aiuterà la colla cianoacrilato di aderire all&#39;osso. </li><li> L&#39;area corticale di interesse è descritta sul cranio con un pennarello. L&#39;area di interesse non deve essere posizionato su linee di sutura del cranio, per evitare danni alle navi di grandi dimensioni sottostanti. </li><li> Un sottile strato di adesivo cianoacrilato è applicato ai margini della ferita, per impedire la fuoriuscita di liquido sanguinolento, e al cranio salvol&#39;area di interesse. </li><li> Fotoattivabile cemento dentale viene utilizzato nel nostro protocollo per sigillare il cranio. Prima dell&#39;applicazione del cemento dentale, tutte cranio esposto tranne l&#39;area destinata assottigliamento viene trattato con primer e successivamente con il legante dal fotoattivabile kit cemento dentale. Una volta che l&#39;adesivo è essiccato, il fotoattivabile cemento dentale viene applicato per coprire il cranio. Per stabilizzare la testa del topo per la chirurgia successiva e di imaging, una sterile # 00-90 dado esagonale è incorporato nel cemento dentale a distanza dalla zona di essere assottigliato. L&#39;utilizzo della luce-attivato cemento dentale ci permette di preparare il cranio senza dover correre per completare l&#39;intera procedura. Dopo la preparazione del cemento dentale sul cranio è completata, il cemento dentale viene indurito con luce visibile. </li><li> Dopo il cemento dentale viene indurita, un supporto copricapo dal dispositivo stereotassica è montato il dado esagonale sulla testa mouse usando una vite # 00-90. </li><li> A drop di temperatura ambiente, 0,9% soluzione salina sterile viene applicato alla zona cranio per essere assottigliato. Con l&#39;ausilio di uno stereomicroscopio, ad alta velocità micro-trapano viene utilizzato per diluire un&#39;area circolare del cranio (tipicamente ~ 4-5 mm di diametro) sopra la regione di interesse. Foratura e l&#39;applicazione della soluzione salina per la zona forata vengono eseguite intermittenza durante la procedura di assottigliamento per evitare danno termico al tessuto sottostante cerebrale. Saline assorbe calore e aiuta anche ammorbidire l&#39;osso. </li><li> Il cranio del mouse è composto da due sottili strati di osso compatto, sandwich uno spesso strato di osso spugnoso. Lo strato esterno di osso compatto e più dell&#39;osso spugnoso vengono rimossi con il trapano. </li><li> Dopo la maggioranza dell&#39;osso spugnoso viene rimosso, le cavità rimanenti all&#39;interno dell&#39;osso spugnoso può essere visto sotto un microscopio da dissezione, che indica che si sta avvicinando alla foratura strato interno osso compatto. In questa fase, lo spessore cranio dovrebbe essere ancora più di 50 pm. Skull diradamento deve esserecontinuato accuratamente per ottenere una preparazione molto sottile (circa 20 micron) e liscia. </li><li> Una volta che lo spessore desiderato del cranio è ottenuta (~ 20 micron), il cranio viene prima lucidata con una misura frusta in silicone con pasta diamantata (6-15 micron) per circa 10 minuti. Il diamante, pasta per lucidatura serve a due scopi. In primo luogo, si assottiglia ulteriormente il cranio senza applicare pressione sul cranio assottigliato, evitando in tal modo i danni accidentali al tessuto cerebrale sottostante. In secondo luogo, serve come una fase di lucidatura iniziale per il cranio diluito prima della grana fine ossido di stagno è usata per la lucidatura cranio ulteriormente. </li><li> Dopo il diamante pasta lucidante, il cranio diluito viene lucidato con ossido di stagno per circa 10 min. Una volta che il cranio è lucido, l&#39;ossido di stagno viene lavata via con soluzione fisiologica fino a quando il cranio appare assottigliato pulito. </li><li> A questo punto, se la finestra cranica è da utilizzare per longitudinale imaging in vivo, la zona pulita cranio sottile viene essiccato. Una piccola goccia di chiaracolla di cianoacrilato è applicato per sigillare la finestra cranica. Lo strato di colla cianoacrilato tra il cranio assottigliato e il coprioggetto deve essere il più sottile possibile. </li><li> Se l&#39;iniezione deve essere eseguita dopo la creazione di una finestra porti cranica, in questa fase, un 26-gauge siringa viene usato per creare una piccola apertura su un lato del cranio lucido sottile finestra. Questa apertura è utilizzato per l&#39;iniezione di cellule GBM. </li><li> Una pipetta di vetro sterile con una punta di apertura di circa 50 micron di diametro viene tirato con un estrattore pipetta. Questo pipetta sarà utilizzato per l&#39;iniezione di cellule GBM, e viene caricato su un micromanipolatore. La pipetta è caricato in un angolo di 30 gradi in modo che il GBM sito di iniezione delle cellule sarà lontano dal sito di imaging finale. La punta della pipetta viene rimosso sotto un microscopio di dissezione. La sospensione cellulare è GBM caricato frontalmente nella pipetta per aspirazione usando una pompa a siringa. </li><li> Una volta che la pipetta di iniezione è caricato con cellule GBM, il mouse viene spostato indietro in the microscopio. La pipetta di iniezione si abbassa verso la piccola apertura nella finestra craniale ed infine inserito nel cervello attraverso l&#39;apertura utilizzando un micromanipolatore. 1 ml di sospensione cellulare GBM viene iniettato nel cervello 100-200 micron dalla superficie del cervello (velocità: 0,1 microlitri / min, durata: 10 min). </li><li> Il cranio è essiccato, una piccola goccia di colla di cianoacrilato chiaro viene applicato al cranio essiccato, e un pezzo di 3 mm di dimensione # 1 coprioggetto viene fatto aderire alla superficie del cranio sottile e lucido. Lo spazio tra il vetrino e adiacente cemento dentale è sigillato con colla cianoacrilato. </li><li> Dopo l&#39;intervento chirurgico, il mouse viene iniettato per via sottocutanea con 1 ml di soluzione salina calda sterile e dotato a calore per mantenere la temperatura corporea fino alla completa guarigione da anestesia. </li><li> Per l&#39;imaging, i topi vengono anestetizzati con chetamina e xilazina alla dose di 0,1 mg di ketamina e 0,01 mg di xilazina per 1 g di peso corporeo. I topi sono immobilizzate con un telaio su misura stereotassicosotto il microscopio. Se ripetitivo imaging in vivo è effettuata su base giornaliera, isofluorano sarà una scelta migliore, come topi mostrano segni di dipendenza con l&#39;uso ripetitivo di ketamina. </li></ol> 2. Risultati rappresentativi Un successo l&#39;intervento chirurgico finestra Porte cranica permette la finestra cranica rimanere chiaro per settimane o mesi. Figura 1 mostra la vascolarizzazione sotto una finestra porte cranica visualizzato per mezzo di luce riflessa. Queste immagini vascolatura stati usati come punti di riferimento per la localizzazione stesse aree cerebrali per l&#39;imaging ripetitivo. Per visualizzare sia le cellule endoteliali e le cellule vascolarizzazione GBM, abbiamo attraversato il B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J del mouse, che etichetta cellule endoteliali con la B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato ) HZE / J del mouse, e generata topo con cellule endoteliali vascolari etichettati con il tdTomato rosso proteina fluorescente. Abbiamo quindi effettuato la procedura di craniotomia porte su questi mice, e iniettata GFP marcati GBM cellule nel cervello attraverso una piccola apertura sul lato di una finestra cranica. Abbiamo quindi effettuato in vivo a due fotoni di imaging longitudinalmente sui topi iniettati. La lunghezza d&#39;onda di eccitazione del laser è stato fissato a 910 nm, che ha portato l&#39;eccitazione di entrambi GFP e tdTomato. Due fotoni di imaging è stato eseguito su una fuoriserie due fotoni a scansione laser con due rivelatori per simultanea capacità verde / rosso rilevazione della fluorescenza. Figura 2 mostra un esempio in vivo di apertura da cellule di glioma GBM iniettato vicino la vascolarizzazione. La finestra porti cranica è anche una scelta eccellente per cronica time-lapse imaging in vivo. Figura 3 mostra una colorazione GFAP di sezioni corticali da un mouse senza intervento chirurgico porte, un mouse 7 giorni dopo l&#39;intervento porti, e un mouse 7 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico porti e iniezione di soluzione salina. È evidente dalle immagini che il mouse senza intervento chirurgico e il mouse con PoRTS chirurgia non hanno gliosi, mentre dopo l&#39;iniezione salina, gliosi è osservata nel tessuto cerebrale di topo, per pipettare penetrazione e iniezione salina nel cervello. Questo risultato dimostra che gliosi non si verifica sotto la finestra porti cranica, che fornisce una convalida indipendente che le porte finestra cranica qui descritte non comporti la gliosi che è in genere associato a un &quot;aperto skull&quot; finestra cronica cranica. Figura 4 mostra ad alta risoluzione imaging di spine dendritiche dal mouse stesso il giorno dell&#39;intervento (giorno 0) e 32 giorni dopo la creazione della finestra porte (giorno 32), a dimostrazione che la finestra porti è anche una scelta eccellente per l&#39;alta risoluzione imaging in vivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig1.jpg" /> Figura 1. Visualizzazione dei vasi sotto una finestra lucido e armato cranio diluito cranica con luce riflessa. Giorni rappresentano t<html> l numero di giorni dopo l&#39;intervento, le immagini sono state scattate a partire dal giorno dell&#39;intervento chirurgico subito dopo il completamento della iniezione di cellule GBM. Scala bar:. 0,5 millimetri <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig2.jpg" /> Figura 2. Visualizzazione delle cellule iniettate GBM e vascolarizzazione in vivo. I topi che trasportano sia Tek-Cre e ROSA26 CAG-tdTomato sono stati utilizzati per l&#39;iniezione di cellule GBM. Cellule endoteliali vascolari sono state marcate con tdTomato (rosso), e le cellule sono state marcate con GBM GFP (verde). Le immagini sono state acquisite a partire 24 ore dopo l&#39;iniezione di cellule GBM. Un totale di 10-12 campi adiacenti di vista sono stati prelevati e sono stati assemblati adiacenti l&#39;una all&#39;altra, con le celle identificate GBM iniettato nel centro del campo totale, per produrre le immagini finali. Giorni rappresentano il numero di giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. Scala bar: 100 micron.href = target &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg&quot; = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig3.jpg" /> Figura 3. Gliosi non si verifica dopo l&#39;intervento finestra Porte cranica. I pannelli superiori: cervello sezione coronale del mouse in basso ingrandimento. Sinistra: un mouse senza alcun intervento chirurgico finestra cranica; non si osserva l&#39;attivazione GFAP nel tessuto cerebrale. Pannello centrale: un mouse con una finestra porte cranica generata sul lato destro del cervello, non si osserva attivazione GFAP nel tessuto cerebrale. Pannello di destra: un mouse con una finestra porte cranica e iniezione salina dal lato della finestra Porte. Attivazione GFAP è osservato il lato della finestra porte, ma non sul lato del tessuto cerebrale intatto. Scala bar: 1 mm. Pannello inferiore: più potenza immagini dei tessuti cerebrali in aree come indicato nella casella bianca della parte superiore del pannello immagini. Scala bar: 100 micron. <ahref = target &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig3large.jpg&quot; = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4201/4201fig4.jpg" /> Figura 4. Imaging ad alta risoluzione delle spine dendritiche di Thy-1 topi YFPH. Le immagini sono state acquisite sul giorno dell&#39;intervento porte, e 32 giorni dopo l&#39;intervento porti. E &#39;evidente dalle immagini che la maggior parte spine presentano al giorno 0 sono chiaramente visibili 32 giorni dopo l&#39;intervento porti. Scala bar: 2 micron.

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Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).</li><li>Gilbertson, R. J., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+tumour's+bed:+glioblastoma+stem+cells+and+the+vascular+niche.">Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche.</a> Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).</li><li>Cho, R. W., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+cancer+stem+cells.">Recent advances in cancer stem cells.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La chiave per una finestra portuale di successo del cranio è l&#39;assottigliamento e la lucidatura. Mentre il diradamento iniziale può essere eseguita rapidamente, occorre prestare attenzione a garantire assottigliamento omogenea del cranio su una vasta area. Abbiamo tipicamente applicare un sottile strato di soluzione salina al cranio, e quindi un passaggio sottile il cranio alla volta, in modo tale che la soluzione salina evapora poco dopo la microdrill è passato sopra la volta cranica. Questo ci permette di lenta...

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> DMEM/F12 (1:1) con piruvato di sodio </td><td> Thermo Sci Hyclone </td><td> SH3026101 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Supplemento Siero gratuita (50x) </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-1 Supplementare </td><td> Invitrogen </td><td> 35050061 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina soluzione </td><td> Thermo Sci Hyclone </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Accutase-enzima cellulare Medio distacco </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> T25 fiaschi-vent tappo verde </td><td> SARSTEDT </td><td> 83.1810.502 </td><td></td></tr><tr><td> 70% di alcool </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% di povidone-iodio soluzione topica </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ketamina HCl </td><td> Butler Animal Health di alimentazione </td><td> NDC # 11695-0550-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina </td><td> Akorn, Inc. </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Carprofen </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Unguento oftalmico </td><td> Dechra veterinari </td><td> 17033-211-38 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5% lidocaina HCl </td><td> REGENT, Inc. </td><td> NDC 0517-0625-25 </td><td></td></tr><tr><td> Colla cianoacrilato </td><td> Henkel Corp. </td><td> 46551 </td><td></td></tr><tr><td> Tamponi sterili </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-114 </td><td></td></tr><tr><td> Diamante pasta </td><td> Widget di alimentazione </td><td> BBE60 </td><td></td></tr><tr><td> Ossido di stagno </td><td> LORTONE, Inc. </td><td> 591-038 </td><td></td></tr><tr><td> Liner Obbligazioni 2V </td><td> KURARAY Medical Inc. </td><td> 1921-KA </td><td></td></tr><tr><td> Clearfil AP-X </td><td> KURARAY Medical Inc. </td><td> 1721-KA </td><td></td></tr><tr><td> Salino </td><td> JAX LAHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copertura in vetro </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0720 </td><td></td></tr><tr><td> Dado esagonale </td><td> Parti piccole, Inc. </td><td> HNX-0090-C </td><td></td></tr><tr><td> Pompa a siringa </td><td> Syringepump.com </td><td> NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Due-Photon sistema di imaging </td><td> Costruito su misura (Qualsiasi sistema commerciale sarebbelavoro) </td><td></td><td></td></tr></table>

imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window

Glioma è una delle forme più letali di cancro umano. La terapia più efficace per glioma data-chirurgia seguita da radioterapia-offre ai pazienti solo benefici modesti, come la maggior parte dei pazienti non sopravvive più di cinque anni dopo la diagnosi a causa di 1,2 glioma ricaduta. La scoperta delle cellule staminali tumorali nei tumori cerebrali umani promette di avere un impatto enorme sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il glioma 3. Cellule staminali tumorali sono definite dalla loro capacità sia di auto-rinnovarsi e differenziarsi, e si pensa siano le uniche cellule di un tumore che hanno la capacità di avviare nuovi tumori 4. Glioma radioterapia recidiva seguente è pensato per derivare da resistenza delle cellule staminali di glioma (GSC) alla terapia 5-10. In vivo, GSC sono mostrati di risiedere in una nicchia perivascolare che è importante per mantenere le loro cellule staminali-simili caratteristiche 11-14 . Al centro della organizzazionezione della nicchia GSC sono cellule endoteliali vascolari 12. I dati esistenti suggeriscono che la GSC e la loro interazione con le cellule endoteliali vascolari sono importanti per lo sviluppo del tumore, e identificare GSC e la loro interazione con le cellule endoteliali come importanti bersagli terapeutici per glioma. La presenza di GSC è determinato sperimentalmente in base alla capacità di avviare nuovi tumori upon trapianto ortotopico 15. Questo è in genere ottenuto iniettando un certo numero di cellule isolate da GBM tumori umani nel cervello di gravemente immuno-carente topo, o di cellule di topo GBM nel cervello di topi ospitanti congenici. Saggi di crescita tumorale vengono poi effettuate dopo un tempo sufficiente a consentire GSC tra le cellule iniettate GBM dare origine a nuovi tumori-tipicamente diverse settimane o mesi. Quindi, saggi esistenti non consentono esame del processo patologico importante di iniziazione tumore da GSC singoli in vivo. Di conseguenza, i essenzialensights nei ruoli specifici di GSC e la loro interazione con le cellule endoteliali vascolari nelle prime fasi di iniziazione tumorale mancano. Questi germi di pensiero sono fondamentali per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il glioma, e avrà grandi implicazioni per la prevenzione delle recidive nei pazienti con glioma. Qui abbiamo adattato le porte procedura cranica finestra 16 e in vivo a due fotoni microscopia per permettere la visualizzazione di iniziazione del tumore dalle cellule GBM iniettate nel cervello di un topo vivo. La nostra tecnica aprirà la strada per futuri sforzi per chiarire i principali meccanismi di segnalazione tra GSC e cellule endoteliali vascolari durante l&#39;iniziazione glioma.

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Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Grazie alla combinazione di un lucido e rafforzata sottile cranio (porte) cranica finestra e il glioblastoma (GBM) l&#39;iniezione di cellule, possiamo osservare l&#39;inizio glioma e la crescita di cellule di GBM iniettate nel cervello di un topo vivo longitudinalmente.

Imaging Glioma Iniziazione<em&gt; In Vivo</em&gt; Attraverso un lucido e sottile rinforzato cranio finestra craniale

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

13.0K Views.  The Jackson Laboratory. Grazie alla combinazione di un lucido e rafforzata sottile cranio (porte) cranica finestra e il glioblastoma (GBM) l'iniezione di cellule, possiamo osservare l'inizio glioma e la crescita di cellule di GBM iniettate nel cervello di un topo vivo longitudinalmente.

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In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading to an accumulation of lipid-laden intra-luminal plaque, smooth muscle cell proliferation and progressive narrowing of the vessel lumen. The formation of such vulnerable plaques prone to rupture underlies the majority of cases of acute myocardial infarction. The complex molecular and cellular inflammatory cascade is orchestrated by the recruitment of T lymphocytes and macrophages and their paracrine effects on endothelial and smooth muscle cells.1
Molecular imaging in atherosclerosis has evolved into an important clinical and research tool that allows in vivo visualization of inflammation and other biological processes. Several recent examples demonstrate the ability to detect high-risk plaques in patients, and assess the effects of pharmacotherapeutics in atherosclerosis.4 While a number of molecular imaging approaches (in particular MRI and PET) can image biological aspects of large vessels such as the carotid arteries, scant options exist for imaging of coronary arteries.2 The advent of high-resolution optical imaging strategies, in particular near-infrared fluorescence (NIRF), coupled with activatable fluorescent probes, have enhanced sensitivity and led to the development of new intravascular strategies to improve biological imaging of human coronary atherosclerosis.
Near infrared fluorescence (NIRF) molecular imaging utilizes excitation light with a defined band width (650-900 nm) as a source of photons that, when delivered to an optical contrast agent or fluorescent probe, emits fluorescence in the NIR window that can be detected using an appropriate emission filter and a high sensitivity charge-coupled camera. As opposed to visible light, NIR light penetrates deeply into tissue, is markedly less attenuated by endogenous photon absorbers such as hemoglobin, lipid and water, and enables high target-to-background ratios due to reduced autofluorescence in the NIR window. Imaging within the NIR 'window' can substantially improve the potential for in vivo imaging.2,5
Inflammatory cysteine proteases have been well studied using activatable NIRF probes10, and play important roles in atherogenesis. Via degradation of the extracellular matrix, cysteine proteases contribute importantly to the progression and complications of atherosclerosis8. In particular, the cysteine protease, cathepsin B, is highly expressed and colocalizes with macrophages in experimental murine, rabbit, and human atheromata.3,6,7 In addition, cathepsin B activity in plaques can be sensed in vivo utilizing a previously described 1-D intravascular near-infrared fluorescence technology6, in conjunction with an injectable nanosensor agent that consists of a poly-lysine polymer backbone derivatized with multiple NIR fluorochromes (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) that results in strong intramolecular quenching at baseline.10 Following targeted enzymatic cleavage by cysteine proteases such as cathepsin B (known to colocalize with plaque macrophages), the fluorochromes separate, resulting in substantial amplification of the NIRF signal. Intravascular detection of NIR fluorescence signal by the utilized novel 2D intravascular NIRF catheter now enables high-resolution, geometrically accurate in vivo detection of cathepsin B activity in inflamed plaque.
In vivo molecular imaging of atherosclerosis using catheter-based 2D NIRF imaging, as opposed to a prior 1-D spectroscopic approach,6 is a novel and promising tool that utilizes augmented protease activity in macrophage-rich plaque to detect vascular inflammation.11,12 The following research protocol describes the use of an intravascular 2-dimensional NIRF catheter to image and characterize plaque structure utilizing key aspects of plaque biology. It is a translatable platform that when integrated with existing clinical imaging technologies including angiography and intravascular ultrasound (IVUS), offers a unique and novel integrated multimodal molecular imaging technique that distinguishes inflammatory atheromata, and allows detection of intravascular NIRF signals in human-sized coronary arteries.

In vivo Near Infrared Fluorescence NIRF Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

We detail a new near-infrared fluorescence (NIRF) catheter for 2-dimensional intravascular molecular imaging of plaque biology in vivo. The NIRF catheter can visualize key biological processes such as inflammation by reporting on the presence of plaque-avid activatable and targeted NIR fluorochromes. The catheter utilizes clinical engineering and power requirements and is targeted for application in human coronary arteries. The following research study describes a multimodal imaging strategy that utilizes a novel in vivo intravascular NIRF catheter to image and quantify inflammatory plaque in proteolytically active inflamed rabbit atheromata.

In vivo Near Infrared fluorescenza (NIRF) intravascolare Imaging Molecolare della placca infiammatoria, un approccio multimodale per Imaging di aterosclerosi

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading ...

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Medicina

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

In vivo doppio substrato Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizzando una finestra craniale per visualizzare l&#39;arteria cerebrale media Durante endotelina-1 indotta da occlusione dell&#39;arteria cerebrale media

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient's Brain During a Spontaneous Migraine Headache

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration of specific neural processes in the central nervous system. However, information is lacking on the molecular impact of these changes, especially on the endogenous opioid system during migraine headaches, and neuronavigation through these changes has never been done. This study aimed to investigate, using a novel 3D immersive and interactive neuronavigation (3D-IIN) approach, the endogenous &#181;-opioid transmission in the brain during a migraine headache attack in vivo. This is arguably one of the most central neuromechanisms associated with pain regulation, affecting multiple elements of the pain experience and analgesia. A 36 year-old female, who has been suffering with migraine for 10 years, was scanned in the typical headache (ictal) and nonheadache (interictal) migraine phases using Positron Emission Tomography (PET) with the selective radiotracer [11C]carfentanil, which allowed us to measure &#181;-opioid receptor availability in the brain (non-displaceable binding potential - &#181;OR BPND). The short-life radiotracer was produced by a cyclotron and chemical synthesis apparatus on campus located in close proximity to the imaging facility. Both PET scans, interictal and ictal, were scheduled during separate mid-late follicular phases of the patient's menstrual cycle. During the ictal PET session her spontaneous headache attack reached severe intensity levels; progressing to nausea and vomiting at the end of the scan session. There were reductions in &#181;OR BPND in the pain-modulatory regions of the endogenous &#181;-opioid system during the ictal phase, including the cingulate cortex, nucleus accumbens (NAcc), thalamus (Thal), and periaqueductal gray matter (PAG); indicating that &#181;ORs were already occupied by endogenous opioids released in response to the ongoing pain. To our knowledge, this is the first time that changes in &#181;OR BPND during a migraine headache attack have been neuronavigated using a novel 3D approach. This method allows for interactive research and educational exploration of a migraine attack in an actual patient's neuroimaging dataset.

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient&#039;s Brain During a Spontaneous Migraine Headache

In this study, the authors report for the first time a novel 3D-Immersive &#38; Interactive Neuronavigation (3D-IIN) through the impact of a spontaneous migraine headache attack in the &#956;-opioid system of a patient's brain in vivo.

3D-neuronavigazione<em&gt; In Vivo</em&gt; Attraverso il cervello di un paziente durante una spontanea Emicrania Mal di testa

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequenziale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &amp;#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Combinato<em&gt; In vivo</em&gt; Optical e μCT Imaging Monitor per infezione, infiammazione, e Bone Anatomy in una infezione ortopedica impianto in topi

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

State of the Art Cranial Ultrasound Imaging in Neonates

Cranial ultrasound (CUS) is a reputable tool for brain imaging in critically ill neonates. It is safe, relatively cheap and easy to use, even when a patient is unstable. In addition it is radiation-free and allows serial imaging. CUS possibilities have steadily expanded. However, in many neonatal intensive care units, these possibilities are not optimally used. We present a comprehensive approach for neonatal CUS, focusing on optimal settings, different probes, multiple acoustic windows and Doppler techniques. This approach is suited for both routine clinical practice and research purposes. In a live demonstration, we show how this technique is performed in the neonatal intensive care unit. Using optimal settings and probes allows for better imaging quality and improves the diagnostic value of CUS in experienced hands. Traditionally, images are obtained through the anterior fontanel. Use of supplemental acoustic windows (lambdoid, mastoid, and lateral fontanels) improves detection of brain injury. Adding Doppler studies allows screening of patency of large intracranial arteries and veins. Flow velocities and indices can be obtained. Doppler CUS offers the possibility of detecting cerebral sinovenous thrombosis at an early stage, creating a window for therapeutic intervention prior to thrombosis-induced tissue damage. Equipment, data storage and safety aspects are also addressed.

Cranial ultrasound (CUS) is a valuable tool for brain imaging in critically ill neonates. This video shows a comprehensive approach for neonatal (Doppler) CUS for both clinical and research purposes, including a bedside demonstration of the technique.

Stato dell&#39;arte cranica Ultrasound Imaging in neonati

Cranial ultrasound (CUS) is a reputable tool for brain imaging in critically ill neonates. It is safe, relatively cheap and easy to use, even when a ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria intrauterina misurare mouse contrattile Pressione<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In Vivo Imaging e tracciamento di tecnezio-99m etichetta cellule staminali mesenchimali del midollo osseo in Equine Tendinopatia

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

L&#39;esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...