Questa metodologia è significativa in quanto consente un metodo riproducibile e accurato per quantificare i prodotti farmaceutici applicati localmente utilizzando l'imaging Raman coerente. Altre metodologie forniscono informazioni farmacocinetiche cutanee voluminose, mentre questa metodologia può fornire informazioni farmacocinetiche cutanee sia di massa che su microscala come la via di permeazione di un farmaco. I percorsi di visualizzazione e quantificazione e permeazione consentiranno lo sviluppo di prodotti farmaceutici con un percorso specifico in mente per raggiungere il sito target.
La preparazione dei tessuti si rivelerà la parte più impegnativa di questa metodologia. Il tessuto dovrebbe essere sufficientemente sottile in modo che si possa essere in grado di leggere attraverso la pelle. Per iniziare la preparazione di un tessuto cutaneo dell'orecchio del topo nudo, acquisire topi nudi eutanasizzati e rimuovere le orecchie del topo usando pinze e forbici microchirurgiche.
Quindi posizionare un orecchio in una grande capsula di Petri di dimensioni 60 millimetri per 15 millimetri. Quindi, sciacquare l'orecchio del mouse con PBS due volte e tamponare l'orecchio ogni volta con il tergicristallo. Se utilizzato entro 24 ore, posizionare l'orecchio in PBS in una piccola capsula di Petri da 35 millimetri per 10 millimetri a due-otto gradi Celsius.
Per utilizzare dopo 24 ore di raccolta, posizionare l'orecchio in una capsula di Petri senza PBS, quindi coprire il piatto con parafilm da conservare in un congelatore a meno 20 gradi Celsius. Mentre lavori sotto il cappuccio biologico, posiziona il tessuto cutaneo umano in una grande capsula di Petri con il lato dello strato corneo rivolto verso il basso in modo che il grasso sottocutaneo sia accessibile. Quindi utilizzare pinze e forbici microchirurgiche per rimuovere il grasso sottocutaneo.
Una volta che il grasso sottocutaneo non può più essere rimosso con le forbici, utilizzare un bisturi monouso a 10 lame con un angolo di 45 gradi rispetto alla pelle per rimuovere il grasso sottocutaneo rimanente mantenendo la pelle ferma con una pinza. Quando il grasso viene rimosso, sezionare la pelle umana in pezzi di un centimetro per un centimetro. Per l'imaging lipidico, posizionare la parte anteriore dell'orecchio del topo rivolta verso il fondo di vetro di un piatto numero zero da 35 millimetri.
Per la pelle umana, posizionare la pelle con lo strato corneo rivolto verso il basso per consentire la quantificazione del farmaco dagli strati superficiali a quelli più profondi. Una volta che il tessuto è stato centrato sul fondo di vetro, utilizzare un applicatore di punta di cotone per assicurarsi che la pelle sia piatta e abbia un contatto completo con la superficie di scivolamento del coperchio del piatto di fondo di vetro. Per prevenire qualsiasi movimento durante l'imaging, posizionare una rondella sulla parte superiore della pelle e assicurarsi che il tessuto sia visibile attraverso il foro centrale della rondella per il rilevamento dello scattering Raman stimolato o della trasmissione SRS.
Pipettare la dose predeterminata della formulazione sulla pelle, quindi utilizzare un dito guantato per strofinare la formulazione in senso orario per 30 secondi. Dopo che è trascorso il tempo assegnato per la permeazione della formulazione, rimuovere la formulazione in eccesso prima di posizionare la pelle con il lato della formulazione rivolto verso il piatto di fondo di vetro. Quindi, procedere alla configurazione sperimentale attivando il software Microscope Control o MC.
Guardando attraverso l'oculare, regolare la messa a fuoco assiale con la manopola di regolazione per garantire che il tessuto sia a fuoco. Al termine, sbloccare sia la pompa che i fasci stokes e confermare che i canali ALG1 e ALG2 siano abilitati. Assicurarsi che il fotodiodo SRS sia in posizione sopra il condensatore, quindi fare clic su Focus x2 sul software MC per visualizzare la pelle nei canali CARS e SRS.
Nel modulo Multi-Area Time Lapse o MATL, vai alla scheda Visualizza e fai clic sull'elenco dei punti registrati per visualizzare l'elenco delle immagini. Una volta identificato lo strato corneo, scorrere il fuoco assiale o Z-focus per identificare specifiche stratificazioni tissutali. Profondità specifiche possono essere aggiunte all'interno della pelle come strato corneo, ghiandole sebacee, adipociti o grasso sottocutaneo, come determinato durante l'imaging dal vivo con contrasto lipidico.
Tuttavia, se devono essere prese intere pile di profondità, è possibile aggiungere posizioni XY e ignorare la posizione Z relativa. Nel caso di imaging di profondità specifica per ogni stratificazione cutanea, selezionare il punto di registrazione per aggiungerlo alla coda MATL. Per gli stack di profondità completa, fate clic su Registra punto per ogni posizione XY con selezione profondità (Depth Selection) nella finestra Parametri di acquisizione (Acquisition Parameters).
Quindi, impostare il numero di ripetizioni su uno nel modulo MATL e fare clic su Pronto. Quando la freccia Play cambia da grigia a nera, premi Play per iniziare a visualizzare lo stack lipidico preliminare. Una volta completato il ciclo di imaging, bloccare sia la pompa che i fasci di Stokes e modificare la lunghezza d'onda sull'interfaccia utente grafica laser alla lunghezza d'onda desiderata in base al numero d'onda mirato o alla vibrazione Raman.
Regolare la fase di ritardo temporale manuale assicurandosi che gli stessi poteri vengano utilizzati per visualizzare il lipide e il principio attivo farmaceutico o API che sono stabiliti a priori. Una volta scelto il numero totale di ripetizioni del ciclo, sbloccare il fascio della pompa e verificare se la potenza corrisponde alla potenza desiderata utilizzando il fotodiodo prima di premere Play per iniziare l'imaging automatico dei set point. Successivamente, eseguire l'analisi dei dati per ogni stratificazione cutanea importando un'immagine lipidica della ghiandola sebacea nelle Figi e selezionando la casella etichettata Split channels per dividere il file nei canali CARS e SRS.
Per aprire Region of Interest o ROI Manager, fai clic su Analizza, Strumenti e ROI Manager. Utilizzando il canale SRS in modo che C sia uguale a uno, smontare la ghiandola sebacea nell'immagine e aggiungere i contrassegni al ROI Manager facendo clic su Aggiungi T in ROI Manager. Ripeti il processo per ogni ghiandola sebacea all'interno dell'immagine.
Per mascherare le regioni ricche di lipidi, selezionare ciascun ROI e quindi fare clic su Altro, OPPURE Combina e Aggiungi schede. Per mascherare le regioni povere di lipidi, usa lo strumento Rettangolo nel menu Figi e disegna un quadrato attorno all'intera immagine. Aggiungere l'area al ROI Manager.
Fai clic sul ROI quadrato appena aggiunto oltre al ROI che seleziona tutte le regioni ricche di lipidi nel ROI Manager. In Altro, selezionare XOR per generare una maschera delle regioni povere di lipidi e aggiungerla al ROI Manager. Concatenare le immagini in ordine numerico passando a Immagine, Stack, Strumenti e concatenare le schede in ordine.
In alternativa, importare le immagini caricandone una nelle Figi e quindi selezionando un'opzione chiamata File di gruppo con nomi simili nella pagina di configurazione. Mentre hai l'immagine concatenata attiva, vai al ROI Manager per selezionare le regioni ricche di lipidi e fai clic sulla scheda Altro prima di selezionare Multi Misura, quindi attendi che venga visualizzata la finestra Risultati. Dalla finestra Risultati, esportare i dati in un foglio di calcolo e aggiungere una colonna intitolata Regione per aggiungere regioni ricche di lipidi a ogni riga di dati.
Aggiungi poveri di lipidi alle regioni che erano al di fuori dei lipidi. Per visualizzare i dati, salvare e importare il foglio di calcolo nel pacchetto R, ggplot2. Quindi tracciare i dati in funzione del numero dell'immagine rispetto all'intensità media per stimare i dati concentrazione-tempo.
Esegui analisi non compartimentali o NCA in RStudio sui dati temporali di intensità importati dal foglio di calcolo con la chiamata per un livello. Al termine, traccia e confronta visivamente le metriche Jmax e AUCflux. Inoltre, effettuare confronti statistici tra le condizioni sperimentali.
L'analisi rappresentativa raffigura lo strato corneo, le ghiandole sebacee, gli adipociti, il grasso sottocutaneo dalla pelle dell'orecchio del topo nudo e lo strato corneo, il derma papillare e una ghiandola sebacea dalla pelle umana. Nella pelle dell'orecchio del topo nudo, il movimento limitato del tessuto delle ghiandole sebacee è stato osservato con la stessa profondità tissutale delle ghiandole al momento dell'applicazione della formulazione e 120 minuti dopo l'applicazione. Il notevole movimento tissutale nella pelle ha mostrato ghiandole sebacee appena visibili dopo 120 minuti di applicazione del farmaco, dimostrando l'inefficienza del protocollo originale.
In diversi studi, i profili di intensità rispetto al tempo hanno mostrato alte concentrazioni iniziali, seguite da concentrazioni decrescenti, indicando nessun ulteriore assorbimento del farmaco nel tessuto. D'altra parte, alcuni studi hanno indicato un aumento delle intensità che in seguito sono diminuite nel corso della durata sperimentale, dimostrando che il flusso nel tessuto non aveva raggiunto un massimo prima dell'imaging. L'analisi NCA dei profili concentrazione-tempo di due formulazioni per la stessa API ha indicato che l'etossi-etossietanolo forniva una permeazione API estesa rispetto a quella della formulazione in gel indipendentemente dallo strato cutaneo.
L'analisi dell'esposizione totale tra le stesse formulazioni ha mostrato osservazioni simili negli strati più profondi della pelle. La preparazione della pelle umana e il corretto posizionamento della pelle sul piatto di fondo di vetro dopo l'applicazione del farmaco sono fondamentali per il successo dell'esperimento. Le soluzioni chiare qui hanno dimostrato l'idoneità di questa metodologia.
Ulteriori ricerche coinvolgeranno formulazioni commercializzate come creme per comprendere come la formulazione influisce sulla penetrazione e sulla permeazione delle API.
