Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere NS042197 a MD. AJK è stato supportato da sovvenzioni T32GM008719 e F30NS068006.

1. Produzione di aghi Microiniezione <ol><li> Prefabbricati aghi microiniezione Sono disponibili in commercio (ad es. Femtotips da Eppendorf) e sono utili se non si sta eseguendo un gran numero di microiniezioni. Tuttavia, per coloro che desiderano stabilirsi a lungo termine le capacità per microinjecting, un&#39;alternativa è quella di produrre aghi microiniezione in laboratorio utilizzando sottile parete in vetro borosilicato capillari e un estrattore ago commerciale. Questo permette anche la forma degli aghi per essere variato, che può essere utile per diversi tipi di cellule. </li><li> Con il PC-10 Microiniezione Puller Ago Narishige, allegare tutti e quattro i pesi e utilizzare un one-step programma tirando (Fase 1 impostazione) con l&#39;impostazione di calore rispetto a 58,0 (riscaldamento n.2). Assicurarsi di posizionare l&#39;elemento riscaldante al centro di ogni capillare in modo che i due aghi che costituiscano una lunghezza simile. </li><li> Tirare diversi capillari (circa 2 capillari per ogni proteina di interesse). </li><li> Aghi Conservare in un contenitore pur essendo sicuri di non danneggiare la punta dell&#39;ago. Materiali come schiuma o Blu-Tack può essere utilizzato in contenitori per contenere aghi microiniezione. </li></ol> 2. Preparazione di miscele di proteine ​​per iniezione <ol><li> Preparare un buffer 10x microiniezione contenente 1 M di cloruro di potassio e fosfato di potassio 0,1 M (KPI) buffer (miscela equimolare di K 2 HPO 4 e KH 2 PO 4) ad un pH di 7,4. Questo buffer può essere conservato a lungo termine a temperatura ambiente. </li><li> Per visualizzare l&#39;iniezione, un colorante fluorescente come rodamina-destrano deve essere aggiunto. Diluire il tampone the10x microiniezione in acqua e sciogliere rodamina-destrano in polvere per fare una soluzione tampone 5x microiniezione contenente 20-40 mg / mL rodamina destrano. </li><li> Conservare questa soluzione al buio a 4 ° C. Dovrebbe essere sufficiente per un massimo di 100 preparazioni individuali soluzione proteica. Altri coloranti, come la fluoresceina isotiocianato-destrano può sostituire. </li><li> Preparare citocromo c scorte sciogliendo purificato citocromo c in acqua ad una concentrazione di 20 mg / mL. Conservare citocromo c a -80 ° C per conservazione a lungo termine ed evitare cicli gelo-disgelo, memorizzando citocromo c in piccole (~ 10 mL) aliquote. </li><li> Preparare una miscela di 10 microlitri di proteine ​​per l&#39;iniezione, combinando 2 il buffer microlitri microiniezione 5x contenente rodamina-destrano con 3 microlitri di acqua e 5 microlitri citocromo c per una concentrazione finale di 10 mg / ml citocromo c in 1x tampone (100 mM KCl, 10 mM KP i, 4-8 mg / mL rodamina destrano). </li></ol> 3. Microiniezione citoplasmatica della citocromo c <ol><li> Appena prima di microiniezione, centrifuga la miscela di citocromo c ed tampone microiniezione a 16.000 g per 10 minuti a 4 ° C per separare le particelle che potrebbero intasare gli aghi microiniezione. </li><li> Durante la centrifugazione, accendere il microinjector per consentire la pressione dell&#39;aria a costruire. </li><li> Posizionare un piatto di cellule al centro del palco microscopio e impostare lo stato attivo sulle cellule. Per ridurre al minimo la quantità di tempo che sono conservate le cellule al di fuori dell&#39;incubatore, le cellule sono di solito restituiti al incubatore entro 30 min. </li><li> Pipettare 0,5-1 microlitri dalla superficie superiore della miscela proteica nelle estremità piatta del capillare. Fare attenzione a non pipetta le particelle che sono stati centrifugati al fondo della provetta. Nel giro di un minuto, la miscela proteica distribuirà alla punta dell&#39;ago attraverso l&#39;azione capillare. </li><li> Applicare l&#39;ago saldamente al titolare capillare del micromanipolatore e la posizione della lancetta in modo che la punta passa attraverso la luce trasmessa del microscopio a circa 45 °. </li><li> Regolare la posizione della punta dell&#39;ago in modo che si trova nel centro del campo visivo. Per centrare l&#39;ago, utilizzare il micromanipolatore per spostare l&#39;ago mentre guardando attraverso l&#39;oculare microscopio. L&#39;ombra ago deve essere visibile. Regolare l&#39;ago in modo che la sua ombra è visto solo in una metà del campo visivo, indicando che la punta dell&#39;ago è centrata sopra le cellule. </li><li> Impostare il microinjector alla modalità a flusso continuo e regolare la pressione di lavoro a 20 - 100 hPa. Ogni ago può richiedere una diversa pressione di lavoro, e la pressione di lavoro sarà probabilmente necessario aggiustamento durante la procedura di microiniezione per mantenere un flusso costante. </li><li> Abbassare l&#39;ago con la manopola grossolana a una posizione appena sopra le cellule. Per fare questo, aumentare il piano focale del microscopio di una posizione appena sopra le cellule. Quindi abbassare l&#39;ago verso le cellule usando la manopola grossolana fino a quando la punta dell&#39;ago è a fuoco. </li><li> Ricentrare la punta dell&#39;ago all&#39;interno del campo visivo e aumentare l&#39;ingrandimento cambiando l&#39;obiettivo microscopio. </li><li> Abbassare lentamente l&#39;ago con la multa unti manopola manipolatorel l&#39;ago è leggermente al di sopra del piano focale delle cellule. </li><li> Controllare il flusso della miscela proteica guardando la fluorescenza rossa della rodamina. La miscela di proteine ​​dovrebbe essere uscire l&#39;ago come un sottile flusso costante. Gli aghi devono essere sostituiti e ri-caricato se l&#39;ago è compromessa o se il flusso è troppo forte. A volte, la punta di un capillare di vetro è chiuso e nessun flusso è visto dall&#39;ago. In questo caso, sostituire l&#39;ago o accuratamente inferiore al fondo del piatto cultura di rottura con delicatezza la punta dell&#39;ago. </li><li> Posizionare la punta dell&#39;ago in modo che sia rivolta verso una cella di circa 45 °. Poi con un movimento fluido, abbassare l&#39;ago durante lo spostamento verso la cella. Con una seconda mozione liscio, immediatamente invertire la direzione dell&#39;ago per rimuoverlo dalla cellula. </li><li> Una cellula con successo iniettato spesso un po &#39;gonfia e può essere confermata dalla visualizzazione della rodamina rosso fluorescente all&#39;interno della cellula. Occasionalmente, una cella sarà accidentalmente iniettato nel nucleo, che sarà visibile. </li><li> Continuano a iniettare le cellule regolando la fase microscopio fino a circa 50-100 cellule vengono iniettate. Quando si sposta la fase di microscopio, assicurarsi di sollevare l&#39;ago microiniezione in modo che cancella la parte superiore delle cellule. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: La microiniezione citoplasmatico del citocromo c imita il suo rilascio dai mitocondri durante l&#39;apoptosi. Così, come previsto, i fibroblasti rapidamente apoptosi su microiniezione citosolico di bovini citocromo c (Fig. 1A). Per garantire che la procedura di iniezione da sola non è responsabile per la morte cellulare, l&#39;iniezione di lievito citocromo c serve come un controllo importante, dal momento lievito citocromo c è in grado di attivare caspasi 12. È interessante notare che post-mitotico neuroni simpatici sono molto resistenti a citosolico citocromo c (Fig. 1B) 8,13. Il nostro laboratorio ha identificato che la XIAP inibitore endogeno della caspasi è un inibitore chiave di attivazione delle caspasi nei neuroni 14. Così, per i neuroni a morire dopo l&#39;iniezione del citocromo c, XIAP deve prima diventare inattivato. Per esempio, la microiniezione di citocromo c in XIAP - / - neuroni simpatici è sufficiente per consentire l&#39;attivazione delle caspasi e apoptosi in queste cellule (Fig. 2). <img src="/files/ftp_upload/2773/2773fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Microiniezione citoplasmatico del citocromo c induce la morte rapida nei fibroblasti, ma non i neuroni. A) wild-type o MEF (B) giorno dopo la nascita 5 neuroni simpatici wild-type sono state microiniettati bovina con citocromo c (10 mg / mL) insieme con rodamina-destrano per marcare le cellule iniettate. Le immagini mostrano lo stesso campo di cellule immediatamente dopo l&#39;iniezione (0 ore), oppure secondo gli orari indicati. Le frecce indicano le cellule iniettate. Scala grafica, 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/2773/2773fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. XIAP deficit di neuroni sono suscettibili di citoplasma del citocromo c microiniezione. Postnatale giorno 5 neuroni simpatici da topi knockout XIAP erano microiniettati con bovina citocromo c (10 mg / mL) insieme con rodamina-destrano per marcare le cellule iniettate. Le immagini mostrano lo stesso campo di cellule immediatamente dopo l&#39;iniezione (0 ore), o 5 ore dopo la microiniezione del citocromo c (5 ore). Scala grafica, 20 micron.

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B., Deshmukh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+function+of+endogenous+XIAP+in+regulating+caspase+activation+during+sympathetic+neuronal+apoptosis.">Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).</li><li>Estus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+neurons+during+programmed+cell+death:+identification+of+c-jun+as+necessary+for+neuronal+apoptosis.">Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis.</a> J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).</li></ol>

Tutte le procedure sperimentali su animali sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso l&#39;Università del North Carolina.

La microiniezione del citocromo c direttamente nel citoplasma delle cellule è uno strumento unico e potente che permette di studi di post-regolazione dell&#39;apoptosi mitocondriale. È importante sottolineare che questa tecnica permette l&#39;attivazione diretta di valle apoptosi dei mitocondri, senza l&#39;uso di agenti che causano il danno cellulare o mitocondriale. Anche se questo protocollo si è concentrata sulla microiniezione di citocromo c per gli studi sulla apop...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> DM IRE2 microscopio invertito </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PC-10 Microiniezione Puller ago </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MWO-202 Micromanipolatore </td><td> Narishige </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet Microinjector </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A parete sottile Boroscilicate capillare di vetro con microfilamento </td><td> Sistemi AM </td><td> 615000 </td><td> 4 lunghezza cm, 1,00 mm di diametro esterno, 0,75 mm di diametro interno </td></tr><tr><td> Rodamina B isotiocianato-Destrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> Peso molecolare medio ~ 70.000 Da </td></tr><tr><td> Bovina citocromo c Proteine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3131 </td><td></td></tr></tbody></table>

activation of apoptosis by cytoplasmic microinjection of cytochrome c

L&#39;apoptosi, o morte cellulare programmata, è un percorso conservato e altamente regolato con cui le cellule muoiono 1. L&#39;apoptosi può essere attivata quando le cellule incontrano una vasta gamma di sollecitazioni citotossici. Questi insulti avviare cascate di segnalazione che alla fine causano il rilascio del citocromo c dallo spazio intermembrana mitocondriale al citoplasma 2. Il rilascio di citocromo c dai mitocondri è un evento chiave che innesca la rapida attivazione delle caspasi, le proteasi cellulari chiave che alla fine eseguire la morte delle cellule 3-4. Il percorso di apoptosi è regolata a punti a monte ea valle del rilascio del citocromo c dai mitocondri 5. Per studiare la regolazione post-mitocondriale di attivazione delle caspasi, molti ricercatori si sono rivolti a microiniezione diretta citoplasmatica di holocytochrome c (eme-allegato) delle proteine ​​nelle cellule 6-9. Citocromo c è normalmente localizzato nei mitocondri, dove l&#39;attaccamento di un gruppo eme è necessaria per poter attivare l&#39;apoptosi 10-11. Pertanto, per attivare direttamente caspasi, è necessario iniettare la proteina c holocytochrome invece del suo cDNA, perché mentre l&#39;espressione del citocromo c dai costrutti cDNA si tradurrà in targeting mitocondriale e attaccamento eme, sarà sequestrato dalla caspasi citosolico. Così, la microiniezione diretta citosolica purificata di eme-attached proteina citocromo c è un utile strumento per simulare rilascio del citocromo c mitocondriale e l&#39;apoptosi senza l&#39;uso di insulti tossici che provocano danni cellulari e mitocondriali. In questo articolo, si descrive un metodo per la microiniezione di proteine ​​citocromo c nelle cellule, usando il mouse fibroblasti embrionali (MEF) e primario neuroni simpatici come esempi. Anche se questo protocollo si concentra sulla iniezione di citocromo c per le indagini di apoptosi, le tecniche qui riportate può anche essere facilmente adattato per microiniezione di proteine ​​di interesse.

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Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In questo protocollo, si descrive la microiniezione diretta citoplasmatico del citocromo<em&gt; C</emProteine&gt; in fibroblasti e primario neuroni simpatici. Questa tecnica permette l&#39;introduzione del citocromo<em&gt; C</emProteine&gt; nel citoplasma delle cellule e imita il rilascio del citocromo<em&gt; C</em&gt; Dai mitocondri, che si verifica durante l&#39;apoptosi.

Attivazione di apoptosi da Microiniezione citoplasmatici del Citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

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Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

17.3K Views.  University of North Carolina. In questo protocollo, si descrive la microiniezione diretta citoplasmatico del citocromo C in fibroblasti e primario neuroni simpatici. Questa tecnica permette l'introduzione del citocromo C nel citoplasma delle cellule e imita il rilascio del citocromo C Dai mitocondri, che si verifica durante l'apoptosi.