DF è supportato da una Bridges NSF per la borsa di dottorato. Il microscopio utilizzato in questo lavoro è sostenuto in parte dal Microscope Imaging infrastrutture di rete core di concedere Colorado State University. Il lavoro sugli adattatori clatrina in laboratorio l&#39;autore s è supportato da CSU start-up e fondi americani premio Heart Association 09SDG2280525 a SD

1. Inserimento di un tag GFP e marcatore nel gene SLA1 Applicare il metodo Longtine 17 per fondere un tag GFP direttamente alla fine del 3 &#39;del telaio SLA1 lettura gene aperto (Sla1p C-terminale) e contemporaneamente segnare il gene con la E. coli kan r gene che consente la selezione G418. <ol><li> Genera un frammento di DNA mediante PCR utilizzando come modello il plasmide pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 e seguenti primer: in avanti, 5&#39;-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 &#39;, e reverse, 5&#39;-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT GAA AAT TTC GAG CTC GTT TAA AC-3&#39;. La sequenza ha sottolineato corrisponde al segmento SLA1 gene specifico immediatamente precedente (forward primer) e seguendo il codone di stop (primer reverse). Isolare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio seguita da purificazione del DNA. </li><li> Preparare una da 50 ml cultura S. SEY6210 ceppo Saccharomyces (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, TRP1-Δ901, lys2-801, suc2 Δ9-GAL-MEL) 19 in YPD, crescendo a presto fase logaritmica (OD 600 = 0,2-0,6). Spin a temperatura ambiente per 3 min a 2.000 xg, lavare due volte con acqua sterile. </li><li> Trasformare il frammento di PCR ottenuto al punto 1 nelle cellule utilizzando la procedura di acetato di litio 20. Lavare le cellule con 1 ml di acqua sterile, aggiungere 1 ml YPD e incubare per 4 ore a 30 ° C in uno shaker. </li><li> Stendere le celle YPD-G418 piastre di selezionare per trasformanti G418 resistenti, incubare a 30 ° C per 2-3 giorni. Scegli colonie e strisciare li YPD-G418 piatti. </li><li> Utilizzando colonia-PCR, identificare trasformanti in cui la GFP-kan modulo è stato opportunamente integrato con la SLA1 sequenze geniche per ricombinazione omologa. Utilizzare un primer forward che annealing all&#39;interno della cornice SLA1 lettura aperta e un primer reverse annealing che all&#39;interno della GFP-kan modulo. Identificare le colonie che i prodotti di PCR sono le dimensioni previste e verificare mediante sequenziamento. </li><li> Schermo le colonie al microscopio a fluorescenza per confermare che hanno fluorescenza GFP. </li></ol> 2. Mutazione della scatola variante clatrina (VCB) nel gene SLA1 <ol><li> Introdurre un LLDLQ AAALQ ad una mutazione nel gene SLA1 (nucleotidi 2407-2415), seguendo un approccio in due fasi 15. </li><li> In primo luogo, amplificare SLA1 nucleotidi 1207-1410 e 2427-2589 mediante PCR e clonare i frammenti all&#39;interno di siti Noti / BamHI e EcoRI / Sali di pBluescriptKS, rispettivamente. </li><li> Sottoclone nel BamHI / EcoRI siti contenente un frammento di PCR URA3. </li><li> Incalzare il plasmide risultante con Noti / Sali, isolare il frammento URA3 da purificazione gel, e introdurlo mediante la trasformazione di acetato di litio nel Sla1-GFP ceppo generato nella parte 1, o in TVY614 (Mata ura3 leu2-52-3112-his3 Δ200 TRP1 -Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) 21. </li><li> Stendere le celle integrate piastre SD manca l&#39;uracile. Confermare con colonia-PCR e sequenziamento che il + colonie Ura contenere URA3 adeguatamente integrato sostituendo il frammento VCB. </li><li> In una seconda fase, sottoclone SLA1 nucleotidi 1207-2589 in Noti / Sali siti di pBluescriptKS. Utilizzando il QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene), mutano i residui VCB LLDLQ a AAALQ. Verificare mediante sequenziamento. </li><li> Incalzare il costrutto risultante con BsgI / AgeI, e isolare il VCB mutante contenente frammento di purificazione gel. Cotransform il BsgI / AgeI frammento con pRS313 (HIS3) 22 nel ceppo ricavato nella parte 2.3. </li><li> Stendere le celle integrate piastre SD manca istidina. La sua replica-piastra + colonie su terreno agarizzato contenente acido 5-fluorotic per identificare le cellule in cui le sequenze mutanti sostituito URA3, rigenerando così il sla1 gene contenente la mutazione di LLDLQ AAALQ (sla1 AAA). Confermare con colonia-PCR e sequenziamento. </li></ol> 3. Microscopia a fluorescenza <ol><li> Crescere i ceppi di lievito Sla1-GFP e sla1 AAA-GFP generati nelle parti 1 e 2 in 4 ml di SD integrato dei media a 30 ° C in un rotatore al buio fino a raggiungere un diametro esterno 600 = 0,1-0,4. Spin 1 ml di cultura in microcentrifuga a 4.000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. Scartare ~ 950 ml di sopranatante. Risospendere le cellule del liquido residuo (~ 50 ml). </li><li> Deposito 3 ml di sospensione cellulare su un vetrino da microscopio e coprire con un coprioggetto di vetro. Proteggere il campione dalla luce. </li><li> Montaggio di diapositive su un 100x ad immersione in olio obiettivo di una filatura-disco microscopio confocale. </li><li> Individuare corretta sul piano focale di cellule utilizzando illuminazione campo chiaro o 488 nm laser con filtri appropriati per eccitare e rilevare la fluorescenza di GFP. </li><li> Cattura time-lapse immagini di Sla1-GFP e sla1 AAA-GFP in cellule con tempo di esposizione di 500 ms (o il valore del caso) ad unn intervallo di un&#39;immagine al secondo per 150 secondi. Risultato atteso: punctae GFP etichetta apparirà sulla superficie interna di limitare membrana della cellula, persistono per alcuni secondi, e spostare verso il centro della cellula, come il segnale scompare rapidamente (indicando cappotto smontaggio). </li><li> Selezionare una porzione di un&#39;immagine in cui si vedono macchie di apparire, rimangono per alcuni secondi, e sparire. Ritaglia questa sezione dell&#39;immagine per ogni fotogramma del time-lapse immagini. </li><li> Generare un chimografo rappresenta questa sezione dell&#39;immagine in ogni fotogramma del secondo 150 time-lapse immagine allineando le cornici lungo un asse corrispondente al tempo trascorso. </li><li> Calcolare la durata di ogni luogo in base a quanti secondi (time-lapse frames) i punti è presente nel chimografo. Si noti che ogni punto dovrebbe &quot;curva&quot; verso l&#39;interno della cellula come sta scomparendo, riflettendo endocitosi e lo smontaggio del mantello. </li><li> Confronta tipo selvatico Sla1-GFP con sla1 AAA-GFP. Ripetere l&#39;operazione per determinare se i risultati sono statisticamente significativi. Risultato atteso: sla1 AAA-GFP macchie persistono significativamente più lunga (~ 80 sec) di tipo selvatico (~ 30 sec) che indicano un difetto nella formazione del mantello 15. </li></ol> 4. Preparazione di estratto di lievito citosolica ed estrarre cellule totale <ol><li> Inoculare 3 litri di YPD con un ceppo di lievito appropriato, come TVY614 21, e crescere a 30 ° C in un incubatore shaker fino a raggiungere un diametro esterno 600 = 1-2. </li><li> Centrifugare la cultura lievito a temperatura ambiente per 20 minuti a 3.700 x g. Eliminare il supernatante, aggiungere 3-5 ml di acqua sterile, e pipetta su e giù fino a quando il pellet è completamente risospeso. </li><li> Versare circa 150 ml di azoto liquido in un becher da 250 ml di plastica. Flash-congelare il lievito, aggiungendo goccia a goccia in azoto liquido in un modello circolare per evitare di agglutinazione del pellet congelato. Non lasciate che il disgelo pellets, aggiungere azoto liquido più se necessario. </li><li> Raffreddare un contenitore in acciaio inox frullatore versando azoto liquido in esso. Consentire l&#39;azoto liquido per far evaporare quasi completamente. Aggiungere il lievito pellet congelato al contenitore freddo frullatore. Chiudere il contenitore frullatore con un tappo di gomma fredda e macinare il pellet di lievito per 10 secondi. Invertire i tempi contenitore 3-4 a mescolare i contenuti e ripetere la fase della macinatura due volte. Il lievito terreno ghiacciato avrà una polvere-come l&#39;apparenza. </li><li> Freddo un imbuto e un tubo da 50 ml coniche con azoto liquido. Utilizzando l&#39;imbuto freddo, trasferire il lievito di terra al tubo. Il lievito terreno ghiacciato può conservare a -80 ° C o utilizzato immediatamente. </li><li> Per ottenere un estratto citosolico per la GST-fusione dosaggio di proteine ​​affinità (parte 5), peso 3 g di terreno ghiacciato TVY614 lievito in un tubo da 15 ml e risospendere in 3 ml di tampone a temperatura ambiente A (10 HEPES mM, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) cocktail contenenti inibitori della proteasi (Sigma). </li><li> Tappo e capovolgere il tubo più volte fino a quando completamente scongelati e poi messo in ghiaccio. </li><li> Ultracentrifuga l&#39;estratto a 4 ° C per 20 min a 300.000 x g. Con attenzione trasferire il sopranatante (estratto citosolico) ad un tubo conico con una pipetta senza disturbare il pellet. Mantenere l&#39;estratto citosolico sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 100 ml di un (v / v) 50% glutatione-Sepharose liquami in tampone A. E &#39;conveniente tagliare l&#39;estremità della punta in modo da facilitare pipeting le perline. Ruota a 4 ° C per 15 minuti, spin-down le perle per centrifugazione a 4 ° C per 2 min a 1.000 xg, e trasferire i (estratto citosolico) surnatante in una nuova provetta. Riserva del 50 ml di estratto per il controllo di input. </li><li> Per ottenere estratti cellulari totali per il co-immunoprecipitazione esperimenti (punto 6) utilizzare ceppo TVY614 (WT SLA1), il ceppo sla1 AAA che trasporta un LLDLQ ad una mutazione AAALQ generato nella parte 2 a TVY614 sfondo, e un ceppo sla1 portando una cancellazione del SLA1 gene come GPY3130 23. Peso 2 g di lievito corrispondente terreno ghiacciato in tubi conici e risospendere in 2 ml di tampone a temperatura ambiente A, contenente cocktail inibitore delle proteasi (Sigma) e il 2% Triton X-100. </li><li> Tappo e capovolgere il tubo più volte fino a quando completamente scongelati e poi incubare in ghiaccio per 10 minuti, mescolando periodicamente per inversione. </li><li> Trasferire il materiale in tubi da microcentrifuga e far girare a 4 ° C per 15 minuti a 16.000 xg (velocità massima in microcentrifuga). Con attenzione trasferire il sopranatante (estratto totale della cella) in una provetta conica sul ghiaccio con una pipetta senza disturbare il pellet. </li><li> Aggiungere 100 ml di una proteina al 50% (v / v) A-Sepharose liquami in tampone A. Ruota a 4 ° C per 15 minuti, spin-down le perle per centrifugazione a 4 ° C per 2 min a 1.000 xg, e il trasferimento il surnatante (estratto in totale) in una nuova provetta. Riserva del 50 ml di estratto per il controllo di input. </li></ol> 5. Proteina di fusione GST-test affinità <ol><li> Amplificare mediante PCR un frammento containing la variante Sla1p clatrina-box (VCB) (residui 803-807), si clone in pGEX-5X per ottenere pGEX-5X-VCB. Verificare mediante sequenziamento. </li><li> Utilizzando pGEX-5X-VCB come modello e il QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene), mutare il VCB residui LLDLQ per AAALQ di ottenere pGEX-5X-vCBmut. Verificare mediante sequenziamento. </li><li> Esprimere GST e le proteine ​​di fusione GST-VCB e GST-vCBmut in E. coli (BL21 DE3), purificare utilizzando glutatione-Sepharose, eluire dalla perline con glutatione ridotto, Dializzare contro PBS, e determinare la concentrazione di proteine. </li><li> Etichetta 3 tubi da microcentrifuga: GST, GST-VCB, e GST-vCBmut, e aggiungere 1 ml di PBS, 30 ml di un 50% (v / v) glutatione-Sepharose liquami in tampone A, e 50 mcg di dialized GST, GST -VCB, o GST-vCBmut proteine ​​di fusione. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire vincolanti. </li><li> Lavare le perle 2 volte con PBS e 1 volta con tampone A. Aggiungere 1 ml di estratto di lievito citosolica - preparato come descritto nella parte 4 - ad ogni provetta. </li><li> Ruotare i tubi di 1 ora a 4 ° C, rotazione 10 sec a 5.000 xg per far sedimentare le perline, scartare il surnatante e lavare rapidamente le perle 3 volte con tampone A contenente 0,1% di tempo Triton X-100, e 1 con tampone A. </li><li> Spin giù le perle ancora una volta e con una punta di carico gel rimuovere quanto più liquido possibile. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C per continuare in un secondo momento. </li><li> Aggiungere 15 ml di tampone 2x campione Laemmli a ciascuna provetta, incubare a 96 ° C per 5 minuti, e spin 10 sec a 5.000 x g. </li><li> Analizzare i campioni da immunoblotting utilizzando un anticorpo alla catena clatrina pesante. Risultati attesi: si lega clatrina a GST-VCB ma non per GST o GST-vCBmut. Anche analizzare i campioni da SDS-PAGE per confermare carico simile di proteine ​​di fusione GST. </li></ol> 6. Co-immunoprecipitazione test <ol><li> Etichetta 3 tubi microcentrifuga: WT (tipo selvaggio SLA1), sla1 AAA, e sla1Δ, e aggiungere 1 ml di PBS, 30 ml di un 50% (v / v) di proteina A-Sepharose liquami in tampone A, e 2 mg di coniglio anti-Sla1p anticorpi. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lavare le perle due volte con PBS e 1 volta con tampone A contenente 1% Triton X-100. </li><li> Aggiungere 1 ml di estratti di lievito corrispondente totale preparato Parte 4: SLA1, sla1 AAA, e sla1Δ. Ruota 1 ora a 4 ° C. </li><li> Spin 10 sec a 5.000 xg per far sedimentare le perline, scartare il surnatante e lavare rapidamente le perle 3 volte con un tampone contenente 0,1% Triton X-100, e 1 volta con tampone A. </li><li> Spin giù le perle ancora una volta e con una punta di carico gel rimuovere quanto più liquido possibile. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C per continuare in un secondo momento. </li><li> Aggiungere 15 ml di tampone 2x campione Laemmli a ciascuna provetta, incubare a 96 ° C per 5 minuti, e spin 10 sec a 5.000 x g. </li><li> Analizzare i campioni da immunoblotting utilizzando un anticorpo alla catena clatrina pesante. Risultati attesi: clatrina co-immunoprecipitati con Sla1p wild-type, ma non con sla1 AAA, o nel campione sla1Δ. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Analisi di adattatore Sla1p clatrina nei siti endocitico mediante microscopia a fluorescenza delle cellule vive. Un fotogramma (a sinistra) da un video e kymographs corrispondente (a destra) di cellule di lievito che esprimono Sla1-GFP o sla1 AAA-GFP che trasporta un LLDLQ alla mutazione AAALQ. Sia di tipo selvatico e mutante Sla1-GFP sono stati espressi dal endogeno SLA1 locus. Siti endocitico sono osservati come punti luminosi distribuiti nella periferia cellulare (immagini a sinistra). L&#39;area tra le linee bianche corrisponde alla regione da cui sono stati generati kymographs. I film sono stati presi ad un frame rate di 1 frame / sec. Si noti la maggiore durata di Sla1-GFP nel LLDLQ a AAALQ mutante (sla1 AAA) rispetto al wild-type (SLA1). <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Interazione fisica tra clatrina e la Sla1p variante box clatrina. GST fusa Sla1p frammento aa798-813 contenente la sequenza LLDLQ (GST-VCB), il corrispondente AAALQ mutante (GST-vCBmut), da soli o GST (GST) sono stati tenuti a glutatione-Sepharose perline e incubate con un estratto citosolico da wild- tipo di cellule di lievito. Le proteine ​​associate sono stati eluiti ed analizzati mediante immunoblotting (IB) per clatrina catena pesante.

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor.">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Clatrina rivestite vescicole (CCV) partecipare endocitosi e trasporto dal trans Golgi rete e endosomi, percorsi conservate che sono fondamentali per la biologia delle cellule eucariotiche. Gli approcci descritti in questo documento i metodi sono utili per studiare i meccanismi molecolari responsabili della formazione CCV, in particolare le interazioni tra proteine ​​adattatore e clatrina. GST-fusione affinità proteine ​​e co-immunoprecipitazione test permettono di prova per l&#39;associazione fisica tr...

<table border="1"><th> Materiale </th><th> Azienda </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> inibitore della proteasi cocktail </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

Un percorso importante endocitico inizia con la formazione di vescicole rivestite clatrina (CCV), che il trasporto merci dalla superficie cellulare di endosomi 1-6. CCV sono caratterizzati da un reticolo poliedrico di clatrina che ricopre la membrana delle vescicole e serve come un dispositivo meccanico patibolo. Cappotti clatrina sono assemblati durante la formazione delle vescicole da individuo clatrina triskelia, la forma solubile di clatrina composta da tre subunità luce pesanti e tre catene 7,8. Poiché il triscele non ha la capacità di legarsi alla membrana direttamente, clatrina vincolante adattatori sono fondamentali per collegare il reticolo che formano clatrina alla membrana attraverso l&#39;associazione con i lipidi e / o di proteine ​​di membrana 9. Adattatori anche il pacchetto di proteine ​​transmembrana carico, come i recettori, e possono interagire tra loro e con altri componenti della formazione CCV macchinari 9. Oltre venti adattatori clatrina sono stati descritti, molti sono coinvolti in clatrina endocitosi mediata e altri localizzare al Golgi trans rete o endosomi 9. Con l&#39;eccezione di HIP1R (lievito Sla2p), tutte le schede noto clatrina legarsi al N-terminale-elica dominio della catena clatrina pesante 9. Adattatori clatrina sono proteine ​​modulare composto da domini piegato collegati da non strutturati linker flessibile. All&#39;interno di queste regioni linker, brevi motivi vincolanti mediare le interazioni con la clatrina dominio N-terminale o altri componenti della formazione di vescicole macchinari 9. Due distinti clatrina vincolanti motivi sono stati definiti: la clatrina-box e il W-box 9. La clatrina-box sequenza consenso è stato originariamente definito come L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 varianti, ma sono stati successivamente scoperti 11. Il W-box è conforme al PWxxW sequenza (dove x è qualsiasi residuo). Sla1p (letale sintetico con Actina binding protein-1) è stato originariamente identificato come una proteina actina associata ed è necessaria per la normale struttura del citoscheletro di actina e le dinamiche in siti endocitico in cellule di lievito 12. Sla1p si lega anche il segnale NPFxD ordinamento endocitico ed è fondamentale per endocitosi di carico porta il segnale NPFxD 13,14. Più recentemente, è stato dimostrato Sla1p legare clatrina attraverso un motivo simile alla finestra di clatrina, LLDLQ, definita una variante clatrina-box (VCB), e di funzionare come un adattatore endocitico clatrina 15. Inoltre, Sla1p è diventato un indicatore ampiamente usato per il cappotto endocitico negli studi di microscopia a fluorescenza delle cellule vive 16. Qui usiamo Sla1p come modello per descrivere approcci per l&#39;adattatore-clatrina studi di interazione. Ci concentriamo sulla microscopia a fluorescenza delle cellule vive, GST-pull down, e co-immunoprecipitazione metodi.

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clatrina endocitosi mediata dipende da proteine ​​adattatrici che coordinano la selezione delle merci e montaggio cappotto clatrina. Qui si descrivono le modalità di studio adattatore clatrina interazione fisica e l&#39;imaging di cellule in vivo approcci utilizzando come modello il lievito endocitico Sla1p proteina adattatore.

In vivo e in vitro di adattatore-clatrina Interazione

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

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Research

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Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

14.4K Views.  Colorado State University. Clatrina endocitosi mediata dipende da proteine ​​adattatrici che coordinano la selezione delle merci e montaggio cappotto clatrina. Qui si descrivono le modalità di studio adattatore clatrina interazione fisica e l'imaging di cellule in vivo approcci utilizzando come modello il lievito endocitico Sla1p proteina adattatore.

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In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

In vitro e in Imaging bioluminescenza gene reporter in vivo di cellule staminali embrionali umane

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Ricerca

Biologia

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualizzazione di MG53-mediata di riparazione della membrana cellulare Utilizzando In vivo E In vitro Sistemi

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

La stimolazione dei citoplasmatici DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an efficient inducible mechanism to isolate the fungal haustoria from the plant cell protoplast. Conversely, pectin, one of the polymeric components of the cell wall, is a target of several pectolytic enzymes in necrotrophic interactions. Here, a protocol to detect pectin and fungal hyphae through optical microscopy is presented. The pectin-rich encapsulation in the cells of coffee leaves infected by the rust fungus Hemileia vastatrix and the mesophyll cell wall modification induced by Cercospora coffeicola are investigated. Lesioned leaf samples were fixed with the Karnovsky solution, dehydrated, and embedded in glycol methacrylate for 2-4 days. All steps were followed by vacuum-pumping to remove air in the intercellular spaces and improve the embedding process. The embedded blocks were sectioned into 5-7 &#181;m thick sections, which were deposited on a glass slide covered with water and subsequently heated at 40 &#176;C for 30 min. Next, the slides were double-stained with 5% cotton blue in lactophenol to detect the fungus and 0.05% ruthenium red in water to detect pectin (acidic groups of polyuronic acids of pectin). Fungal haustoria of Hemileia vastatrix were found to be encapsulated by pectin. In coffee cercosporiosis, mesophyll cells exhibited dissolution of cell walls, and intercellular hyphae and conidiophores were observed. The method presented here is effective to detect a pectin-associated response in the plant-fungi interaction.

This protocol describes a microscopical method to detect pectin in coffee-fungus interaction.

Metodo a doppia colorazione per rilevare la pectina nell'interazione pianta-fungo

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; however, there are currently no treatment or therapeutic options for vascular calcification. Calcification begins within specialized extracellular vesicles (EVs), which serve as nucleating foci by aggregating calcium and phosphate ions. This protocol describes methods for obtaining and assessing calcification in murine aortas and analyzing the associated extracted EVs. First, gross dissection of the mouse is performed to collect any relevant organs, such as the kidneys, liver, and lungs. Then, the murine aorta is isolated and excised from the aortic root to the femoral artery. Two to three aortas are then pooled and incubated in a digestive solution before undergoing ultracentrifugation to isolate the EVs of interest. Next, the mineralization potential of the EVs is determined through incubation in a high-phosphate solution and measuring the light absorbance at a wavelength of 340 nm. Finally, collagen hydrogels are used to observe the calcified mineral formation and maturation produced by the EVs in vitro.

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

This paper presents the methodology for obtaining and assessing vascular calcification by isolating murine aortas followed by extracting calcified extracellular vesicles to observe the mineralization potential.

Analisi della calcificazione vascolare extracellulare vescicolo-mediata mediante modelli in vitro e in vivo

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...

Quantificazione dell'infiltrazione adiposa del muscolo scheletrico mediante decellularizzazione

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Autore in primo piano: Quantificazione basata sulla decellularizzazione dell'infiltrazione adiposa del muscolo scheletrico  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.