DF è supportato da una Bridges NSF per la borsa di dottorato. Il microscopio utilizzato in questo lavoro è sostenuto in parte dal Microscope Imaging infrastrutture di rete core di concedere Colorado State University. Il lavoro sugli adattatori clatrina in laboratorio l&#39;autore s è supportato da CSU start-up e fondi americani premio Heart Association 09SDG2280525 a SD

1. Inserimento di un tag GFP e marcatore nel gene SLA1 Applicare il metodo Longtine 17 per fondere un tag GFP direttamente alla fine del 3 &#39;del telaio SLA1 lettura gene aperto (Sla1p C-terminale) e contemporaneamente segnare il gene con la E. coli kan r gene che consente la selezione G418. <ol><li> Genera un frammento di DNA mediante PCR utilizzando come modello il plasmide pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 e seguenti primer: in avanti, 5&#39;-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 &#39;, e reverse, 5&#39;-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT GAA AAT TTC GAG CTC GTT TAA AC-3&#39;. La sequenza ha sottolineato corrisponde al segmento SLA1 gene specifico immediatamente precedente (forward primer) e seguendo il codone di stop (primer reverse). Isolare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio seguita da purificazione del DNA. </li><li> Preparare una da 50 ml cultura S. SEY6210 ceppo Saccharomyces (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, TRP1-Δ901, lys2-801, suc2 Δ9-GAL-MEL) 19 in YPD, crescendo a presto fase logaritmica (OD 600 = 0,2-0,6). Spin a temperatura ambiente per 3 min a 2.000 xg, lavare due volte con acqua sterile. </li><li> Trasformare il frammento di PCR ottenuto al punto 1 nelle cellule utilizzando la procedura di acetato di litio 20. Lavare le cellule con 1 ml di acqua sterile, aggiungere 1 ml YPD e incubare per 4 ore a 30 ° C in uno shaker. </li><li> Stendere le celle YPD-G418 piastre di selezionare per trasformanti G418 resistenti, incubare a 30 ° C per 2-3 giorni. Scegli colonie e strisciare li YPD-G418 piatti. </li><li> Utilizzando colonia-PCR, identificare trasformanti in cui la GFP-kan modulo è stato opportunamente integrato con la SLA1 sequenze geniche per ricombinazione omologa. Utilizzare un primer forward che annealing all&#39;interno della cornice SLA1 lettura aperta e un primer reverse annealing che all&#39;interno della GFP-kan modulo. Identificare le colonie che i prodotti di PCR sono le dimensioni previste e verificare mediante sequenziamento. </li><li> Schermo le colonie al microscopio a fluorescenza per confermare che hanno fluorescenza GFP. </li></ol> 2. Mutazione della scatola variante clatrina (VCB) nel gene SLA1 <ol><li> Introdurre un LLDLQ AAALQ ad una mutazione nel gene SLA1 (nucleotidi 2407-2415), seguendo un approccio in due fasi 15. </li><li> In primo luogo, amplificare SLA1 nucleotidi 1207-1410 e 2427-2589 mediante PCR e clonare i frammenti all&#39;interno di siti Noti / BamHI e EcoRI / Sali di pBluescriptKS, rispettivamente. </li><li> Sottoclone nel BamHI / EcoRI siti contenente un frammento di PCR URA3. </li><li> Incalzare il plasmide risultante con Noti / Sali, isolare il frammento URA3 da purificazione gel, e introdurlo mediante la trasformazione di acetato di litio nel Sla1-GFP ceppo generato nella parte 1, o in TVY614 (Mata ura3 leu2-52-3112-his3 Δ200 TRP1 -Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) 21. </li><li> Stendere le celle integrate piastre SD manca l&#39;uracile. Confermare con colonia-PCR e sequenziamento che il + colonie Ura contenere URA3 adeguatamente integrato sostituendo il frammento VCB. </li><li> In una seconda fase, sottoclone SLA1 nucleotidi 1207-2589 in Noti / Sali siti di pBluescriptKS. Utilizzando il QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene), mutano i residui VCB LLDLQ a AAALQ. Verificare mediante sequenziamento. </li><li> Incalzare il costrutto risultante con BsgI / AgeI, e isolare il VCB mutante contenente frammento di purificazione gel. Cotransform il BsgI / AgeI frammento con pRS313 (HIS3) 22 nel ceppo ricavato nella parte 2.3. </li><li> Stendere le celle integrate piastre SD manca istidina. La sua replica-piastra + colonie su terreno agarizzato contenente acido 5-fluorotic per identificare le cellule in cui le sequenze mutanti sostituito URA3, rigenerando così il sla1 gene contenente la mutazione di LLDLQ AAALQ (sla1 AAA). Confermare con colonia-PCR e sequenziamento. </li></ol> 3. Microscopia a fluorescenza <ol><li> Crescere i ceppi di lievito Sla1-GFP e sla1 AAA-GFP generati nelle parti 1 e 2 in 4 ml di SD integrato dei media a 30 ° C in un rotatore al buio fino a raggiungere un diametro esterno 600 = 0,1-0,4. Spin 1 ml di cultura in microcentrifuga a 4.000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. Scartare ~ 950 ml di sopranatante. Risospendere le cellule del liquido residuo (~ 50 ml). </li><li> Deposito 3 ml di sospensione cellulare su un vetrino da microscopio e coprire con un coprioggetto di vetro. Proteggere il campione dalla luce. </li><li> Montaggio di diapositive su un 100x ad immersione in olio obiettivo di una filatura-disco microscopio confocale. </li><li> Individuare corretta sul piano focale di cellule utilizzando illuminazione campo chiaro o 488 nm laser con filtri appropriati per eccitare e rilevare la fluorescenza di GFP. </li><li> Cattura time-lapse immagini di Sla1-GFP e sla1 AAA-GFP in cellule con tempo di esposizione di 500 ms (o il valore del caso) ad unn intervallo di un&#39;immagine al secondo per 150 secondi. Risultato atteso: punctae GFP etichetta apparirà sulla superficie interna di limitare membrana della cellula, persistono per alcuni secondi, e spostare verso il centro della cellula, come il segnale scompare rapidamente (indicando cappotto smontaggio). </li><li> Selezionare una porzione di un&#39;immagine in cui si vedono macchie di apparire, rimangono per alcuni secondi, e sparire. Ritaglia questa sezione dell&#39;immagine per ogni fotogramma del time-lapse immagini. </li><li> Generare un chimografo rappresenta questa sezione dell&#39;immagine in ogni fotogramma del secondo 150 time-lapse immagine allineando le cornici lungo un asse corrispondente al tempo trascorso. </li><li> Calcolare la durata di ogni luogo in base a quanti secondi (time-lapse frames) i punti è presente nel chimografo. Si noti che ogni punto dovrebbe &quot;curva&quot; verso l&#39;interno della cellula come sta scomparendo, riflettendo endocitosi e lo smontaggio del mantello. </li><li> Confronta tipo selvatico Sla1-GFP con sla1 AAA-GFP. Ripetere l&#39;operazione per determinare se i risultati sono statisticamente significativi. Risultato atteso: sla1 AAA-GFP macchie persistono significativamente più lunga (~ 80 sec) di tipo selvatico (~ 30 sec) che indicano un difetto nella formazione del mantello 15. </li></ol> 4. Preparazione di estratto di lievito citosolica ed estrarre cellule totale <ol><li> Inoculare 3 litri di YPD con un ceppo di lievito appropriato, come TVY614 21, e crescere a 30 ° C in un incubatore shaker fino a raggiungere un diametro esterno 600 = 1-2. </li><li> Centrifugare la cultura lievito a temperatura ambiente per 20 minuti a 3.700 x g. Eliminare il supernatante, aggiungere 3-5 ml di acqua sterile, e pipetta su e giù fino a quando il pellet è completamente risospeso. </li><li> Versare circa 150 ml di azoto liquido in un becher da 250 ml di plastica. Flash-congelare il lievito, aggiungendo goccia a goccia in azoto liquido in un modello circolare per evitare di agglutinazione del pellet congelato. Non lasciate che il disgelo pellets, aggiungere azoto liquido più se necessario. </li><li> Raffreddare un contenitore in acciaio inox frullatore versando azoto liquido in esso. Consentire l&#39;azoto liquido per far evaporare quasi completamente. Aggiungere il lievito pellet congelato al contenitore freddo frullatore. Chiudere il contenitore frullatore con un tappo di gomma fredda e macinare il pellet di lievito per 10 secondi. Invertire i tempi contenitore 3-4 a mescolare i contenuti e ripetere la fase della macinatura due volte. Il lievito terreno ghiacciato avrà una polvere-come l&#39;apparenza. </li><li> Freddo un imbuto e un tubo da 50 ml coniche con azoto liquido. Utilizzando l&#39;imbuto freddo, trasferire il lievito di terra al tubo. Il lievito terreno ghiacciato può conservare a -80 ° C o utilizzato immediatamente. </li><li> Per ottenere un estratto citosolico per la GST-fusione dosaggio di proteine ​​affinità (parte 5), peso 3 g di terreno ghiacciato TVY614 lievito in un tubo da 15 ml e risospendere in 3 ml di tampone a temperatura ambiente A (10 HEPES mM, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) cocktail contenenti inibitori della proteasi (Sigma). </li><li> Tappo e capovolgere il tubo più volte fino a quando completamente scongelati e poi messo in ghiaccio. </li><li> Ultracentrifuga l&#39;estratto a 4 ° C per 20 min a 300.000 x g. Con attenzione trasferire il sopranatante (estratto citosolico) ad un tubo conico con una pipetta senza disturbare il pellet. Mantenere l&#39;estratto citosolico sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 100 ml di un (v / v) 50% glutatione-Sepharose liquami in tampone A. E &#39;conveniente tagliare l&#39;estremità della punta in modo da facilitare pipeting le perline. Ruota a 4 ° C per 15 minuti, spin-down le perle per centrifugazione a 4 ° C per 2 min a 1.000 xg, e trasferire i (estratto citosolico) surnatante in una nuova provetta. Riserva del 50 ml di estratto per il controllo di input. </li><li> Per ottenere estratti cellulari totali per il co-immunoprecipitazione esperimenti (punto 6) utilizzare ceppo TVY614 (WT SLA1), il ceppo sla1 AAA che trasporta un LLDLQ ad una mutazione AAALQ generato nella parte 2 a TVY614 sfondo, e un ceppo sla1 portando una cancellazione del SLA1 gene come GPY3130 23. Peso 2 g di lievito corrispondente terreno ghiacciato in tubi conici e risospendere in 2 ml di tampone a temperatura ambiente A, contenente cocktail inibitore delle proteasi (Sigma) e il 2% Triton X-100. </li><li> Tappo e capovolgere il tubo più volte fino a quando completamente scongelati e poi incubare in ghiaccio per 10 minuti, mescolando periodicamente per inversione. </li><li> Trasferire il materiale in tubi da microcentrifuga e far girare a 4 ° C per 15 minuti a 16.000 xg (velocità massima in microcentrifuga). Con attenzione trasferire il sopranatante (estratto totale della cella) in una provetta conica sul ghiaccio con una pipetta senza disturbare il pellet. </li><li> Aggiungere 100 ml di una proteina al 50% (v / v) A-Sepharose liquami in tampone A. Ruota a 4 ° C per 15 minuti, spin-down le perle per centrifugazione a 4 ° C per 2 min a 1.000 xg, e il trasferimento il surnatante (estratto in totale) in una nuova provetta. Riserva del 50 ml di estratto per il controllo di input. </li></ol> 5. Proteina di fusione GST-test affinità <ol><li> Amplificare mediante PCR un frammento containing la variante Sla1p clatrina-box (VCB) (residui 803-807), si clone in pGEX-5X per ottenere pGEX-5X-VCB. Verificare mediante sequenziamento. </li><li> Utilizzando pGEX-5X-VCB come modello e il QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene), mutare il VCB residui LLDLQ per AAALQ di ottenere pGEX-5X-vCBmut. Verificare mediante sequenziamento. </li><li> Esprimere GST e le proteine ​​di fusione GST-VCB e GST-vCBmut in E. coli (BL21 DE3), purificare utilizzando glutatione-Sepharose, eluire dalla perline con glutatione ridotto, Dializzare contro PBS, e determinare la concentrazione di proteine. </li><li> Etichetta 3 tubi da microcentrifuga: GST, GST-VCB, e GST-vCBmut, e aggiungere 1 ml di PBS, 30 ml di un 50% (v / v) glutatione-Sepharose liquami in tampone A, e 50 mcg di dialized GST, GST -VCB, o GST-vCBmut proteine ​​di fusione. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire vincolanti. </li><li> Lavare le perle 2 volte con PBS e 1 volta con tampone A. Aggiungere 1 ml di estratto di lievito citosolica - preparato come descritto nella parte 4 - ad ogni provetta. </li><li> Ruotare i tubi di 1 ora a 4 ° C, rotazione 10 sec a 5.000 xg per far sedimentare le perline, scartare il surnatante e lavare rapidamente le perle 3 volte con tampone A contenente 0,1% di tempo Triton X-100, e 1 con tampone A. </li><li> Spin giù le perle ancora una volta e con una punta di carico gel rimuovere quanto più liquido possibile. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C per continuare in un secondo momento. </li><li> Aggiungere 15 ml di tampone 2x campione Laemmli a ciascuna provetta, incubare a 96 ° C per 5 minuti, e spin 10 sec a 5.000 x g. </li><li> Analizzare i campioni da immunoblotting utilizzando un anticorpo alla catena clatrina pesante. Risultati attesi: si lega clatrina a GST-VCB ma non per GST o GST-vCBmut. Anche analizzare i campioni da SDS-PAGE per confermare carico simile di proteine ​​di fusione GST. </li></ol> 6. Co-immunoprecipitazione test <ol><li> Etichetta 3 tubi microcentrifuga: WT (tipo selvaggio SLA1), sla1 AAA, e sla1Δ, e aggiungere 1 ml di PBS, 30 ml di un 50% (v / v) di proteina A-Sepharose liquami in tampone A, e 2 mg di coniglio anti-Sla1p anticorpi. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lavare le perle due volte con PBS e 1 volta con tampone A contenente 1% Triton X-100. </li><li> Aggiungere 1 ml di estratti di lievito corrispondente totale preparato Parte 4: SLA1, sla1 AAA, e sla1Δ. Ruota 1 ora a 4 ° C. </li><li> Spin 10 sec a 5.000 xg per far sedimentare le perline, scartare il surnatante e lavare rapidamente le perle 3 volte con un tampone contenente 0,1% Triton X-100, e 1 volta con tampone A. </li><li> Spin giù le perle ancora una volta e con una punta di carico gel rimuovere quanto più liquido possibile. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C per continuare in un secondo momento. </li><li> Aggiungere 15 ml di tampone 2x campione Laemmli a ciascuna provetta, incubare a 96 ° C per 5 minuti, e spin 10 sec a 5.000 x g. </li><li> Analizzare i campioni da immunoblotting utilizzando un anticorpo alla catena clatrina pesante. Risultati attesi: clatrina co-immunoprecipitati con Sla1p wild-type, ma non con sla1 AAA, o nel campione sla1Δ. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Analisi di adattatore Sla1p clatrina nei siti endocitico mediante microscopia a fluorescenza delle cellule vive. Un fotogramma (a sinistra) da un video e kymographs corrispondente (a destra) di cellule di lievito che esprimono Sla1-GFP o sla1 AAA-GFP che trasporta un LLDLQ alla mutazione AAALQ. Sia di tipo selvatico e mutante Sla1-GFP sono stati espressi dal endogeno SLA1 locus. Siti endocitico sono osservati come punti luminosi distribuiti nella periferia cellulare (immagini a sinistra). L&#39;area tra le linee bianche corrisponde alla regione da cui sono stati generati kymographs. I film sono stati presi ad un frame rate di 1 frame / sec. Si noti la maggiore durata di Sla1-GFP nel LLDLQ a AAALQ mutante (sla1 AAA) rispetto al wild-type (SLA1). <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Interazione fisica tra clatrina e la Sla1p variante box clatrina. GST fusa Sla1p frammento aa798-813 contenente la sequenza LLDLQ (GST-VCB), il corrispondente AAALQ mutante (GST-vCBmut), da soli o GST (GST) sono stati tenuti a glutatione-Sepharose perline e incubate con un estratto citosolico da wild- tipo di cellule di lievito. Le proteine ​​associate sono stati eluiti ed analizzati mediante immunoblotting (IB) per clatrina catena pesante.

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor.">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Clatrina rivestite vescicole (CCV) partecipare endocitosi e trasporto dal trans Golgi rete e endosomi, percorsi conservate che sono fondamentali per la biologia delle cellule eucariotiche. Gli approcci descritti in questo documento i metodi sono utili per studiare i meccanismi molecolari responsabili della formazione CCV, in particolare le interazioni tra proteine ​​adattatore e clatrina. GST-fusione affinità proteine ​​e co-immunoprecipitazione test permettono di prova per l&#39;associazione fisica tr...

<table border="1"><th> Materiale </th><th> Azienda </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> inibitore della proteasi cocktail </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

Un percorso importante endocitico inizia con la formazione di vescicole rivestite clatrina (CCV), che il trasporto merci dalla superficie cellulare di endosomi 1-6. CCV sono caratterizzati da un reticolo poliedrico di clatrina che ricopre la membrana delle vescicole e serve come un dispositivo meccanico patibolo. Cappotti clatrina sono assemblati durante la formazione delle vescicole da individuo clatrina triskelia, la forma solubile di clatrina composta da tre subunità luce pesanti e tre catene 7,8. Poiché il triscele non ha la capacità di legarsi alla membrana direttamente, clatrina vincolante adattatori sono fondamentali per collegare il reticolo che formano clatrina alla membrana attraverso l&#39;associazione con i lipidi e / o di proteine ​​di membrana 9. Adattatori anche il pacchetto di proteine ​​transmembrana carico, come i recettori, e possono interagire tra loro e con altri componenti della formazione CCV macchinari 9. Oltre venti adattatori clatrina sono stati descritti, molti sono coinvolti in clatrina endocitosi mediata e altri localizzare al Golgi trans rete o endosomi 9. Con l&#39;eccezione di HIP1R (lievito Sla2p), tutte le schede noto clatrina legarsi al N-terminale-elica dominio della catena clatrina pesante 9. Adattatori clatrina sono proteine ​​modulare composto da domini piegato collegati da non strutturati linker flessibile. All&#39;interno di queste regioni linker, brevi motivi vincolanti mediare le interazioni con la clatrina dominio N-terminale o altri componenti della formazione di vescicole macchinari 9. Due distinti clatrina vincolanti motivi sono stati definiti: la clatrina-box e il W-box 9. La clatrina-box sequenza consenso è stato originariamente definito come L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 varianti, ma sono stati successivamente scoperti 11. Il W-box è conforme al PWxxW sequenza (dove x è qualsiasi residuo). Sla1p (letale sintetico con Actina binding protein-1) è stato originariamente identificato come una proteina actina associata ed è necessaria per la normale struttura del citoscheletro di actina e le dinamiche in siti endocitico in cellule di lievito 12. Sla1p si lega anche il segnale NPFxD ordinamento endocitico ed è fondamentale per endocitosi di carico porta il segnale NPFxD 13,14. Più recentemente, è stato dimostrato Sla1p legare clatrina attraverso un motivo simile alla finestra di clatrina, LLDLQ, definita una variante clatrina-box (VCB), e di funzionare come un adattatore endocitico clatrina 15. Inoltre, Sla1p è diventato un indicatore ampiamente usato per il cappotto endocitico negli studi di microscopia a fluorescenza delle cellule vive 16. Qui usiamo Sla1p come modello per descrivere approcci per l&#39;adattatore-clatrina studi di interazione. Ci concentriamo sulla microscopia a fluorescenza delle cellule vive, GST-pull down, e co-immunoprecipitazione metodi.

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clatrina endocitosi mediata dipende da proteine ​​adattatrici che coordinano la selezione delle merci e montaggio cappotto clatrina. Qui si descrivono le modalità di studio adattatore clatrina interazione fisica e l&#39;imaging di cellule in vivo approcci utilizzando come modello il lievito endocitico Sla1p proteina adattatore.

In vivo e in vitro di adattatore-clatrina Interazione

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

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In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

14.4K Views.  Colorado State University. Clatrina endocitosi mediata dipende da proteine ​​adattatrici che coordinano la selezione delle merci e montaggio cappotto clatrina. Qui si descrivono le modalità di studio adattatore clatrina interazione fisica e l'imaging di cellule in vivo approcci utilizzando come modello il lievito endocitico Sla1p proteina adattatore.