Il lavoro è stato sostenuto in parte da Public Health Service concedere 1R01AI081568 dal NIAID a YW e dalle generose donazioni dei donatori e piloti del giro 2009 NYCDC Aids organizzato da M. Rosen e Day2 Inc.

1. Trasfezione di plasmidi per la produzione delle particelle lentivirali Rev-dipendente Set up: The Rev-dipendente GFP vettori lentivirali, PNL-GFP-RRE-SA, è stato descritto in precedenza 4,5,6. Per assemblare in una particella virale, il plasmide è stato contransfected in cellule HEK293 T con HIV-1 costruire imballaggi, pCMVΔ8.2 (gentilmente fornito dal Dr. Didier Trono), e un plasmide porta la glicoproteina VSV-G (pHCMV-G) . La trasfezione è stata effettuata utilizzando il metodo di fosfato di calcio. Preparazione di tamponi: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) è stata preparata sciogliendo 5 g di Hepes, 8 g di NaCl, 0,37 g di KCl, 1 g di destrosio, 0,103 g di Na 2 HPO 4 (anidro) in 100 ml di H 2 O. Aliquota the10 X tampone HBS in 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C. Al momento della transfezione, convertire il X 10 HBS a 2 x HBS con H 2 O (1: 5 diluizione), e portare il pH compreso tra 7,05-7,12. (Per 10 ml 2 X HBS, che di solito richiede circa 50 ml di NaOH 1M). Filtro sterilizzare il tampone HBS 2X passando attraverso un filtro Millipore 0,22 mM. CaCl tampone 2 è stata preparata sciogliendo CaCl 2 in 10 mm ad un Hepes 2M concentrazione finale. Regolare il pH a 5,8, filtro sterilizzare il buffer e conservare a 4 ° C. Procedimento: <ol><li> Un giorno prima della transfezione, semi di 2 x 10 6 cellule HEK293T in un 100 mm Petri-piatto, e far crescere le cellule durante la notte in 10 ml di DMEM + 10% FBS a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Il giorno dopo, togliere surnatante dalle cellule e sostituirlo con 5 ml fresca DMEM + 10% FBS, continuamente le cellule di coltura per 4 ore. </li><li> In un tubo di polistirene da 5 ml, aggiungere 480 microlitri di buffer HBS 2X. </li><li> In un secondo tubo 5 ml in polistirolo, aggiungere 60 microlitri 2M CaCl 2 buffer, il DNA plasmidico e trasfezione di buffer TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) per un volume totale di 480 microlitri. Per ogni Petri-piatto, plasmidi deve essere aggiunto nella proporzione di 10 mcg di PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 mcg di pCMVΔR8.3, e 2,5 mg di pHCMV-G. </li><li> Aggiungere il plasmide DNA CaCl 2 miscela goccia a goccia nella provetta 2 X HBS, e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Un precipitato bene si formerà. </li><li> Aggiungere il 960 microlitri della miscela goccia a goccia dalla pipetta per le cellule. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 durante la notte. </li><li> Il giorno successivo, rimuovere il supernatante e aggiungere 10 ml di fresca DMEM + 10% FBS, e continuamente incubare le cellule a 37 ° C CO, 5% 2 durante la notte. </li><li> A 48 ore dopo la transfezione, raccogliere il virus eliminando il supernatante e trasferirlo in 50 mL sterile. Aggiungere 10 ml fresca fresca FBS DMEM + 10% in ogni Petri-piatto e continuare a cultura durante la notte. Conservare il supernatante virus a 4 ° C. </li><li> Continuare a raccogliere a 72 ore dopo la trasfezione raccogliendo il sopranatante. Unire tutti i surnatanti, e centrifugare il surnatante a 500 xg per 15 minuti per far sedimentare e rimuovere i detriti cellulari. </li><li> Il supernatante sono stati raccolti e filtrata attraverso un filtro Millipore 0,22 mM. Il virus si è ulteriormente concentrata nella dimensione-esclusione colonne. </li></ol> 2. Concentrare le particelle virali e determinare titolo virale <ol><li> Particelle virali si sono concentrati da una dimensione di esclusione colonna (100.000 MW tagliati fuori, Centricoin). Surnatante virale è stato caricato in colonna, e centrifugati a 6.000 xga 4 ° C per 15 minuti. </li><li> Surnatante concentrato virale è stato raccolto, frazionare e conservati a -80 ° C. </li><li> Il titolo virale è stata determinata da infezione di un TNF-trattati, l&#39;HIV-1 positivi linea cellulare Jacket, J1.1 7. Le cellule sono state coltivate in una piastra da 96 pozzetti a 2,5 x 10 5 cellule per ml (100 ml in totale), e infettati con 100 ml di diluito serialmente VNL-GFP-RRE-SA per una settimana. Il titolo (TCID50) della particella è stata stimata contando i pozzi GFP positivo seguendo il metodo di Reed e Muench 8. </li></ol> 3. Marcatura di HIV-1 Cellule positive con la particella lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA Set up: un essere umano linea di cellule T CD4, CEM-SS, per la prima volta infettati con HIV-1. A 48 ore dopo l&#39;infezione, le cellule sono state superinfezione con le particelle lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA. A seguito di una superinfezione per altri due giorni, GFP-positive cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso. Come controllo, l&#39;HIV-1 non infette CEM-SS cellule sono state infettate con identico VNL-GFP-RRE-SA. Solo l&#39;HIV-1-infetti le cellule CEM-SS ha dato luogo a cellule GFP positive ma non l&#39;HIV-1 non infette CEM-SS cellule. Procedimento: <ol><li> Due ore prima dell&#39;infezione, aggiungere polybrane ad una concentrazione finale di 4 mg / ml. Contare le celle e prendere 2 x 10 5 cellule per ogni infezione. Infettare le cellule con 200 ng (p24) del virus HIV-1 NL4-3 per 2 ore. </li><li> Lavaggio cellule centrifugare a 300 xg per 10 minuti, risospenderecellule in 2 x 10 5 cellule / ml, e la cultura a 37 ° C per 48 ore. </li><li> Contare le celle e prendere 2 x 10 5 cellule per infezione da VNL-GFP-RRE-SA. Aggiungere 100 ml di VNL-GFP-RRE-SA e incubare a 37 ° C durante la notte. Lavare le cellule e risospendere in 2 x 10 5 cellule / ml. </li><li> Effettuare analisi di citometria a flusso a 48 dopo una superinfezione ore. Cellule infette sono state pellettato e risospese in 500 ml paraformaldehede 1%, incubate a temperatura ambiente per 20 minuti, e poi analizzati in un analizzatore FACScan (Becton Dickinson). </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Se gli esperimenti vengono eseguiti con successo, una popolazione consistente GFP sarà rilevata in HIV-1-infetti le cellule CEM-SS dal citometro a flusso, mentre, nel controllo, le cellule GFP positive non verranno rilevati in HIV-1 non infette CEM-SS cellule. Se gli esperimenti vengono eseguiti con successo, il Rev-dipendente vettori lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA, permetterà la rilevazione altamente specifici di replicazione HIV in popolazioni di cellule viventi, attraverso la misurazione della proteina verde fluorescente (GFP) espressione. In questo esempio, raccolte CEM-SS cellule sono state colorate con un PE-anticorpo marcato topo topo monoclonale contro CD24, HSA, e quindi analizzati su un citometro di flusso sia per HSA e di espressione della GFP. <img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Come si vede qui, una popolazione GFP consistente è stata rilevata in HIV-1-cellule infettate con superinfezione VNL-GFP-RRE-SA (Figura 1c). Al contrario, le cellule GFP positive non sono state rilevate in entrambi i non infetti da HIV-1 CEM-SS cellule senza superinfezione lentivirali (figura 1a) o di HIV-1 le cellule non infette con superinfezione lentivirali (Figura 1b).

<ol>
	<li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus.">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li><li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+gp120/160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs.">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li><li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity,+HIV-1+inhibitors,+and+T+cell+activation+effects.">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li><li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev-dependent+lentiviral+expression+vector.">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li><li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev-dependent+indicator+T+cell+line.">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li><li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis.">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li><li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2++mobilization+after+CD3+stimulation.">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints.">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Come per il precedente sviluppato Tat-dipendente vettori di espressione, il sistema Rev qui descritto è uno sfruttamento di un processo evoluto HIV. L&#39;inclusione di Rev-dipendenza rende l&#39;LTR-based vettore di espressione altamente dipendente dalla presenza di replicazione dell&#39;HIV. L&#39;applicazione di questo vettore come riportato qui, un dipendente del virus HIV-reporter, offre un approccio nuovo romanzo di identificare le cellule HIV-positive. Il vettore consente di esame delle cellule viventi, può esprimere qualsiasi gene per la sperimentazione clinica o di base, e come uno pseudo-digitato lentivirus ha accesso alla maggior parte dei tipi di cellule e tessuti.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biosafety Cabinet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37&deg;C 5%CO2 incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FACSCalibur</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>Allega&trade;6KR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4&deg;C regrigerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>-20&deg;C refrigerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> -80&deg;C refrigerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nexcelom</td>
<td>Cellometer&trade; AutoT4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEK293T cell line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CEM-SS cell line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Jurkat cell line J1.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965-118</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21870</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HI FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10438-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HIV-1NL4-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA</td>
</tr>
<tr>
<td>pNL-GFP-RRE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3</td>
</tr>
<tr>
<td>pNL-GFP-RRE-SA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE</td>
</tr>
<tr>
<td>pCMV&Delta;8.2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>provided by Dr. Dider Trono</td>
</tr>
<tr>
<td>pHCMV-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 x HBS (Hepes Buffered Saline)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11344-041</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2M CaCl2 buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-013-154-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% paraformaldehy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50ml Falcon tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>358206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5ml round bottom tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.45&mu;M Millipore filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>SLHA033SS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.20&mu;M Millipore filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>SLFG85000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100mm Petri-dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>CLS430588</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Size-exclusion column (100,000MW cut off)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SartoriuStedim biotech</td>
<td>VS2041</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2ml frozen tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen</td>
<td>SCT-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>353227</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.7mL Microcentrifuge Tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen</td>
<td>MCT- 175-C</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

specific marking of hiv-1 positive cells using a rev-dependent lentiviral vector expressing the green fluorescent protein

La maggior parte di HIV-reattiva vettori di espressione sono basati sul promotore di HIV, la ripetizione terminale lunga (LTR). Mentre risponde ad una proteina HIV in fase precoce, Tat, la LTR è anche sensibile agli stati di attivazione cellulare e per l&#39;attività di cromatina locale dove l&#39;integrazione è avvenuta. Questo può portare ad alta HIV-indipendente attività, e ha limitato l&#39;utilità di LTR-reporter per marcare le cellule HIV positivi 1,2,3. Qui, abbiamo costruito un vettore di espressione lentivirali che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, numerose sequenze di DNA dell&#39;HIV che includono l&#39;Ap-risposta elemento e dei siti di splicing HIV 4,5,6. Il vettore è stato incorporato in un virus giornalista lentivirale, consentendo il rilevamento altamente specifici di replicare l&#39;HIV in popolazioni di cellule viventi. L&#39;attività del vettore è stata misurata l&#39;espressione della proteina fluorescente verde (GFP). L&#39;applicazione di questo vettore come riportato qui offre un nuovo approccio alternativa ai metodi esistenti, come la PCR in situ o colorazione dell&#39;antigene HIV, di identificare le cellule HIV-positive. Il vettore può anche esprimere geni terapeutici per la sperimentazione clinica o di base per indirizzare le cellule HIV-positive.

Watch this Scientific Journal Video about Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein at JoVE.com

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Abbiamo sviluppato un vettore lentivirale che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, l&#39;Ap-risposta elemento (RRE) che possono regolare l&#39;espressione genica giornalista in modo da HIV-1 Tat e Rev-dipendente. Il vettore consente l&#39;individuazione specifica di replicare l&#39;HIV nelle cellule viventi attraverso l&#39;espressione di GFP.

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

specific-marking-hiv-1-positive-cells-using-rev-dependent-lentiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.8K Views.  George Mason University. Abbiamo sviluppato un vettore lentivirale che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, l'Ap-risposta elemento (RRE) che possono regolare l'espressione genica giornalista in modo da HIV-1 Tat e Rev-dipendente. Il vettore consente l'individuazione specifica di replicare l'HIV nelle cellule viventi attraverso l'espressione di GFP.