PAnap è stato un regalo gentile del Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Questo lavoro è stato finanziato dagli istituti canadesi per i finanziamenti di ricerca sanitaria MOP-102689 e MOP-136894 (a RB) e la Fondazione canadese per l&#39;innovazione 950-225005.

Le manipolazioni di rana sono state eseguite secondo le linee guida canadesi e sono state approvate dal comitato etico (CDEA, protocollo n. 15-042) dell&#39;Università di Montréal. 1. Preparazione di mRNA per l&#39;integrazione fUAA <ol><li> Scegli un sito di interesse per la proteina in cui si prevede che si verifichino cambiamenti conformazionali. Selezionare un aminoacido in questa regione da sostituire per la fUAA. NOTA: La scelta della posizione è basata sui riarrangiamenti strutturali che si prevede. Se esiste una struttura ad alta risoluzione e un&#39;ipotesi dei movimenti attesi, l&#39;anap dovrebbe essere posto in modo tale che l&#39;ambiente chimico possa alterarsi; Questo potrebbe essere un cambiamento nella costante dielettrica (ambiente idrofobico o idrofilo) o, più probabilmente, spegnimento da un altro aminoacido. I migliori quenchers sono triptofani. Anap deve essere in contatto con il quencher in uno stato (sovrapposizione dei raggi van-der-Waals) e libera da essol&#39;altro. Se non esistono strutture o modelli ad alta risoluzione, si dovrebbe analizzare la regione di interesse. In entrambi i casi, è consigliabile selezionare più località vicine per aumentare la probabilità di ottenere l&#39;espressione e il segnale di fluorescenza. Per ridurre al minimo gli effetti sterici durante la maturazione e / o la funzione proteica, si può scegliere di sostituire gli amminoacidi grandi e aromatici (Phe, Trp, Tyr). Gli autori, tuttavia, hanno sperimentato che la scansione di una regione di interesse per l&#39;inserzione fUAA indipendentemente dall&#39;amminoacido sostituito, è più produttivo. </li><li> Inserisci un codone di stop ambra (TAG) nel sito selezionato utilizzando la mutagenesi del sito 15 . Assicurarsi che la proteina di interesse non finisca su un codone di stop ambra (TAG). In caso affermativo, mutare a un altro (codone di stop ocra o opale). Amplificare, isolare e sequenziare il DNA. Ottenere proteina mRNA con la trascrizione in vitro 16 e memorizzare l&#39;mRNA a 20 ° C o 80 ° C. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Preparazione e iniezione di oociti <ol><li> Chirurgicamente ottenere ovociti di fase V o VI da rane di Xenopus laevis e defolliculare con collagenasi come descritto in precedenza 17 . <ol><li> Anestetizzare le rane con un appropriato anestetico secondo il protocollo animale approvato (qui: estere etilico dell&#39;acido 3-aminobenzoico). Quando non riescono a rispondere a un pizzico dolce a una punta di punta (perdita di riflesso di ritiro), allora sono opportunamente anestetizzati per la chirurgia. </li><li> Rimuovere immediatamente le rane dalla soluzione anestetica e sciacquare accuratamente la pelle con acqua dolce. Questo risciacquo impedirà all&#39;animale di cadere in livelli più profondi di anestesia rimuovendo la chimica non abbonata dalla superficie cutanea. </li><li> Rimuovere i nodi delle ovaie da un lato chirurgicamente e con attenzione aprire i nodi utilizzando due pinze. Incubare ed agitare gli oociti in &quot;soluzione standard oocitaria&quot; (SOS) contenente collagenasi 1% (w / v) per 20-30 minPer defollicare. Lavare tre volte con la soluzione SOS. </li><li> Selezionare singolarmente oociti grandi e sani e incubarli nella soluzione di Barth integrata con antibiotici (100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 10 mg / 100 mL kanamicina) e 5% cavallo di cavallo a 18 ͦC per almeno 4 ore prima dell&#39;iniezione . NOTA: Dopo 2 - 4 interventi chirurgici con un ritardo di 4 mesi tra, Xenopus laevis viene eutanizzato da incubazione prolungata (&gt; 1 h) con l&#39;estere etilico dell&#39;acido 3-aminobenzoico. </li></ol></li><li> Per l&#39;iniezione nucleare del DNA, preparare una punta di iniezione lunga e sottile per poter raggiungere il nucleo e per evitare di danneggiare l&#39;oocyte. Riempire la punta di iniezione con olio e montarla sul dispositivo nano iniettore. <ol><li> Installare il nano-iniettore sotto un microscopio stereo e utilizzare pinze per rompere l&#39;estremità della punta. Estrarre l&#39;olio finché non ci sono bolle d&#39;aria intrappolate all&#39;interno della punta della punta. </li></ol></li><li> Inserire 1 μl di 0,1 μg /# 181; L pAnap in acqua senza nucleasi contenente NaOH (1% di 1 N NaOH) su un pezzo di parafilm sotto uno stereoscopio e riempire la punta di iniezione con il DNA. </li><li> Trasferire 40 oociti in un contenitore iniettato a maglia contenente la soluzione di Barth integrata con antibiotici. NOTA: Per fare il piatto iniettato rivestito in rete, tagliare un pezzo di 800 micron di nylon adeguatamente dimensionato per riempire un piatto di polistirolo Petri. Aggiungere il cloroformio al centro e quindi mettere la maglia in cima. Tieni la maglia fino a quando non arriverà la plastica. </li><li> Poiché il nucleo di oocyte si trova nel polo animale (scuro), puntare la punta di iniezione al centro del polo animale e impalare tale che la punta raggiunga il centro dell&#39;emisfero animale (o 2-3 volte la profondità rispetto all&#39;infezione RNA ). Iniettare 9,2 nL di pAnap nel nucleo di ciascun oocyte. La punta sottile e il piccolo volume di iniezione possono causare iniezione irregolare o punta bloccata. Controllare occasionalmente se l&#39;iniezione funziona iniettando nell&#39;aria. NOTA: se il DNA viene iniettato correttamente nel nucleo è incerto. Si aspetta quindi 10 - 40% degli oociti per non esprimere la coppia tRNA / sintetasi. Vedi Discussione per ulteriori elaborazioni. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig2.jpg" /> Figura 2 : Illustrazione dell&#39;iniezione del DNA e dell&#39;RNA in Oociti di Xenopus per l&#39;incorporazione di Anap. In primo luogo, pAnap viene iniettato nel nucleo del oocito Xenopus ( 1 ). Dopo 6-24 h, Anap e il canale RNA vengono coinettati nel polo vegetale ( 2 ). Anap sarà ortogonalmente aminoacilato con il tRNA portante un anti-codone di stop ambra, dalla sintetasi aminoacil-tRNA che è codificata da pAnap. In questo modo, gli aminoacilati Anap-tRNAs sono riconosciuti dal ribosoma al codone di stop ambra inserito nella cassaL RNA, con conseguente soppressione del codone di arresto e inserimento di Anap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="6"><li> Incubare gli oociti in 2 mL di soluzione di Barth integrata con antibiotici e 5% cavallo di cavallo (HS) a 18 ° C per 6-24 h per consentire una robusta espressione di tAPRs specifici Anap e sintetasi tRNA. NOTA: il tempo di incubazione del DNA può durare diversi giorni prima dell&#39;iniezione di RNA, ma non aumenta l&#39;espressione. </li><li> Preparare il nano-iniettore per l&#39;iniezione RNA (come al punto 2.2, ma la punta di iniezione non deve essere sottile come per l&#39;iniezione del DNA). Lavorare solo sotto la luce rossa da questo punto per impedire la fotolibrazione dell&#39;Anap. </li><li> Mescolare 1 μL di 1 mM Anap con 1 μL di mRNA 1-2 μg / μL direttamente su un pezzo di parafilm e riempire la punta di iniezione con la soluzione mista. Impala appena sotto la membrana nel vegetale(Luminoso) ed iniettare 46 nL in ogni oocyte iniettato da pAnap. NOTA: La concentrazione di mRNA necessaria dipende dalla proteina di interesse. </li><li> Incubare gli oociti protetti dalla luce in una scatola o avvolti in foglio di alluminio, nella soluzione di Barth ha completato gli antibiotici e il 5% cavallo di cavallo a 18 ° C per 2-3 giorni. Scambiare con la soluzione fresca di Barth ogni giorno e rimuovere gli oociti morti per evitare la contaminazione. </li></ol> 3. Impostazione VCF <ol><li> Installare l&#39;apparecchiatura di tensione-taglio del oocyte a taglio aperto come descritto in precedenza 18 . </li><li> Montare il sistema di registrazione elettrofisiologica su un microscopio a fluorescenza verticale installando la camera di registrazione su un dispositivo di scorrimento che consente di spostarlo tra lo stereoscopio standard per mettere l&#39;oocyte e il microscopio per eseguire le misurazioni della fluorescenza ( Figura 2c ). NOTA: La geometria della camera per oociti taglienti non è adatta per l&#39;uso del normale traIlluminata per illuminazione durante la manipolazione. Pertanto, una lampada alogena &quot;gooseneck&quot; con filtro rosso viene utilizzata per illuminare lateralmente dall&#39;alto. Il condensatore del microscopio può essere rimosso fai spazio per abbassare lo stadio per la camera elettrofisiologica. </li><li> Collegare un sistema di rilevamento fotodiodo alla porta di uscita del microfono a fluorescenza ( figura 2a ). Collegare la lettura fotocirata a un secondo canale di ingresso nel processore di segnale digitale (DSP, convertitore analogico / digitale / digitale / analogico). </li><li> Usare una lampada alogena da 100 W, 12 V come sorgente luminosa per l&#39;eccitazione della fluorescenza. NOTA: In alternativa, i bruciatori Hg possono essere utilizzati, ma devono essere ridotti in intensità per impedire una rapida eliminazione della foto durante le registrazioni. L&#39;illuminazione del LED è consigliata solo se i rispettivi LED indicano un&#39;intensità significativa nell&#39;intervallo di eccitazione ( ad esempio, ~ 350 nm per Anap). La maggior parte dei LED bianchi non raggiunge molto lo spettro UV. </li><li> insUn otturatore controllato elettricamente tra sorgente luminosa di eccitazione e microscopio e collegare il suo controllo (tipicamente TTL-impulso) ad un&#39;uscita digitale del DSP. Immettere l&#39;impulso TTL nel software di registrazione (vedere la documentazione del produttore), in modo tale che l&#39;otturatore si apra ~ 100 ms prima dell&#39;inizio della registrazione. In questo modo, qualsiasi vibrazione durante il processo di apertura non interferisce con la registrazione. Il tempo dipende dalla velocità e dalla vibrazione dell&#39;otturatore. Terminare l&#39;impulso 5ms prima della fine della registrazione come mostrato in Figura 4 . In questo modo viene anche registrato il valore della fluorescenza totale. </li><li> Inserire un cubo di filtro appropriato (filtro di eccitazione, specchio dicroico e filtro di emissione) nella torretta del filtro del cubo. Per Anap, utilizzare la banda passante Ex: 377/50 nm, il longpass dicroico 409 nm e la banda passante Em: 470/40 nm. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig3.jpg" /> Figura 3 &lt;<html> / Strong&gt; : impostazione VCF. ( A ) Vista laterale della configurazione VCF che mostra il percorso della luce all&#39;interno del microscopio. Il cubo filtro contiene un filtro di eccitazione, uno specchio dicroico e un filtro di emissione. ( B ) Le dimensioni della camera di oocyte selezionate sono di 3,4 cm per il raggio superiore della camera (1), 5,5 cm per la lunghezza della camera inferiore (2), 1,4 cm per la larghezza della camera inferiore (3) e 1,7 cm per la larghezza della camera centrale (4). ( C ) Vista frontale della configurazione VCF. Il primo ocularo a sinistra è quello di montare l&#39;oocyte nella camera di serraggio della tensione di taglio e per la permeabilizzazione. Poi, la camera viene scivolata sotto il microscopio al secondo occhio a destra. Qui l&#39;elettrodo V1 viene inserito nell&#39;oocyte utilizzando l&#39;obiettivo 4X e la fluorescenza viene registrata usando l&#39;obiettivo di immersione acqua 40X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Itle &quot;&gt; 4. Registrazione VCF <ol><li> Seguire le fasi di preparazione per il morsetto di tamponamento oocyte aperto come descritto in precedenza e visualizzato 18 (preparazione del ponte agar, montaggio dell&#39;oocyte, permeabilizzazione della saponina). Tuttavia, lavorare sotto la luce rossa in qualsiasi momento per evitare di sbiancare il fluoroforo prima delle registrazioni. Quando si posiziona l&#39;oocyte, accertarsi che il polo animale sia rivolto verso l&#39;alto. La pigmentazione sotto la membrana polare animale protegge contro l&#39;autofluorescenza proveniente dal citosolo e quindi riduce la fluorescenza di fondo. </li><li> Far scivolare la camera al microscopio e mettere a fuoco con un obiettivo 4X. </li><li> Impalare l&#39;oocyte con l&#39;elettrodo V1 a sensore di tensione (3 M KCl), passare all&#39;obiettivo 40X d&#39;immersione in acqua (NA 0,8 - 0,9). Focus sul polo animale rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Spegnere la luce rossa. Selezionare il cubo filtro destro ruotando la torretta del filtro del cubo e la porta di uscita ottica collegata al fotodiodo. Accendi il halogEn lampada ad alta intensità e brevemente si accende l&#39;otturatore aperto per 2-5 s per leggere l&#39;intensità di fluorescenza di fondo originata dall&#39;oocyte. Con l&#39;impostazione descritta il valore dovrebbe essere di circa 50-200 pA per Anap. </li><li> Accendere il morsetto, azionare l&#39;interruttore di protezione / protezione in attivo e regolare il potenziale della membrana (V1 - V2) al potenziale di comando ruotando la manopola sullo schermo principale. </li><li> Selezionare il potenziale di tenuta, il protocollo del passo, il numero e la lunghezza degli impulsi ecc. Nel software di registrazione. Registrare correnti di tensione dipendenti e intensità di fluorescenza Anap. </li></ol> 5. VCF a due colori <ol><li> Per monitorare simultaneamente due posizioni della stessa proteina, mutare un aminoacido extracellulare e accessibile in cisteina e rimuovere altre cisteine ​​per garantire l&#39;etichettatura specifica con la tiol-chimica. </li><li> Eseguire il passo 2.1-2.5. </li><li> Prima delle registrazioni VCF, incubare oociti in 5 μM TMR-maleimide nella soluzione di etichettatura per 15 minuti (o altri colorantiCon spettri non sovrapposti rispetto ad Anap). </li><li> Lavare gli oociti con la soluzione di etichettatura tre volte per rimuovere la tintura in eccesso. </li><li> Eseguire il passo 4.1-4.6. </li><li> Inserire un cubo filtro appropriato per TMR (filtro di eccitazione, specchio dicroico e filtro di emissione) nella torretta del filtro del cubo. Passare al cubo del filtro TMR ruotando la torretta del filtro. </li><li> Leggere la fluorescenza di sfondo per TMR come descritto per Anap nel punto 4.4. NOTA: L&#39;etichettatura con la tiolchimica provoca un&#39;elevata fluorescenza di fondo a causa di etichettatura non specificata nella membrana. Pertanto, la fluorescenza di sfondo TMR può saturare l&#39;amplificatore (&gt; 2.000 pA). In tal caso, non diminuire l&#39;intensità della luce, ma semplicemente sottrarre la fluorescenza di sfondo aggiungendo una corrente di offset al fotodiodo. Nei sistemi commercialmente disponibili, utilizzare la funzione &quot;sample-and-hold&quot; sul sistema di rilevazione. Si noti il ​​valore della fluorescenza di fondo (utilizzando un filtro di densità neutro 10X) in un laboratorio jCome questo valore non verrà registrato (saturazione). </li><li> Registrare correnti di tensione e intensità di fluorescenza TMR contemporaneamente come nel punto 4.6. </li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

L&#39;aminoacilazione in vivo di tRNAs che vengono continuamente trascritti insieme alla sintetasi tRNA, consente di ottenere livelli elevati di espressione per le misurazioni di fluorescenza. Per l&#39;efficace incorporazione fUAA, è fondamentale che pAnap sia iniettato correttamente nel nucleo. A causa dell&#39;incertezza della posizione esatta del nucleo, 10-40% delle iniezioni del DNA dovrebbero fallire, causando oociti non esprimenti (o esprimendo perdite). Pertanto, è importante controllare l&#39;espres...

Oltre 200 aminoacidi innaturali di varie proprietà chimiche e fisiche sono state incorporate geneticamente in proteine ​​in E. coli , cellule di lieviti e mammiferi 3 . L&#39;aminoacido innaturale è incorporato in risposta a un codone di arresto specifico tramite una coppia tRNA / sintetasi ingegnerizzata ortogonale. L&#39;approccio genetico per modificare le proteine ​​ha fornito preziosi approfondimenti sulla struttura e funzione delle proteine. Qui presentiamo un protocollo per l&#39;utilizzo della Fluorometria a Voltage-Clamp (VCF) in combinazione con un UAA fluorescente. In VCF, l&#39;osservazione simultanea di dati funzionali e riarrangiamenti strutturali localizzati intorno alla sonda fluorescente (~ 5 Å) ci consente di ottenere informazioni dinamiche con risoluzione milliseconda 1 . Le sonde fluorescenti alterano lo stato di spegnimento sul movimento localizzato della proteina. Un movimento di soli 1-2 Å è sufficiente a condurre a significativi cambiamenti nella fluorescenzaIntensità 4 . Dopo l&#39;identificazione del sito di interesse nella proteina bersaglio, il sito è mutato dalla mutazione di punti. Classicamente, il residuo era stato mutato a una cisteina, mentre adesso è stato introdotto un codone di arresto ambrato (TAG) per l&#39;incorporazione genica fUAA. La proteina viene poi trascritta in vitro . Mentre altri sistemi di espressione possono essere utilizzati ( ad esempio, le cellule di mammiferi) 5 , 6 , 7 , gli oociti di Xenopus sono preferiti per gli studi di funzionalità della struttura a causa della loro dimensione più grande, portando a una manipolazione più facile e ad una maggiore intensità di fluorescenza (più fluorofori) Rapporto rumore. Inoltre, gli oociti di Xenopus hanno un basso livello di background dalle proteine ​​endogene 2 , 8 e dalla pigmentazione scura sugli schermi polari animali contro la fluorescenza di fondo da tLui citosol. Gli oociti Xenopus vengono rimossi chirurgicamente e il DNA che codifica la coppia ortogonale tRNA / tRNA-sintetasi specifica per la fUAA viene iniettato nel nucleo degli oociti. Dopo un tempo di incubazione di 6-24 ore, l&#39;RNA di proteina viene coinsidito con il fUAA nel citosolo degli oociti, seguito da un periodo di incubazione di 2-3 giorni. Per prevenire eventuali danni alla fUAA (fotoelettrodo), le procedure con Anap devono essere eseguite sotto luce rossa per evitare l&#39;eccitazione del fluoroforo. Gli oociti sono studiati su un dispositivo di tensione-bloccaggio di oocyte a taglio aperto, che viene montato su un microscopio a fluorescenza verticale e vengono registrati contemporaneamente 9 e 10 cambiamenti di corrente elettrica e fluorescenza. In alternativa, possono essere impiegate configurazioni di tensione 1 a bobina a due elettrodi o configurazioni di patch-clamp 11 . La fluorescenza è eccitata da lunghezze d&#39;onda appropriate con rumore RMS basso e<html> Emissione registrata utilizzando un fotodiodo collegato ad un amplificatore ad alta amplificazione. Ci sono diversi vantaggi dell&#39;utilizzo di aminoacidi innaturali fluorescenti (fUAA) in fluorometria a tensione. Uno è l&#39;accesso al lato citosolico delle proteine ​​della membrana; Si trovano qui molti processi regolatori ( ad esempio, siti di legame di Ca 2+ o nucleotidi, inattivazione rapida e in stato di stato dei canali ionici a tensione, apertura dei pori, accoppiamento dei moduli). Tutti questi processi sono ora accessibili per l&#39;etichettatura fluorescente. Un altro vantaggio è la piccola dimensione della sonda che porta a meno disturbi della proteina. Finora, due coppie ortogonali di sintetasi tRNA / tRNA per fUAA sono state progettate 12 , 13 , dove l&#39;acido 3- (6-acetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanoico (Anap) è l&#39;unica fUAA che è stata utilizzata negli oociti Xenopus 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8. Anap è un fluoroforo sensibile all&#39;ambiente con un peso molecolare di 272,3 g / mol ed è solo leggermente più grande del triptofano 12 ( figure 1A, 1B ). A causa della sua dimensione ridotta, probabilmente saranno meno gli effetti sterici da parte del fluoroforo rispetto ai fluorofori convenzionali collegati tramite un linker (tipicamente più di 500 g / mol). Inoltre, nel caso di Anap, il fluoroforo si trova più vicino alla base proteica rispetto a quelli legati alle cisteine, e di conseguenza, Anap sta sondando ulteriori riarrangiamenti localizzati. Infine, la rimozione di cisteine ​​endogene nel VCF convenzionale per garantire che l&#39;etichettatura specifica del sito non sia più un requisito in UAA-VCF e quindi (i) lascia le proteine ​​in (quasi) il loro stato nativo e (ii) consente di applicare VCF Per studiare una gamma più ampia di proteine ​​in cui la funzione può essere alterata dalla sostituzione di cisteina. <img alt="Figura 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Anap e Fluorescenza Spectra. ( A ) Struttura chimica di Anap. ( B ) Spettri di assorbimento normalizzati e spettri di emissione per 1 nM Anap, dimostrando la sensibilità della fluorescenza Anap all&#39;idropobicità del solvente. Gli spettri di emissione sono stati ottenuti emozionanti a 350 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Uno svantaggio dell&#39;utilizzo di UAA fluorescenti è che una popolazione eterogenea di proteine ​​può derivare dalla riduzione del codone di arresto, dalla reinitiazione della traslazione, dalle proteine ​​troncate del C-terminale o dalla crisi con l&#39;aminoacilazione endogena se la quantità di tRNA aminoacilati è scarsa. Tale espressione di perdita deve sempre essere controllata in assenza della fUAA e della coppia di sintesi tRNA / tRNA. Abbiamo affrontato la questione del transReinitiation lancinante e come eluderlo per i siti di inserimento del terminale N in precedenza 14 . Tuttavia, quando la fUAA, la tRNA e la tRNA sintetasi sono presenti in quantità saturate, rimane solo una bassa probabilità di espressione di perdita. La differenza procedurale tra fUAA-VCF e VCF convenzionale è l&#39;iniezione e la manipolazione degli ovociti; L&#39;iniezione di DNA che codifica il tRNA e la sintetasi tRNA (pAnap) è seguita dall&#39;introduzione di Anap, che viene co-iniettato con la proteina mRNA o aggiunta alternativamente alla soluzione di incubazione come estere acetossimetil (AM).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Barth&#039;s solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9397</td><td>0.82 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7902</td><td>0.41 mM</td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1396</td><td>0.33 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaOH hydrate</td><td>BDH</td><td>BDH7225-4</td><td>pH 7.6</td></tr><tr><td>Penicilin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Invitrogen</td><td>15160054</td><td>10 mg/100mL</td></tr><tr><td>Horse Serum (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>5%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SOS Standard Oocyte Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>102 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;External recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Internal recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E478-500</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Labeling solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TMR stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td><td>Molcular Probes by Life Technologies</td><td>T6027</td><td>5 mM in DMSO</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anap stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anap</td><td>ABZENA (TCRS)</td><td>Custom synthesis TCRS-170</td><td>1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAnap</td><td>Addgene</td><td>48696</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Oocyte Clamp</td><td>Dagan Corporation</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Gpatch Acquisition software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recording Chamber</td><td>Custom machined</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photo diode detection system</td><td>Dagan Corporation</td><td>PhotoMax-200/PIN</td><td></td></tr><tr><td>Electrical shutter driver</td><td>UNIBLITZ</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr></tbody></table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

La fluorometria a tensione di tensione (VCF) è stata la tecnica di scelta per studiare la struttura e la funzione delle proteine ​​di membrana elettrogene dove le misurazioni in tempo reale di fluorescenza e correnti denunciano simultaneamente i riarrangiamenti locali e la funzione globale, rispettivamente 1 . Mentre le tecniche strutturali ad alta risoluzione come la microscopia crio-elettrona o la cristallografia a raggi X forniscono immagini statiche delle proteine ​​di interesse, VCF fornisce dati strutturali dinamici che ci permettono di collegare i riarrangiamenti strutturali (fluorescenza) ai dati funzionali dinamici (elettrofisiologia). Fino a poco tempo fa, la chimica tiol-reattiva utilizzata per l&#39;etichettatura fluorescente di proteine ​​del sito ha limitato l&#39;ambito dell&#39;approccio perché tutte le cisteine ​​accessibili, comprese quelle endogene, saranno etichettate. È stato pertanto necessario costruire proteine ​​prive di cisteine ​​endogene. L&#39;etichettatura è stata anche limitata ai siti accessibili dall&#39;estracellularelato. Ciò è cambiato con l&#39;uso di fluidi naturali aminoacidi (fUAA) per incorporare specificamente una piccola sonda fluorescente in risposta alla soppressione del codone di arresto usando una coppia di tRNA e tRNA sintetasi ortogonale 2 . Il miglioramento del VCF richiede solo una procedura di iniezione in due fasi di iniezione del DNA (coppia tRNA / sintetasi) seguita da coinjection di RNA / fUAA. Ora, l&#39;etichettatura di entrambi i siti intracellulari e sepolti è possibile, e l&#39;uso di VCF è aumentato in modo significativo. La tecnica VCF diventa quindi attraente per studiare una vasta gamma di proteine ​​e, soprattutto, consente di indagare numerosi meccanismi di regolazione citosolica.

La figura 4 mostra un esempio di registrazioni VCF ottenute da un canale Shaker espresso da oocyte con rimozione rapida di inattivazione (IR), L382stop-W434F in presenza di pAnap e Anap. La mutazione W434F blocca le correnti di potassio ioniche, che consente di misurare gli spostamenti di carica del gating transitorio (correnti gating). Le registrazioni simultanee delle correnti di gating (traccia superiore) e le variazioni dell&#39;intensità di fluorescenza Anap (tracc...

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Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

In questo articolo si descrive un miglioramento della convenzionale fluorometria a tensione di tensione (VCF) in cui vengono utilizzati fluorocinosi aminoacidi innaturali (fUAA) anziché coloranti maleimidi, per sondare i riarrangiamenti strutturali nei canali ionici. La procedura prevede l&#39;iniezione di DNA Xenopus oocyte, la coinjection RNA / fUAA e le misure contemporanee di corrente e fluorescenza.

Fluorescenza a tensione di serraggio in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

voltage-clamp-fluorometry-xenopus-oocytes-using-fluorescent-unnatural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

10.4K Views.  University of Montréal.  In questo articolo si descrive un miglioramento della convenzionale fluorometria a tensione di tensione (VCF) in cui vengono utilizzati fluorocinosi aminoacidi innaturali (fUAA) anziché coloranti maleimidi, per sondare i riarrangiamenti strutturali nei canali ionici. La procedura prevede l'iniezione di DNA Xenopus oocyte, la coinjection RNA / fUAA e le misure contemporanee di corrente e fluorescenza. 

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Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Ricerca

Biologia

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Uso di pHluorin per valutare la dinamica dei recettori di guida axon nella coltura cellulare e nell'embrione del pulcino

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Neuroscienze

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Biologia dello sviluppo

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine ​​di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Bioingegneria

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Misurazione di trasporto cationico da Na, K e H, K-ATPasi<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli oociti per spettrofotometria di assorbimento atomico: una alternativa a saggi radioisotopi

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Il<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Fluorescenza a tensione di serraggio in

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Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Uso di pHluorin per valutare la dinamica dei recettori di guida axon nella coltura cellulare e nell'embrione del pulcino

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

Misurazione di trasporto cationico da Na, K e H, K-ATPasi

Il

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

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