L'espressione eterologa di connessioni e innexine negli ovociti di Xenopus è un approccio potente per analizzare le proprietà biofisiche delle giunzioni gap. Il vantaggio principale della nostra tecnica è quello di utilizzare un approccio di misurazione della corrente laterale elevato appropriato per i morsetti di tensione a doppio sito. La procedura sarà dimostrata da Yuan Shui, un borsista post-dottorato del mio laboratorio.
Non appena il 70-80% degli ovociti viene defiblicato, decantare la soluzione enzimatica inclinando delicatamente il tubo. Lavare gli ovociti cinque volte riempiendo il tubo con la soluzione ND96 e quindi decantando la soluzione. Dopo il lavaggio finale, trasferire gli ovociti in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente una soluzione di ND96.
Utilizzare una pipetta Pasteur di vetro pulito per raccogliere e trasferire ovociti di grandi dimensioni e dall'aspetto sano in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente soluzione ND96 integrata con piruvato di sodio e streptomicina di penicillina. Preparare una piastra per iniezione di ovociti incollando un piccolo pezzo di rete di nylon sul fondo di una capsula di Petri da 35 millimetri. Riempire la capsula per iniezione di ovociti circa a metà strada con la soluzione di ND96 integrata con streptomicina piruvato e penicillina.
Quindi, posizionare da 25 a 30 ovociti in file all'interno della capsula di Petri. Riempire una micropipetta di iniezione con olio minerale leggero e inserirla nel supporto della micropipetta dell'iniettore. Trasferire il cRNA da una delle aliquote immagazzinate alla superficie interna di una copertura o di un fondo della capsula di Petri mediante pipettaggio.
Premere il pulsante di riempimento nel controller dell'iniettore per aspirare la goccia di cRNA nella punta della micropipetta. Quindi, premere il pulsante di iniezione per iniettare il cRNA. Trasferire gli ovociti iniettati in una nuova capsula di Petri contenente soluzione di ND96 integrata con piruvato e penicillina streptomicina.
Tenerli all'interno della camera ambientale a 15-18 gradi Celsius per uno o tre giorni. Sostituire la soluzione ogni giorno trasferendo gli ovociti in una nuova capsula di Petri. Utilizzare due pinzette sottili per staccare delicatamente la membrana trasparente della villina che avvolge l'ovocita.
Quindi, posizionare due ovociti per pozzetto in una camera di accoppiamento degli ovociti contenente la soluzione ND96. Collegare la sonda di tensione differenziale e i cavi di corrente alla cella modello. Quindi, collegare le prese rosse e nere alla sonda di tensione differenziale con il ponticello incluso e collegare entrambe le gambe del ponticello a entrambi i pin nella cella del modello.
Collegare il filo di terra nella cella modello al cavo dalla presa del circuito di terra dell'amplificatore. Ruotare le manopole di offset VM e VE offset per azzerare la tensione di membrana e i misuratori di corrente a membrana. Spegnere il morsetto da spento a veloce o lento e ruotare la ghiera di guadagno in senso orario a un livello che consenta di azzerare l'elettrodo di tensione e i misuratori di elettrodi a bagno dell'amplificatore.
Eseguire un semplice protocollo di acquisizione contenente alcuni passaggi di tensione per confermare che la tensione visualizzata nel misuratore di tensione a membrana cambia in base al protocollo di acquisizione e che le tracce di tensione e corrente vengono visualizzate correttamente in Clampex. Posizionare una capsula di Petri contenente gli ovociti accoppiati nel recipiente della capsula di Petri della piattaforma di registrazione. Selezionare una coppia di ovociti e ruotare la capsula di Petri, se necessario, in modo che i due ovociti siano nella direzione sinistra e destra.
Blocca il palco in posizione con la sua base magnetica. Posizionare un elettrodo di riferimento vicino al bordo della capsula di Petri verso il lato utente. Quindi, collegare l'elettrodo di riferimento alla presa nera in una sola delle due sonde di tensione differenziale.
Prendi un paio di micropipette di vetro, rompi un po 'della punta con uno scriba diamante e leviga il bordo della punta lucidando a fuoco. Tenere la micropipetta sopra la fiamma di un bruciatore ad alcool e piegarla ad un angolo liscio a circa un centimetro di distanza dalla punta. Riempire completamente la pipetta di vetro con la soluzione ND96 e quindi inserirla in un supporto microelettrodo preriempito.
Assicurarsi che nel sistema non siano presenti bolle d'aria. Inserire il pin da due millimetri del supporto del microelettrodo nella presa da due millimetri di un filo di collegamento dell'elettrodo a tensione differenziale. Bloccare la presa di due millimetri su un clamper a base magnetica e puntare la punta dell'elettrodo di tensione differenziale verso uno dei due ovociti.
Inserire il pin di un millimetro del filo di collegamento dell'elettrodo di tensione differenziale nella presa rossa della sonda di tensione differenziale sullo stesso lato. Preparare gli elettrodi di tensione e corrente dai capillari di vetro e riempirli nuovamente con una soluzione di cloruro di potassio. Quindi, inserire gli elettrodi nei portaelettrodi forniti con gli amplificatori.
Abbassare gli elettrodi nella soluzione del bagno e ruotare le ghiere offset VM e VE per azzerare la tensione della membrana e i misuratori di corrente a membrana. Controllare la resistenza dell'elettrodo premendo VM electrode test e VE electrode test. Inserire gli elettrodi di corrente e tensione negli ovociti e osservare i potenziali di membrana negativi.
Quindi, nella sezione morsetto dell'amplificatore, confermare che il guadagno DC sia nella posizione in cui si trova. Ruotare la manopola di guadagno in senso orario a un livello che consenta un corretto morsetto di tensione e ruotare l'interruttore del morsetto da spento a veloce. Infine, eseguire un protocollo di acquisizione.
Un diagramma dell'esperimento ovocitario è mostrato qui. I passi di tensione di membrana negativi e positivi vengono applicati all'ovocita 1 da una tensione di membrana di mantenimento di meno 30 millivolt, mentre l'ovocita 2 è tenuto a una tensione di membrana costante di meno 30 millivolt. La tensione trans-giunzionale, o Vj, è definita come la tensione di membrana dell'ovocita 2 meno la tensione di membrana dell'ovocita 1.
Le immagini rappresentative mostrano le tracce Lj del campione e la risultante relazione di tensione trans-giunzionale di conduttanza giunzionale normalizzata delle giunzioni gap omotipiche UNC-9. Le tracce Lj di esempio e la risultante relazione Gj-Vj normalizzata delle giunzioni gap omotipiche UNC-7b sono mostrate qui. I risultati mostrano che questi due tipi di Gj differiscono nel tasso di inattivazione Ij dipendente da Vj, nella dipendenza da Vj e nella quantità di Gj residuo.Durante il tentativo della procedura, è molto importante assicurarsi che il sistema di elettrodi a tensione differenziale non abbia bolle d'aria e la sua punta sia puntata molto vicino all'ovocita e gli elettrodi di tensione e corrente abbiano una resistenza di circa un microohm.
La nostra tecnica è facile da implementare. Può essere di particolare interesse per quei laboratori che sono recentemente interessati a utilizzare gli ovociti Xenopus per studiare le giunzioni gap.
