Vorremmo ringraziare Laura Schippers per scrivere le prime versioni del protocollo di carico delle cellule e Marcus de Goffau e Guille Zampar per aver morfologie mitocondriali.

1. Produzione e preparazione di un wafer di silicio Mold Chip microfluidici sono creati da uno stampo wafer di silicio prodotto da litografia morbida. Questi wafer possono essere riutilizzati più volte per produrre chip microfluidici. È opportuno che la produzione di un rispettivo wafer viene eseguita da un gruppo specializzato nella microfluidica 6. Il wafer è realizzato in un processo di fotolitografia due fasi utilizzando due diversi strati di fotoresist negativo, SU-8 7. Lo strato inferiore è utilizzato per generare la zona di cattura cella (SU-8 2002; altezza 3-4 micron), mentre i canali sono realizzati con lo strato superiore (SU-8 2010; altezza 10 micron). Un&#39;impressione del processo di produzione di wafer può essere trovato in Huang et al 8. I disegni dei chip microfluidici sono disponibili presso gli autori, nonché consigli su come ottenere un rispettivo wafer. <ol><li> Una volta che il wafer viene ottenuta, tagliare un pezzo di dura-Tag into sottili strisce di circa 0,5 mm per 3 mm con un bisturi e metterli attenzione sul wafer leggermente sopra la struttura di canale tra i canali di entrata e l&#39;array Micropad (Figura 2A). Questo comporterà la formazione di un grande canale supplementare in ogni chip, che non sarà utilizzato solo durante il caricamento delle cellule, ma è anche importante per il funzionamento stabile del dispositivo microfluidica. </li><li> Coprire il piatto di vetro Petri con un doppio strato di foglio di alluminio e mettere il wafer nella scatola di Petri. Il foglio di alluminio impedisce l&#39;esecuzione in PDMS tra il wafer ed il piatto Petri. Se PDMS fa insinuarsi tra il wafer ed il piatto di vetro Petri, il wafer diventerà permanentemente fissata nella capsula di Petri. Sebbene il wafer è ancora utilizzabile, non sarà possibile sostituire il piatto di vetro Petri se si rompe e il PDMS dovrà essere tagliato in seguito. </li></ol> 2. Produzione di chip microfluidici <ol><li> Posizionare una plastica vuotacoppa sulla bilancia e tarare la bilancia. Versare 40 g di PDMS di base nella tazza di plastica (per un cm di diametro piatto di vetro Petri 12). Aggiungi PDMS catalizzatore con una pipetta monouso in rapporto p / w di 1:10, cioè circa 4 ml. </li><li> Mescolare il PDMS e vulcanizzante accuratamente per parecchi minuti. Questo può essere fatto con la pipetta monouso utilizzato per pipettare il catalizzatore. E &#39;importante che la miscela sia ben mescolata prima di versare sulla parte superiore del wafer. Povero miscelazione causerà parte del PDMS non a polimerizzare. </li><li> Versare il PDMS sopra il wafer nel piatto di vetro Petri. </li><li> Miscelazione di PDMS con il catalizzatore porterà alla formazione di bolle nella miscela PDMS. Queste bolle devono essere rimossi prima del PDMS polimerizza. Il PDMS può essere degassato dopo versandolo sulla cima del wafer mettendo la piastra di Petri in un essiccatore collegato ad una pompa a vuoto. Con questa configurazione, ci vogliono circa 30 min per rimuovere tutte le bolle dalla miscela. </li><li> Polimerizzare The PDMS ponendo capsula di Petri con la cialda sulla cima di una piastra calda a 120 ° C per 1 ora e poi a 65 ° C per un&#39;altra ora. </li><li> Rimuovere il foglio di alluminio insieme al wafer e polimerizzato PDMS dal piatto di vetro Petri. Staccare il foglio di alluminio e lo strato sottile di residuo polimerizzato PDMS dal retro del wafer. Lo strato di PDMS sopra il wafer può quindi essere separata dal wafer sollevandola attentamente. </li><li> Posizionare lo strato di PDMS a testa in giù (con i canali verso l&#39;alto) in panchina e ritagliare i disegni single chip impresse sul PDMS accuratamente con un bisturi. Cercare di trattenere circa 3 mm di PDMS attorno ai bordi dei canali per migliorare attaccamento del chip per il vetro di copertura in seguito. </li><li> Eseguire fori PDMS alle estremità del canale di ingresso, uscita e laterale (Figura 2A) spingendo un 20 Gauge stub Luer tutto il percorso attraverso il PDMS in modo rettilineo. </li></ol> Assicurarsi che il chip PDMSè ancora sdraiato a testa in giù sulla panca mentre punzonatura dei fori. Questo impedisce PDMS di attaccarsi alla parte interna del canale, che potrebbe causare il blocco del canale. <ol start="9"><li> Dopo la punzonatura ogni foro, rimuovere la colonna di PDMS nel stub Luer con le pinzette prima di tirare il mozzicone di nuovo fuori. La colonna PDMS potrebbe altrimenti rimanere dietro e bloccare il foro di appena un pugno. </li><li> Pulire le superfici del chip da particelle di polvere e residui PDMS mettendo nastro adesivo su di esso e rimuovendo immediatamente il nastro nuovo. Allo stesso modo la pulizia del vetro di copertura a cui verrà allegato il chip. </li><li> Posizionare il chip puliti e vetro di copertura sotto la lampada UV del banco UV-Ozono Cleaner. Le parti che devono essere legati insieme devono affrontare la lampada. </li><li> Esporre il PDMS e vetro di copertura alla luce UV per 6-8 minuti e poi mettere direttamente il chip sul vetro coperchio posizionando le superfici esposte sopra l&#39;altro. </li><li> Battere delicatamente intorno ai lati del chippromuovere fissaggio della PDMS al vetro di copertura e per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. Non toccare in cima alla struttura del canale in quanto ciò potrebbe causare la micropads di si attaccano al vetro di copertura pure. </li><li> Posizionare il setup microfluidica appena fatto su un piatto caldo a 100 ° C per 60 min. Testare la forza del legame tra il vetro di copertura e il chip PDMS cercando di sollevare i bordi del chip PDMS leggermente. Quando il blocco PDMS non può essere sollevato dalla superficie del vetro, il legame è riuscita e il chip è pronto all&#39;uso. </li></ol> 3. Preparazione del circuito integrato per cella di carico Guasto di un dispositivo microfluidica può potenzialmente causare perdite di media nel microscopio. Per evitare questo, è consultivo utilizzare un supporto metallico e / o sigillare i lati del circuito integrato dove il PDMS incontra il vetro con smalto o colla epossidica. Questo impedisce la fuoriuscita del fluido nel caso del chip PDMS non è incollato abbastanza bene per il vetro di copertura. Anche il tuboconnessioni possono essere fissate attorno ai punti di inserzione in un modo simile per evitare la fuoriuscita del fluido. Un sensore di acqua fatto in casa che spegne la pompa a siringa in caso di perdite può essere usato come una precauzione di sicurezza in più. Disegni del metallo titolare appositamente per il chip microfluidica sono disponibili presso gli autori. <ol><li> Posizionare il chip microfluidica nel supporto metallico, con gel di silicone tra il vetro del chip e le parti metalliche della porta per creare una tenuta stagna. Avvitare i dadi delicatamente, per non rompere il vetro. </li><li> Collegare tubi sottili (ca. lunga 5-15 cm) al canale laterale e il canale di uscita del chip. L&#39;uso di pinzette rende più facile inserire il tubo nei fori perforati. </li><li> Riempire un ml Luer-Lok siringa da 50 con terreno di coltura, rimuovere l&#39;aria dalla siringa e collegarla in modo sequenziale ad un filtro a siringa, una calibro 20 stub Luer, un tubo di spessore corta (lunga ca. 2 cm) e di un tubo sottile. Assicurarsi che il sottile vascae è abbastanza lungo da coprire la distanza tra la pompa siringa e la fase microscopio. </li><li> Posizionare la siringa nella pompa a siringa, l&#39;avanzamento rapido della pompa fino a quando il tubo sottile è completamente riempito con il mezzo. </li><li> Spingere il tubo sottile collegato alla siringa nel canale di entrata del chip e lasciare defluire mezzo attraverso il chip a 10 microlitri / min (Figura 2B). Raccogliere il mezzo lasciando il chip (ad esempio in una capsula di Petri). Il mezzo sarà eseguito mediante il canale laterale a causa della differenza tra la resistenza Duro-Tag reso grande canale laterale e il canale di uscita. </li><li> Posizionare il chip in fase microscopio e impostare il fuoco del microscopio sui pad. </li></ol> L&#39;uso di obiettivi di immersione in olio è preferito rispetto quella di obiettivi immersione in acqua perché l&#39;olio non secca nel tempo-corso dell&#39;esperimento. A seconda del microscopio ci potrebbero essere problemi con conservando il focus durante le prime ore di questo esperimento. Si consiglia pertanto di lasciare il chip per una o due ore in fase di microscopio in modo che possa stabilirsi prima di caricare le cellule e iniziare l&#39;esperimento. 4. Caricamento di cellule di lievito nel chip microfluidica <ol><li> Collegare un ml Luer siringa da 5 a 20 Gauge stub Luer e un tubo di spessore (ca. 3 cm). </li><li> Prelevare un campione della coltura cellulare per essere caricato nel chip. </li></ol> La conta delle cellule preferito per caricamento è tra 1-5 x 10 6 cellule per ml. Culture con conta delle cellule più alte devono essere diluite prima del caricamento. Quando le cellule in cultura in YPD, efficienza di carico cella possono essere migliorate molte volte se le cellule vengono lavate con prima e risospese in terreno minimo contenente una percentuale simile al glucosio prima del caricamento. Durante il funzionamento del chip, YPD mezzo può ancora essere utilizzato in modo sicuro. <ol start="3"><li> Caricare circa 1 ml di sospensione cellulare in the siringa e rimuovere tutta l&#39;aria dalla siringa. </li><li> Diminuire la portata della pompa a siringa 0,5 microlitri / min. Il flusso basso e costante applicata dalla pompa siringa durante il caricamento (nel passo 4.5) spingerà cellule non iscritti mediante il canale laterale (Figura 2C). </li><li> Collegare la siringa contenente la sospensione cellulare al tubo del canale di uscita. Caricare le celle premendo sullo stantuffo della siringa delicatamente. Osservare le cellule che entrano ed assestamento sotto le micropads via oculare o tramite lo schermo del computer. </li><li> Mantenere la pressione sullo stantuffo fino a quando le cellule sufficienti sistemano sotto i pad. Il carico ottimale è di 1-3 cellule per pad. Come le cellule si depositano sotto le pastiglie a caso, è abbastanza comune che un paio di pastiglie non contengono le cellule e gli altri rilievi sono completamente pieni di cellule. </li><li> Staccare la siringa usata per il carico delle cellule e il tubo di spessore ad esso collegato dal tubo sottile del canale di scarico, lavare la parte chAnnel per un paio di minuti a portate più elevate (10 microlitri / min) per rimuovere le bolle d&#39;aria e / o cellule che ancora non escono il chip (Figura 2B). Se le cellule non vengono rimossi dal canale laterale, possono iniziare a crescere nel canale laterale e interferire con l&#39;esperimento in seguito. </li><li> Mettere il flusso della pompa a siringa indietro fino a 0,5 microlitri / min e chiudere il canale laterale fuori collegandolo ad un tubo di spessore (lungo circa 5 cm) contenente una spina catetere alla sua estremità (Figura 2D). </li><li> Aumentare il flusso di una portata finale di 1-5 microlitri / min. La portata può variare a seconda di medie e ceppo di lievito. </li><li> Avviare un filmato con le impostazioni del microscopio e la fotocamera adatta per l&#39;obiettivo dell&#39;esperimento. Assicurarsi che la velocità della fase di microscopio è impostata una velocità bassa che l&#39;olio può seguire. Per la determinazione della durata della vita replicativa, celle di immagine ogni 10 min. Per proteggere le cellule dai minute quantità di luce UV emessa dalla alogenolampada, che è usato durante l&#39;acquisizione DIC, è consigliabile utilizzare un filtro UV supplementare nel percorso ottico. Quando si utilizza la microscopia a fluorescenza, si preferisce un&#39;immagine cellule minore frequenza (ad esempio ogni 20 min) per evitare effetti fototossiche. L&#39;esperimento è completato quando tutte le celle caricate all&#39;inizio dell&#39;esperimento sono morti, che in condizioni normali richiede fino a 5 giorni. Si raccomanda di controllare regolarmente la messa a fuoco delle immagini durante l&#39;esperimento e, se necessario, regolarlo. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth.">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast.">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).</li><li>Lee, S. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models.">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li><li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells.">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIR2/3/4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms.">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li><li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding.">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li><li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il metodo microfluidica descritto qui è un importante strumento di romanzo in ricerca di invecchiamento in quanto permette semplice e automatizzato generazione di lievito replicative dati di durata della vita in combinazione con immagini in sequenza ad alta risoluzione. Questi attributi sono importanti miglioramenti rispetto alle possibilità sperimentali del metodo classico dissezione, ma ci sono alcune limitazioni del metodo che devono essere presi in considerazione. Si noti che la durata...

Gemmazione lievito è un importante organismo modello per la ricerca di invecchiamento 1. Fino a poco studiando replicativa invecchiamento in cellule di lievito è un processo complesso che richiede un metodo di dissezione, in cui ciascuna gemma stata rimossa manualmente dalla cellula madre 2,3. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente presentato una nuova impostazione microfluidica in grado di tenere traccia di cellule madri singole in tutto il loro intero ciclo di vita 4. Nel nostro chip microfluidica, le cellule di lievito sono intrappolati sotto morbide micropads a base di elastomeri (vedi Figura 1). Un flusso continuo di medie lava via cellule figlie di nuova formazione e fornisce le cellule con sostanze nutritive fresche. In un singolo esperimento, fino a 50 cellule madri possono essere monitorati in modo completamente automatico durante il loro intero ciclo di vita replicativa. A causa delle eccellenti proprietà ottiche del chip microfluidica, è possibile monitorare contemporaneamente diversi aspetti della biologia delle cellule di lievito (es </em&gt;, utilizzando proteine ​​fluorescenti). Rispetto al metodo classico dissezione, la configurazione microfluidica offre notevoli vantaggi. Si garantisce un ambiente definito e costante durante l&#39;intero esperimento invecchiamento. Non richiede attrezzature specializzate costoso e può essere eseguito su qualsiasi microscopio dotato di messa a fuoco automatica e capacità di time-lapse, nonché di controllo della temperatura per la coltivazione delle cellule. La produzione e il funzionamento dei chip microfluidici possono essere apprese in pochi giorni. Inoltre, le cellule possono essere caricate direttamente da una coltura in crescita esponenziale, un vantaggio rispetto ad un altro metodo microfluidica recentemente pubblicato 5, che richiede biotinilazione di cellule madri. Combinato con un imaging ad alta risoluzione, il metodo qui descritto può essere usato per misurare cambiamenti graduali nella morfologia cellulare, l&#39;espressione della proteina e localizzazione durante lievito invecchiamento in un modo senza precedenti. La possibilità dimonitoraggio a lungo termine di cellule singole fornisce anche possibilità uniche per studi ciclo cellulare del lievito. un Questo metodo è stato recentemente ottimizzato per rimuovere la biotinilazione dal protocollo 16, che è stato pubblicato mentre questo manoscritto era in revisione.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

Dimostriamo l&#39;uso di una semplice impostazione microfluidica, in cui le cellule di lievito in erba singole possono essere monitorati in tutto il loro intero ciclo di vita. Il chip microfluidica sfrutta la differenza di dimensioni tra madre e figlia cellule utilizzando un array di micropads. Su caricamento, le cellule sono intrappolati sotto queste micropads, perché la distanza tra la Micropad e il vetro di copertura è simile al diametro di una cellula di lievito (3-4 micron). Dopo la procedura di caricamento, mezzo di coltura viene alimentata continuamente attraverso il chip, che non soltanto crea un ambiente costante e definita in tutto l&#39;intero esperimento, ma anche elimina le cellule figlie emergenti, non trattenuti sotto le pastiglie a causa della loro dimensione. Il setup conserva cellule madri modo così efficiente che in un singolo esperimento fino a 50 singole cellule possono essere monitorati in modo completamente automatizzato per 5 giorni o, se necessario, più lungo. Inoltre, le eccellenti proprietà ottiche del chip permettono elevatoImmagini a risoluzione di cellule durante l&#39;intero processo di invecchiamento.

In questo protocollo, le cellule vengono caricati nel chip microfluidica direttamente da coltura metà esponenziale. Per accertare se la distribuzione dell&#39;età di cellule intrappolate nel chip microfluidica è simile a quella della coltura prima del carico, le cellule sono state colorate con grano agglutinin coniugato a FITC (WGA-FITC) per visualizzare cicatrici gemma. Come visibile in figura 3, l&#39;intrappolamento delle cellule sotto le micropads del chip microfluidica non è polarizzato a cellu...

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Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Descriviamo qui il funzionamento di un dispositivo microfluidico che permette continuo e ad alta risoluzione di immagini microscopiche di cellule di lievito in erba singole durante la loro replicazione completa e / o durata cronologica.

Continuo ad alta risoluzione osservazione microscopica di replicativo invecchiamento nel lievito germogliante

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K Views.  University of Groningen. Descriviamo qui il funzionamento di un dispositivo microfluidico che permette continuo e ad alta risoluzione di immagini microscopiche di cellule di lievito in erba singole durante la loro replicazione completa e / o durata cronologica.

Video: Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l&#39;espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Corretto posizionamento e trattenuta di un ratto dell'arto per l'Imaging mirato ad alta risoluzione dell'osso utilizzando Micro-architettura In Vivo Micro-tomografia computerizzata

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Immagini 3D ad alta risoluzione della rete Neuro-insulari Pancreas umano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning tool. EHD printing uses a fluidic supplier to maintain the extruded meniscus by pushing the ink out of the nozzle tip. The electric field is then used to pull the meniscus down to the substrate to produce high-resolution patterns. Two modes of EHD printing have been used for fine patterning: continuous near-field electrospinning (NFES) and dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing. According to the printing modes, the requirements for the printing equipment and ink viscosity will differ. Even though two different modes can be implemented with a single EHD printer, the realization methods significantly differ in terms of ink, fluidic system, and driving voltage. Consequently, without a proper understanding of the jetting requirements and limitations, it is difficult to obtain the desired results. The purpose of this paper is to present a guideline so that inexperienced researchers can reduce the trial and error efforts to use the EHD jet for their specific research and development purposes. To demonstrate the fine-patterning implementation, we use Ag nanoparticle ink for the conductive patterning in the protocol. In addition, we also present the generalized printing guidelines that can be used for other types of ink for various fine-patterning applications.

Here, we present a protocol to produce high-resolution conductive patterns using electrohydrodynamic (EHD) jet printing. The protocol includes two modes of EHD jet printing: the continuous near-field electrospinning (NFES) and the dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing.

Alta risoluzione Patterning utilizzando due modalità di idrodinamiche Jet: Drop on Demand e Near-field elettrofilatura

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Alta risoluzione svevapacifico modellato mediante deposizione di Biofilm-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Imaging ad alta risoluzione di dinamiche nucleari in cellule vive sotto tensione uniassiale

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...