Gli autori desiderano ringraziare Miriam Ester per l&#39;allevamento delle zanzare. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti in-house dal Centro di Ricerca Borstel e si unì finanziamento da parte Infection Leibniz Center.

Misure di sicurezza ed etica Statement Gli studi qui presentati si riferiscono a lavori con l&#39;agente patogeno umano Mtb e il parassita della malaria Plasmodium berghei roditori (P. berghei). Esperimenti con Mtb (ceppo H37Rv) e P. berghei deve essere effettuata in condizioni di biosicurezza adeguate. Livello di biosicurezza (BSL) 2 laboratori sono necessari per i parassiti della malaria roditore come P. berghei e BSL 3 per Mtb e, quindi, per tutti gli studi coinfezione qui descritti. NOTA: I topi infettati con Mtb non si diffondono l&#39;infezione ad altri mouse all&#39;interno immediate vicinanze (la nostra osservazione). Diffusione per lo sperimentatore può quindi essere escluso; indumenti protettivi comunque opportuno deve essere indossato all&#39;interno della BSL 3 laboratorio in ogni momento. Secondo le nostre regole, sperimentatori indossano scrub chirurgico, retine per capelli, respiratori monouso, e due paia di guanti, di cui quello esterno è scartata ogni volta che unrms siano ritirati dal cabinet. Quelli nuovi sono messi in prima di entrare nuovamente l&#39;armadio. Due contenitori, uno con 2% Buraton (NOTA: altri disinfettanti approvati per inattivare Mtb possono essere usate alla concentrazione approvata) per i materiali di rifiuti liquidi e infettive e uno per la decontaminazione superficiale, vengono preparati prima dell&#39;esperimento e poste all&#39;interno dell&#39;armadio. Inoltre, saranno utilizzati i sacchetti di plastica per i rifiuti solidi non infettiva. Secondo la normativa tedesca, tutti i lavori che coinvolgono la manipolazione e la trasformazione di culture Mtb o tessuti derivati ​​da Mtb infettato topi devono essere effettuate in un armadio di sicurezza biologica classe 2 entro un laboratorio BSL3. Durante la manipolazione micobatteri, le misure devono essere adottate per evitare la formazione di aerosol in ogni momento. Femminile C57BL / 6 topi (Charles River) di età compresa tra 6-8 settimane sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti coinfezione e conservati in condizioni di barriera specifiche in BSL 3 strutture. Cura degli animali e la sperimentazione sono stati performed secondo protocolli approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del Ministero dell&#39;Agricoltura, Ambiente e aree rurali dello stato di Schleswig-Holstein Per ottenere fasi di zanzara della malaria, i topi NMRI sono stati acquistati da Charles River Laboratory, Sulzfeld, Germania e tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici all&#39;interno della struttura animale dell&#39;Università di Heidelberg (IBF). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le normative europee e approvati dalle autorità del Land Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Karlsruhe). 1. Aerosol infezione di topi con Mtb utilizzando un aerosol Camera Glas-Col Il modo migliore per uniformare l&#39;infezione aerosol di animali da esperimento con Mtb è quello di utilizzare i micobatteri da scorte congelate con noti titoli CFU. Per preparare colture stock, cultura Mtb in brodo Middlebrook 7H9 completato con OADC (oleicoacido, albumina, destrosio, catalasi) medio e 0,05% di arricchimento Tween 80, una fonte di carbonio per micobatteri e misurare per evitare grumi batterica allo stesso tempo. Colture devono avere un OD ≤ 1 al momento del raccolto. A più alto OD, aumenta agglomeranti batterici e diminuisce vitalità. Il negozio di 1 ml aliquote a -80 ° C. Determinare il numero di unità formanti colonie vitali (CFU) in azioni congelati placcatura una serie di diluizioni di 10 volte di tre fiale indipendenti sul 7H11 piastre di agar addizionato con lo 0,5% glicerolo, 1 g / L asparagina, e OADC ed enumerare le colonie dopo 4 settimane di incubazione a 37 ° C. Eseguire l&#39;infezione aerosol come descritto di seguito. <ol><li> Scongelare Mtb scorte di nota titolo CFU e mescolare accuratamente la sospensione per cinque volte per disperdere grumi batterica utilizzando una siringa da 1 ml dotato di un ago G 27. Evitare la produzione di aerosol. </li><li> A seconda della dose infezione desiderata, trasferire il volume richiesto dello stock micobatteri inun tubo da 50 ml contenente PBS sterile. Il volume finale è di 6 ml. NOTA: Variando il numero di microrganismi in questa sospensione, la percentuale di batteri recanti goccioline di aerosol è variata. Noi di solito puntiamo a un assorbimento di 100 bacilli vitali per polmonare (infezione a basso dosaggio). Nella nostra esperienza, questo richiede circa 1-2 x 10 6 mtb / ml in un volume totale di 6 ml, di cui 5,5 ml vengono nebulizzati (vedi sotto). Si consiglia di fare una serie di sfide aerosol sperimentali con diverse concentrazioni di batteri per trovare le condizioni ideali per l&#39;infezione. Considerando infezioni alte dosi con fino a 5.000 micobatteri può essere fatto per accelerare il processo infettivo, da un minimo di 5 batteri possono essere utilizzati per infettare successo topi da aerosol. Il grado di infezione è comunemente 100%. </li><li> Rimuovere un volume sufficiente (preparato in eccesso di volume finale richiesto) per la placcatura per determinare il titolo inoculo, solitamente rimuoviamo 500 microlitri alla piastra triplica tecnici. </li><li> Mettere animaliun cesto compartmented mesh (un mouse per cesto) all&#39;interno della camera di aerosol circolare e chiudere il coperchio della camera di aerosol. NOTA: Altri modelli sono equipaggiati con un cesto a forma di torta composto da cinque scomparti individuali, ognuna delle quali può ospitare 20 topi. </li><li> Collegare l&#39;unità Venturi-nebulizzatore ai tre giunti a manicotto in acciaio inossidabile. </li><li> Rimuovere la sospensione micobatteri dal tubo 50 ml con una siringa da 10 ml munita di un ago smussato 18 G e portare la siringa alla camera di aerosol in una scatola chiusa trasporto. </li><li> Rimuovere il tappo a vite dell&#39;unità nebulizzatore e accuratamente iniettare la sospensione micobatteri nel nebulizzatore. Evitare la formazione di aerosol. Gettare la siringa in un apposito contenitore contenente il 2% Buraton. Sigillare il nebulizzatore con tappo a vite. </li><li> Accendere l&#39;interruttore di alimentazione principale e la lampada UV. Il display sul pannello di controllo mostra &quot;Glas-Col Apparatus Co&quot;. </li><li> Accendere l&#39;interruttore programma su. La volontà di visualizzazionemostra &quot;è il nebulizzatore pronto?&quot; &quot;È il cesto caricato?&quot; Premere Invio quando è pronto &quot;. Premere Invio. </li><li> Il display visualizza &quot;Enter Tempo di preriscaldamento 900&quot;, questo significa che il tempo di preriscaldamento per l&#39;inceneritore (che decontamina l&#39;aria di scarico) è di 900 sec. Premere Invio. </li><li> Il display mostrerà &quot;Inserire tempo nebulizzazione 1.800&quot;, questo significa che il tempo di nebulizzazione è impostato a 1.800 sec di default. Al fine di estendere il tempo di nebulizzazione, immettere &quot;2400&quot; e premere invio. NOTA: Durante il ciclo di nebulizzazione, aria sotto pressione atomizza la sospensione, generando così piccole goccioline di aerosol contenenti micobatteri. Con il flusso d&#39;aria principale, queste goccioline (circa 2-5 micron di dimensione) sono portati nella camera di aerosol. </li><li> Il display mostrerà &quot;Inserire CD Tempo 1800&quot;, ciò significa che il ciclo di decadimento prende 1.800 sec. Impostato a &quot;2.400&quot; e premere Invio. NOTA: Durante questo ciclo, la nube che è stata costruita up nella camera di aerosol durante il ciclo di nebulizzazione può decadere. Le piccole goccioline vengono inalati da animali da esperimento. </li><li> Il display mostrerà &quot;Inserire Tempo dicembre 900&quot;, ciò significa che il ciclo di luce UV decontaminazione avrà 900 sec. Premere Invio. La macchina inizierà in bicicletta attraverso preriscaldamento, nebulizzazione, nube decadimento e la decontaminazione UV. ATTENZIONE: Il misuratore di portata vuoto dovrebbe indicare 60 cubic feet / hr (verificare quando il ciclo di preriscaldamento inizia, regolare la valvola di controllo del vuoto, se necessario) e il misuratore di flusso di aria compressa a 10 metri cubi / ora (controllare quando nebulizzazione inizio ciclo; regolare la valvola di controllo dell&#39;aria di conseguenza ). </li><li> Quando il ciclo è completo, la tastiera mostrerà &quot;Process Complete - Togliere Specimen&quot;. Spegnere il programma, UV e l&#39;interruttore di alimentazione principale. </li><li> Verificare se la sospensione micobatteri è stato nebulizzato completamente e se non, registrare il volume rimanente rimuovendo accuratamente la sospensione con una siringa specifico munitoun ago smussato 18 G. Il volume rimanente non deve essere superiore a 1 ml. </li><li> Rimuovere il nebulizzatore dalle articolazioni e mettetelo in un tegame contenente il 2% Buraton per un minimo di 2 ore, di solito la disinfezione è fatto O / N. Successivamente, trasferire il nebulizzatore ad una padella fresco e risciacquare abbondantemente con acqua. Lasciare nebulizzatore asciugare. </li><li> Aprire la camera di aerosol e ritorno degli animali nelle loro gabbie. Bag i cestini in sacchi autoclave e autoclave. Pulire le superfici della parte interna della camera di aerosol con il 2% Buraton. Nota: per ragioni di sicurezza, un respiratore purificatore d&#39;aria alimentato dovrebbero essere indossati durante questa procedura. </li><li> Utilizzando i restanti 500 ml di sospensione dei micobatteri (vedi punto 1.3) piastra diluizioni 10-fold di una triplice tecnica (3 x 100 ml) su piastre di agar 7H11. </li></ol> 2. Verificare assorbimento di desiderata CFU nei polmoni Un giorno dopo l&#39;infezione aerosol di animali da esperimento determinare la lo battericaannuncio nei polmoni di animali di controllo designate per verificare l&#39;assorbimento del CFU desideri. NOTA: Noi di solito designa un gruppo supplementare di 3-5 topi per il giorno 1 determinazione CFU. Per monitorare il decorso dell&#39;infezione Mtb nel corso del tempo, l&#39;onere tessuto micobatteri può essere esaminata dalla placcatura diluizioni seriali di omogenati interi organi per la determinazione CFU. Il polmone è il sito primario per la manifestazione della malattia nella tubercolosi tuttavia milza, fegato e linfonodi sono di solito analizzate di conseguenza. Le diluizioni essere placcato dipendono dal carico micobatteri previsto negli organi, che dipendono dal inoculo iniziale (dose bassa vs alta dose), che dà luogo a diversi carichi batterici in tessuto, nonché sull&#39;organo e punto di tempo analizzare. Al momento dell&#39;infezione dose bassa, la carica batterica di Mtb H37Rv nel polmone di solito raggiunge un plateau tra giorno 25-30. <ol><li> Posizionare gli animali sacrificati (eutanasia: CO 2 asfissia oanestesia terminale) su carta assorbente su una tavola di dissezione in un armadio biosicurezza di classe II e disinfettare i topi con il 70% di etanolo. NOTA: il 70% di alcol è solo per la decontaminazione superficiale e non ucciderà Mtb. </li><li> Fare una piccola incisione nel mezzo dell&#39;addome e retrarre la pelle del mouse sopra la testa. </li><li> Aprire l&#39;addome e la gabbia toracica con forbici chirurgiche e rimuovere la parete toracica in modo che i polmoni sono accessibili. </li><li> Rimuovere i polmoni e trasferire in una provetta da 15 ml con tampone di omogeneizzazione (acqua sterile / 1% v / v Tween 80/1% w / v albumina). </li><li> Utilizzando lo stantuffo di un 5 polmoni ml di deformazione siringa attraverso 100 micron setacci in una piccola capsula di Petri. </li><li> Setacci Lavare più volte con una pipetta 1 ml dotato di una punta barriera e distribuire l&#39;omogeneizzato polmone tra 8 piastre di agar (circa 250 ml / piastra;. Assicurarsi che essi hanno una superficie ben essiccato). </li><li> Piastra con cura i campioni con crocette e getta che vengono eliminati nel 2%Buraton. </li><li> Lasciare piastre di agar asciugare all&#39;interno del cabinet. Sigillare ogni singolo piatto con parafilm, avvolgerlo in un foglio di alluminio e incubare in posizione verticale a 37 ° C per almeno 4 settimane. </li></ol> 3. Costruzione di gabbie Mosquito a prova di fuga Ceppi di roditori Plasmodium non sono nocivi per l&#39;uomo. Tuttavia, poiché i topi Mtb-infettati sono i destinatari del parassita e del lavoro è fatto in BSL tre condizioni, precauzioni sono necessarie per evitare che le zanzare di fuggire loro gabbie. A seconda del regime di infezione previsto, può essere utilizzato autoclavabile e riutilizzabile gabbie di metallo del telaio o gabbie monouso self-made. Questi ultimi sono consigliate se da infezione morso di animali da esperimento è necessario per essere eseguite da un numero definito di zanzare per topo. Se sono richiesti gabbie self-made, preparare gabbie a specifiche esatte come la salute delle zanzare e la sicurezza del laboratorio dipende dalla loro sound costruzione (Figura 2). <ol><li> Prendere una scatola come una mezza pinta gelato scatola o tazza di carta (Figura 2). </li><li> Tagliare una piccola apertura nel lato del cartone e coprire con un doppio strato di lattice con una fessura tagliata in ogni pezzo di creare un ingresso sicuro per le zanzare. NOTA: L&#39;apertura ha una dimensione complessiva di 2 cm x 2 cm, il tubo (aspiratore) che usiamo per portare e / o prendere-out zanzare è una versione modificata del tubo da 15 ml Falcon collegato a una pompa a vuoto e, quindi, funge da un aspiratore con un diametro di 1,5 cm. </li><li> Nastro un pezzo di carta da filtro sul fondo interno della scatola per assorbire gocce. </li><li> Chiudete coppe gelato con la rete (doppio strato di maglia di nylon, taglia 1 mm x 1 millimetri) e fissare al cartone con nastro ed elastico. </li><li> Per esperimenti di infezione in cui servono numeri definiti di zanzare per topo, preparare gabbie con 10-15 zanzare infette, ognuno dei quali contiene idealmente un average di 10.000 wild-type ghiandola salivare P. sporozoiti berghei. </li><li> Idealmente, morire di fame zanzare per 24 ore prima di eseguire il pasto di sangue. </li></ol> 4. Malaria infezione di topi da Mosquito Bite Il parassita della malaria roditore qui utilizzato è P. berghei comunque qualsiasi altro ceppo di roditori Plasmodium di interesse può essere utilizzato. Per ottenere le zanzare infettive per la trasmissione sporozoite l&#39;intero ciclo di vita del parassita è mantenuto sia l&#39;ospite vertebrato (mouse) e il vettore zanzara. Manutenzione parassita viene effettuata in un insectary. Per gli esperimenti di trasmissione naturali, il numero minimo di sporozoiti alla ghiandola salivare deve essere inferiore a 10.000. Per i protocolli dettagliati per la manutenzione parassita si fa riferimento ai metodi di ricerca sulla malaria da Moll et al., 2013. <ol><li> Anestetizzare topi naïve o animali preinfected per 40 giorni con Mtb con ketamina (100 mg / kg)e xilazina (7 mg / kg) soluzione per iniezione intraperitoneale (200 ml / topo). NOTA: Il tempo tra l&#39;infezione Mtb e Plasmodium può essere regolata a seconda della domanda di ricerca sottostante. Analogamente, l&#39;ordine delle sfide patogeno può essere invertita, ossia topi possono essere esposti a infettiva puntura di zanzara prima dell&#39;infezione Mtb. </li><li> Mettere i topi anestetizzati sulla rete delle gabbie zanzara (un topo per gabbia zanzara di zanzara definito il rapporto del mouse) e permettono le zanzare per alimentare attraverso la membrana per 10-15 min. NOTA: La presenza di sangue nelle viscere della zanzara implica alimentazione e, quindi, la trasmissione sporozoite. </li><li> Trasferire i topi nelle loro gabbie e supervisionare costantemente fino a quando si svegliano dall&#39;anestesia. NOTA: Topi posto sul tovagliolo di carta e non sul assestamento (pericolo di soffocamento) e mantenere (posto in stretta collaborazione e coprire corpi con un tovagliolo di carta) caldo. </li><li> Uccidere le zanzare da loro spruzzo con il 70% di etanolo o altri disinfettanti attraverso la nettzione della gabbia. Gabbie autoclave e scartano se sono stati utilizzati quelli usa e getta. </li></ol> 5. Parassitemia Monitoraggio <ol><li> Puntura coda vene alla fine con un ago e raccogliere una goccia di sangue a ciascuna estremità di una diapositiva. </li><li> Utilizzare un altro scivolo per tirare una goccia di sangue oltre la metà della lunghezza della diapositiva. Capovolgere il divaricatore di utilizzare l&#39;altro bordo per il secondo striscio. Lasciare i vetrini asciugare all&#39;aria. </li><li> Giemsa <ol><li> Porre i vetrini in portavetrini e fissare gli strisci di sangue da una breve immersione in metanolo assoluto. NOTA: Perché l&#39;uso di articoli di vetro dovrebbe essere mantenuto al minimo in BSL 3 usiamo cuvette polipropilene per tutte le soluzioni. </li><li> Immergere gli strisci di Giemsa (1:10 in acqua deionizzata). Dopo 10 minuti, immergere i vetrini dentro e fuori di cuvette colorazione riempiti con acqua deionizzata un paio di volte per lavare via la macchia in eccesso. </li><li> Infine, asciugare i vetrini in posizione verticale. </li></ol></li><li> MACCHIE ALTERNATIVA: Wright &amp; #180; s macchia <ol><li> Sciogliere Wright macchia ad una concentrazione di 1 mg / ml in metanolo. </li><li> Filtrare su filtro a pieghe prima dell&#39;uso. </li><li> Immergere gli strisci di sangue nella soluzione colorante e incubare per 4 minuti (NOTA: metanolo fissazione di strisci non è necessaria in quanto la soluzione colorante è metanolo based). </li><li> Lavare i vetrini risciacquo in acqua deionizzata come descritto sopra e lasciare diapositive asciugare all&#39;aria. </li><li> Una volta Giemsa / Wright s &#39;è completa, trasferire delicatamente tutti i reagenti utilizzati in una disposizione pot-Buraton contiene. </li></ol></li><li> Analisi striscio di sangue <ol><li> Analizzare striscio di sangue colorato al microscopio ottico con un ingrandimento di 100 volte con immersione in olio. </li><li> Conte eritrociti infetti e infetti in una zona del striscio di sangue in cui eritrociti sono disposti in un monostrato. </li><li> Al fine di raggiungere una parassitemia ben definita, contare almeno 10 diversi campi di vista che visualizzano un monostrato eritrociti. </li><li> Calculmangiato la parassitemia relativa (in%) dividendo il numero di eritrociti parassitati dal numero di eritrociti e moltiplicando per 100. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo descritto come topi possono essere produttivamente infettati con Mtb e P. berghei attraverso i loro percorsi naturali di infezione. Applichiamo stabilito protocolli di infezione per studiare la tubercolosi o la malaria sperimentale 13 12 e recentemente li adottato per studiare coinfezione tra Mtb e Plasmodium nel modello murino 1. Le fasi più critiche per le infezioni di successo sono la trasmissione di entrambi i patogeni ai numeri desiderati. Scorte micobatteri non dovrebbero essere più vecchio di due anni perché perderanno vitalità nel tempo, e il titolo originariamente determinato degli stock molto probabilmente non saranno più accurate. Come risultato, le dosi infettive sarebbero molto inferiore al previsto. Pertanto, CFU titoli di culture archivi dovrebbero essere stabiliti ogni pochi mesi. Altrettanto importante è la coltivazione standardizzata e la generazione delle scorte Mtb, in primo luogo. Condizioni di coltura comemedio, integratori, tempo e volume dovrebbero essere standardizzati in modo da poter confrontare i dati provenienti da esperimenti utilizzando diversi scorte di Mtb. Micobatteri tendono a raggrupparsi in cultura, quindi è importante mantenere condizioni di coltura standardizzato, batteri raccolto presso la stessa fase di crescita e risospendere frequentemente durante aliquotazione. Altrimenti non ci può essere un&#39;ampia variazione nei titoli e CFU esito infezione. La generazione di lotti di zanzara omogeneamente infetti è un altro passo fondamentale. Da diversi zanzare si nutrono di ogni singolo topo, è importante che tutte le zanzare utilizzati per un esperimento di infezione provengono dallo stesso lotto e che sono utilizzati soltanto lotti in cui più del 90% delle zanzare sono infettati. L&#39;attuale modello può essere utilizzato per analizzare le risposte immunitarie e modulazioni immunitarie in un host coinfezione confrontandola con le risposte immunitarie in host infetti singoli. Possiamo applicare various metodologie già consolidati, come l&#39;istologia, immunoistochimica, analisi di citometria di popolazioni di cellule immunitarie, o PCR ed ELISA per citochine e chemochine rilevazione ai tessuti o fluidi corporei di interesse. Va notato che tali modelli murini hanno alcune limitazioni. Considerando che la maggior parte delle persone infettate con Mtb sviluppare una infezione latente senza segni di sintomi clinici, i topi sviluppano una malattia cronica progressiva patologia polmonare. Eppure, C57BL / 6 topi sono relativamente resistenti all&#39;infezione Mtb e non sviluppano granulomi classici come osservato in pazienti affetti da tubercolosi umani. Di conseguenza, le reazioni immunopatologici nel topo riflettono né malattia né attiva latente tubercolosi umana appropriato. Nonostante la discrepanza tra la malattia latente e cronica nell&#39;uomo e mouse, i topi sono stati ampiamente utilizzati per identificare e studiare fattori dell&#39;ospite che controllano l&#39;infezione Mtb e sono strumenti preziosi e indispensabili per indagarerisposte immunitarie in malattie infettive. Importante, suscettibilità alle infezioni Mtb varia considerevolmente tra ceppi di topi inbred comunemente utilizzati e più ceppi sensibili come DBA o C3H possono essere inclusi in studi co-and-infezione singolo. Inoltre, a parte dell&#39;agente patogeno qui descritti, possono essere usati qualsiasi altra specie Mycobacterium di interesse (ad esempio isolati clinici). Allo stesso modo, mentre un unico modello malaria replica tutti gli aspetti della malattia umana diversi modelli murini non assomigliano molto differenti aspetti della acquisita naturalmente malaria umana. Per esempio, P. berghei ANKA e P. yoelii YM/17XL sono ampiamente studiati modelli di umana (P. falciparum-indotta) malaria grave, con P. berghei ANKA essere considerato come un ottimo modello per Malari cerebrale umana s 14,15. P. berghei NK65 è un ottimo modello per iperparassitemia e anemia malarica acuta, ed è stato recentementedescritto come modello sperimentale per la sindrome da distress respiratorio malaria-associata (MA-16 ARDS). Utilizzando il modello coinfezione descritto, abbiamo potuto dimostrare recentemente che concomitante P. infezione berghei NK65 aggrava la tubercolosi cronica 1. Oltre ad utilizzare diversi parassiti della malaria roditore, l&#39;ordine e la tempistica degli eventi di infezione possono essere adeguati a seconda della domanda di ricerca sottostante. Nel campo, infezioni Plasmodium concomitanti possono essere presenti al momento dell&#39;infezione Mtb o acquisite successivamente. In entrambi i casi le risposte immunitarie a Mtb e Plasmodium possono essere influenzati in modo diverso. Pertanto, i topi possono essere infettati da Plasmodium sporozoiti prima o dopo l&#39;infezione Mtb. Inoltre, i topi possono essere contestate in tempi diversi postare infezione Mtb per valutare l&#39;impatto della risposta immunitaria Plasmodium-indotta acuta rispetto cronicatubercolosi. È importante sottolineare che, quando si sceglie un parassita della malaria per studiare la malaria-tubercolosi coinfezione, si deve essere consapevoli del fatto che alcuni ceppi di Plasmodium roditori causano malattie acute in alcuni ceppi di topo e soccombere alle infezioni entro pochi giorni o settimane, mentre Mtb causa cronica e infezioni di lunga durata in immunocompetente topi. Quindi, i tempi di coinfezione è cruciale al fine di evitare la morte prematura degli animali da esperimento. La modulazione dell&#39;immunità ospite da infezione simultanea con più specie di patogeni rimane poco conosciuta. Il nostro modello di coinfezione sperimentale fornisce un potente strumento per indagare Mycobacterium - Plasmodium interazione con il sistema immunitario di un host coinfezione e contribuiranno alla nostra comprensione di come co-infezioni possono influenzare la patogenesi, decorso della malattia, la vaccinazione, immunodiagnostics, e la terapia.

Popolazioni umane sono raramente esposti a un solo patogeno. In particolare nelle regioni con alta incidenza di infezioni come l&#39;Africa sub-sahariana, coinfezioni rappresentano un problema di salute pubblica primaria ma altamente sottovalutata. Tubercolosi e malaria sono le infezioni batteriche o parassitarie più frequenti nell&#39;uomo, rispettivamente, e continuano ad essere le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Nonostante l&#39;ampia sovrapposizione geografica tra la tubercolosi e la malaria e il gran numero di persone a rischio di coinfezione, si sa molto poco circa le interazioni tra i vari e spesso di contrasto regolatori del sistema immunitario ed effettori contemporaneamente suscitate contro i parassiti della malaria e bacilli tubercolari in individui con coinfezione. Modelli di roditori di infezioni miste permettono di caratterizzare le reazioni immunitarie differenziali contro gli agenti patogeni distinti in un host, mettendo così in luce la reciproca influenzarenze modulando patologia e l&#39;esito clinico della malattia individuale, che aiuterà anche a individuare nuove raccomandazioni per la terapia e la prevenzione. Abbiamo stabilito un modello sperimentale del mouse che ci permette di indagare le conseguenze causate da infezione concomitante da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e specie di roditori Plasmodium all&#39;interno dello stesso host 1. È importante sottolineare che, per emulare il più fedelmente possibile le infezioni umane naturalmente acquisite, il nostro modello implementa le vie naturali di infezione utilizzati da entrambi i patogeni. La tubercolosi è un&#39;infezione aerea, che quindi manifesta principalmente nei polmoni. L&#39;agente eziologico, Mtb è trasmesso da persone con malattia attiva per via aerosol quando si espellono goccioline di aerosol infettivi durante la tosse o starnuti. Pertanto, l&#39;infezione aerosol è il metodo di scelta per imitare infezione naturale. Generazione di particelle sospese nell&#39;aria che contengono Mtb può essere ottenuto mediante l&#39;usodi un sistema di esposizione per inalazione. Questa intera camera di esposizione corpo permette di esporre animali sperimentali per Mtb contenenti goccioline di aerosol infettivi (Figura 1) che vengono inalati negli alveoli dei polmoni dove viene avviata infezione 2. Malaria invece è una malattia trasmessa da vettori causata dal protozoo, Apicomplexa parassita Plasmodium che è naturalmente trasmessa dal morso di una zanzara anofele femmina. Durante la farina di sangue, sporozoiti infettanti sono depositati sotto la pelle ospitante e successivamente raggiungono il fegato attraverso il flusso sanguigno. All&#39;interno di epatociti si sviluppano e si moltiplicano rapidamente in schizonti fegato stadio. Alla fine, schizonti maturi rompono e rilasciano migliaia di patogeni merozoiti di prima generazione nel flusso sanguigno, dove l&#39;inizio di un ciclo progressivo di invasione dei globuli rossi, la replica, la rottura dei globuli rossi, e reinvasion 3. Il Plasmodium ciclo di vita continUES come alcuni merozoiti si sviluppano nelle fasi parassiti sessuali, i gametociti maschili e femminili, che possono essere ripresi dalle zanzare durante i pasti di sangue. Nella zanzara, sporozoiti del Plasmodium si sviluppano all&#39;interno di oocisti residenti nel midgut zanzara e, infine, migrano verso le ghiandole salivari per la ritrasmissione in un altro 3,4 host. Mentre in modelli sperimentali animali la consegna della Mtb tramite aerosol e via così più rilevante è molto comune, molti studi infezione roditori Plasmodium sperimentali compresi studi sulla malaria, tubercolosi coinfezione 5-7 sono stati effettuati infettando topi con eritrociti parassitati, dando luogo alla malaria infezione del sangue-fase, mentre escludendo la fase epatica fase clinicamente silente. Tuttavia, la fase di fegato è una tappa obbligatoria durante l&#39;infezione e rilevante per l&#39;immunità anti-plasmodiale 8-11. Riteniamo quindi importante includere il ph epaticaase di trasmissione della malaria e manutenzione in studi sia di malaria e tubercolosi malaria-coinfezione, rispettivamente. Inoltre, è stato dimostrato che sporozoiti trasmessi naturalmente sono più virulenta quelli trasmessi da infezioni ago 12, che ci hanno spinto a stabilire l&#39;infezione da malaria zanzara mordere invece di iniettare ghiandole salivari isolato sporozoiti derivati. L&#39;unico modo per ottenere le zanzare infettive per la trasmissione naturale dei parassiti della malaria è quello di mantenere l&#39;intero ciclo di vita del parassita sia l&#39;ospite vertebrato (qui mouse) e il vettore zanzara. L&#39;accesso ad un insectary per manutenzione parassita è inevitabile per eseguire la trasmissione naturale morso. Il nostro protocollo qui descritto è stato sviluppato per studiare come coinfezione da Plasmodium sporozoiti impatti sulla tubercolosi cronica 1. Per farlo, i topi sono aerosol infettati con M. tubercolosi e 40 giorni più tardi, quando M. infezione da tubercolosi ha raggiunto la fase cronica, i topi sono esposti alle zanzare malaria-infettiva. L&#39;esito di entrambi malaria e tubercolosi sugli animali coinfezione può essere seguita monitorando parassitemia sangue e carica batterica nel tessuto, rispettivamente. Nel nostro protocollo, descriveremo in dettaglio come infettare i topi con entrambi i patogeni attraverso il loro percorso infezione naturale e come confermare la trasmissione del patogeno successo. Nelle nostre mani, il grado di infezione comunemente conseguito per entrambe le infezioni sperimentali è 100%. Questi protocolli possono essere applicati a studiare entrambe le infezioni separatamente o, come noi, per modellare e studiare coinfezione tra due delle malattie infettive umane più difficili. Questo modello è applicabile ad altre specie Mycobacterium e roditori Plasmodium oltre quelle descritte in questo protocollo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="650">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Buraton</td>
			<td style="width:124px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Middlebrook 7H9&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0178</td>
			<td style="width:191px;">For Mtb broth cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook 7H11&#160;</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">283810</td>
			<td style="width:191px;">Agar medium for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook OADC enrichment medium</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212240</td>
			<td style="width:191px;">Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Staining Dish</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62542-12</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-Slide Holder w/Handle</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62543-06</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution</td>
			<td style="width:124px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">109204</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wright&#180;s stain</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W0625</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inhalation Exposure System</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nebulizer-Venturi</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice cream cups</td>
			<td style="width:124px;">H&#228;agen-Dazs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">Used as mosquito cages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal-frame mosquito cages</td>
			<td style="width:124px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:119px;">1450A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of mycobacterium tuberculosis and plasmodium berghei

Coinfezione naturalmente si verificano a causa della sovrapposizione geografica di diversi tipi di organismi patogeni. Infezioni concomitanti probabilmente modulano la rispettiva risposta immune ad ogni singolo agente patogeno e possono quindi influenzare la patogenesi e l&#39;esito della malattia. Pazienti co-infetti possono anche rispondere in modo differenziato agli interventi anti-infettivi. La coinfezione tra tubercolosi causata da micobatteri e il parassita della malaria Plasmodium, che sono entrambi coendemic in molte parti dell&#39;Africa sub-sahariana, non è stato studiato in dettaglio. Per accedere alla impegnativo ma scientificamente e clinicamente questione di grande rilevanza come la malaria, la tubercolosi coinfezione modulare l&#39;immunità ospite e il decorso di ogni malattia, abbiamo stabilito un modello sperimentale del mouse che ci permette di sezionare le risposte immunitarie indotte a entrambi i patogeni nell&#39;ospite coinfezione . Da segnalare, per la maggior parte delle infezioni umane precisamente imitare naturalmente acquisiti, eseguiamo sperimentaleinfezioni di topi con entrambi i patogeni da parte dei loro percorsi naturali di infezione, cioè aerosol e puntura di zanzara, rispettivamente.

L&#39;infezione di topi con Mtb e P. berghei per via naturale, cioè aerosol e puntura di zanzara, rispettivamente, provoca l&#39;infezione e riproducibile di tutti gli animali (Tabella 1) 1. Possiamo monitorare infettati e il corso di entrambi malaria e tubercolosi determinando il verificarsi iniziale (prepatency) e numero di parassiti nel sangue (P. berghei parassitemia) e l&#39;onere di Mtb in diversi organi, rispettivamente. Un esempio di successo trasmissione parassita della malaria da puntura di zanzara infetta è mostrato nella Tabella 1 e nella Figura 3. Alimentazione di 10 zanzare sporozoite infettate di ciascun topo ha determinato un tasso di infezione 100% come confermato dalla presenza di parassiti sangue-fase 4-5 giorni (Tabella 1 e Figura 3A). Importante, troviamo numeri parassiti simili nel sangue di topi individuo della stessa gr sperimentaleOUP, indicando che la trasmissione sporozoite risultati per puntura di zanzara in una infezione e riproducibile. Confrontando la prepatency in topi di controllo naive con quella in animali Mtb-coinfezione, possiamo vedere che prepatency è leggermente ritardato nei topi che erano stati preinfected con Mtb (Tabella 1, Figura 3B) 1. Come abbiamo riportato in precedenza 1, possiamo determinare l&#39;impatto di Mtb coinfezione sul corso della malaria da giornaliero parassitemia monitoraggio negli strisci di sangue colorati con Giemsa come mostrato in Figura 3B. L&#39;infezione di topi con Mtb con l&#39;uso di un sistema di esposizione per inalazione provoca successo deposizione di batteri nei polmoni con relativamente bassa variabilità tra i topi individuale (Figura 4A). Possiamo seguire carichi micobatteri nei polmoni e in altri organi di interesse nel corso del tempo dalla determinazione CFU. Un esempio per il carico micobatteri in polmoni diMtb infettato topi C57BL / 6 in assenza o presenza di P. berghei è illustrato nella Figura 4B. Tabella 1. Prepatency dopo la trasmissione sporozoite da puntura di zanzara. Tutti i topi hanno sviluppato infezioni del sangue-fase dopo la trasmissione naturale di P. berghei sporozoiti da puntura di zanzara. Adattato da 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 con il permesso. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gruppo sperimentale mouse (C57BL / 6) </td><td> Sfida di 10 punture di zanzare infettive </td><td> Numero di sangue tappa positiva animali / Numero di animali per gruppo </td><td> Media prepatency [d] </td></tr><tr><td> naïve </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 4,4 </td></tr><tr><td> Mtb infetto </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 5,5 </t<html> d&gt; </tr></tbody></table><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg" /> Figura 1. Schema generale della procedura sperimentale. C57BL / 6 topi sono esposti alla Mtb contenenti goccioline di aerosol in una camera di aerosol Glas-Col. Un giorno dopo l&#39;infezione aerosol, l&#39;assorbimento di Mtb è verificata mediante analisi CFU del polmone. 40 giorni dopo Mtb sfida (quando la tubercolosi è diventata cronica in topi infettati), gli animali sono esposti a P. berghei infettato zanzare. Per confermare la trasmissione sporozoite di successo e di seguire il corso di infezione da Plasmodium, parassitemia viene monitorato giornalmente in Giemsa-macchiate strisci di sangue a partire tre giorni dopo la puntura di zanzara. / Files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Schizzo di una gabbia zanzara. Zanzare infettive sono contenuti all&#39;interno di una scatola, come una mezza pinta di cartone gelato. Una piccola apertura viene tagliato nel lato del cartone e ricoperta con un doppio strato di lattice con una fessura tagliata in ogni pezzo di creare un ingresso sicuro per le zanzare. Un pezzo di carta da filtro è registrato sul fondo interno della scatola per assorbire gocce. Coppe gelato sono chiuse con compensazione (Nylon mesh) che è fissato alla scatola da nastro ed elastico. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg" /> Figura 3. Parassitemia sangue. A) Esempio di macchiato striscio di sangue di un Wright `s mostra eritrociti parassitati (bar Scala, 20 &amp; #181;. M) B) parassitemia nel sangue topo è stato monitorato attraverso l&#39;analisi quotidiana strisci di sangue Giemsa-macchiate. Topi coinfezione hanno una parassitemia ridotto rispetto al Plasmodium topi infettati singoli (n = 10); risultati sono riportati come media ± SD; *** p &lt;0,001. Ristampato da 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 con il permesso. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg" /> Figura 4. Rilevamento di Mtb nel polmone. C57BL / 6 topi sono stati aerosol sfidato con 100 CFU di Mtb e 40 giorni dopo, coinfezione con P. berghei da puntura di zanzara. A) Un giorno dopo l&#39;infezione aerosol l&#39;assorbimento del numero desiderato di Mtb è stata verificata mediante placcatura interi omogenati di polmone per la determinazione CFU. b) Battericarichi L al momento della coinfezione stati determinati in lisati polmonari di topi con 3 CFU analisi (Mtb d40/d0). 12 giorni dopo coinfezione, lisati polmonari sono stati placcati per l&#39;analisi CFU per determinare l&#39;impatto del Plasmodium coinfezione sul controllo Mtb. Si noti, che i numeri Mtb nei polmoni aumentati durante coinfezione con P. berghei NK65. Etichettatura X-axis: dopo Mtb -infection/time dopo coinfezione. Adattato da 1 PLoS ONE, 7 (10), e48110 con il permesso.

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An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

La tubercolosi e la malaria sono due delle infezioni più diffuse negli esseri umani e le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Abbiamo stabilito un sistema modello sperimentale per lo studio esito della malaria, tubercolosi coinfezione nei topi dopo la sfida con entrambi i patogeni tramite il loro percorso naturale di infezione.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

an-experimental-model-to-study-tuberculosis-malaria-coinfection-upon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

19.7K Views.  University Hospital Heidelberg.  La tubercolosi e la malaria sono due delle infezioni più diffuse negli esseri umani e le principali cause di morbilità e mortalità nelle popolazioni povere nei tropici. Abbiamo stabilito un sistema modello sperimentale per lo studio esito della malaria, tubercolosi coinfezione nei topi dopo la sfida con entrambi i patogeni tramite il loro percorso naturale di infezione. 

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Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparazione del campione di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

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Immunologia e infezioni

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

Un nuovo approccio Microdissezione per recuperare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Trascrizioni specifici da formalina paraffina fisso incorporato Lung granulomi

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Un 3D Polmone umano tessuto modello per studi funzionali su<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infezione

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...