Attualmente abbiamo una comprensione limitata della biologia dell'infezione da plasmodio del fegato. Questo protocollo ci ha aiutato a generare molte linee transgeniche che ci hanno aiutato a rispondere ad alcune domande critiche sulla biologia dell'organismo. Una conoscenza di base del parassita e della sua biologia è necessaria per sviluppare nuovi strumenti e approcci per combattere l'infezione da malaria.
Il metodo di transgenesi che stiamo descrivendo qui ci ha aiutato a decifrare alcune caratteristiche chiave e complesse della biologia dell'organismo e dell'ospite. A dimostrare questa procedura sarà Carson Bowers, il mio responsabile di laboratorio. Dopo aver generato topi infetti da P.Bergehei e averli sottoposti a eutanasia, raccogliere due millilitri di sangue da due topi infetti in cinque millilitri di soluzione Elsevier in un ambiente sterile.
Centrifugare il sangue a 450 g per otto minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di terreno RPMI completo. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare e risospendere il pellet in 25 millilitri di terreno RPMI completo.
Trasferire la sospensione cellulare in un matraccio da coltura T75 con tappo filtrante e incubare agitando delicatamente per mantenere le cellule in sospensione. Al termine dell'incubazione, raccogliere 500 microlitri del campione. Centrifugare e risospendere il pellet in 10 microlitri di terreno RPMI completo.
Quindi, prepara uno striscio di sangue sottile. Macchia lo striscio di sangue con la macchia di Giemsa e determina la frequenza degli schizonti. Per un'efficienza di trasfezione ottimale, il 60-70% dei parassiti dovrebbe essere allo stadio di schizonto.
Preparare un tampone di centrifugazione a gradiente ricostituendo 13 millilitri di terreno di prova a gradiente di densità in una provetta di centrifugazione da 50 millilitri. Trasferire 25 millilitri di emocoltura in una nuova provetta da centrifugazione da 50 millilitri. Quindi stratificare con cura 20 millilitri di tampone di centrifugazione a gradiente sul fondo della provetta di centrifugazione, utilizzando una pipetta di vetro stretta per creare una colonna a gradiente e garantire una chiara divisione tra il tampone e il terreno.
Centrifugare il tampone preparato e il terreno per 20 minuti a 450 g senza interruzioni a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta da pascolo, rimuovere con cautela lo strato di schizont all'interfaccia tra il terreno di coltura e il tampone di centrifugazione a gradiente. Mettilo in una nuova provetta da centrifugazione da 50 millilitri.
Risospendere gli schizonti isolati in un terreno RPMI completo e aumentare il volume totale a 40 millilitri. Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante, risospendere lo schizont in 10 millilitri di terreno RPMI completo. Quindi trasferire un millilitro di questa soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per ogni trasfezione e pellettare le cellule infette mediante centrifugazione a 16.000 G per cinque secondi.
Successivamente, combinare 100 microlitri di tampone per elettroporazione a temperatura ambiente con cinque microgrammi di DNA plasmidico target in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver centrifugato le cellule infette, rimuovere il surnatante e risospendere con cautela le cellule nella soluzione nucleoefector preparata più DNA plasmidico. Quindi trasferire la sospensione in elettroporazione, cuvette e trasfetto utilizzando un programma nucleofettore adatto.
Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno RPMI completo alla cuvetta. Trasferire l'intera soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e posizionarla sul ghiaccio. Verificare i livelli di parassitemia nei topi inoculati con lo schizont trasfettato giornalmente a partire da due giorni dopo l'inoculazione.
Una volta confermata l'infezione, iniziare la selezione del farmaco somministrando il farmaco per via orale e bevendo acqua offerta ad libitum. Monitorare la parassitemia utilizzando strisci di sangue a partire da sei giorni dopo l'inizio del trattamento con pirometimmina. Quando la parassitemia raggiunge almeno l'1%, trasferisci i parassiti a topi B6 naïve per creare scorte di parassiti allo stadio sanguigno.
Una volta che la parassitemia raggiunge il 2%-5%, generare scorte e crioconservarle. Un giorno prima dell'infezione da zanzare, separare le zanzare femmine mettendo un guanto pieno d'acqua riscaldata a 37 gradi Celsius sopra la gabbia contenente zanzare sia maschi che femmine. Usa un aspiratore per insetti per rimuovere le zanzare femmine attratte dalla fonte di calore e trasferiscile in una gabbia più piccola per l'infezione.
Il giorno dell'alimentazione e dell'infezione delle zanzare, determinare la parassitemia nei topi B6 infetti. La parassitemia tra il 2% e il 5% è ottimale per l'infezione da zanzare. Dopo aver verificato la parassitemia, trasferire l'infezione alle zanzare femmine posizionando i topi anestetizzati sulle zanzare femmine in gabbia sotto decubito sternale.
Allargare manualmente le zampe anteriori e posteriori per fornire la massima superficie per l'alimentazione delle zanzare. Lasciare i topi infetti in ogni gabbia per 15 minuti, controllando ogni cinque minuti per assicurarsi che i topi non siano svegli. Una volta che l'alimentazione è completa e i topi sono stati soppressi, smaltirli in modo sicuro seguendo le linee guida dell'istituto.
Per verificare il successo dell'infezione all'interno delle zanzare, isolare l'intestino medio delle zanzare rimuovendo il segmento addominale terminale con una pinza 10 giorni dopo l'infezione. Quindi osserva l'intestino medio sotto la luce polarizzata per rilevare la presenza di oocisti. A 18 giorni dall'infezione, sezionare da cinque a 10 zanzare per valutare il numero di sporozoiti presenti.
Per isolare e contare gli sporozoiti, rimuovere con cautela la testa della zanzara mentre si applica una pressione sul torace con una pinza o un ago da dissezione fine. Le ghiandole salivari rimarranno attaccate alla testa rimossa. Successivamente, rimuovere eventuali detriti di zanzare aggiuntivi dalle ghiandole salivari e metterli in una provetta da micro centrifuga contenente 400 microlitri di terreno di dissezione delle zanzare.
Quindi interrompere le ghiandole salivari isolate facendole passare attraverso una siringa ad ago calibro 30 da 15 a 20 volte, Successivamente, posizionare 10 microlitri delle ghiandole salivari interrotte in un mezzo di dissezione delle zanzare in un emocitometro e contare. Infine, sospendere nuovamente le ghiandole salivari nella concentrazione desiderata di mezzi di dissezione delle zanzare o PBS per l'iniezione nei topi o la crioconservazione a lungo termine. Come al microscopio, vengono presentate immagini raffiguranti schizont di P.berghei maturo e immaturo in emocolture di topo parassitate.
Come le immagini al microscopio di una testa di zanzara con le ghiandole salivari ancora intatte durante la dissezione, e la ghiandola salivare sezionata sotto ingrandimenti più bassi e più alti. La generazione del segnale di fluorescenza verde nel PB, GFP 11 ha infettato HEPA GFP da uno a 10 cellule ospiti ha indicato la lisi del vacuolo parassitoforo. È importante rimuovere con cautela lo strato del chaisson senza interrompere l'interfaccia del gradiente.
Inoltre, ci vuole un po' di pratica per rimuovere in modo affidabile le ghiandole salivari insieme alla testa durante l'isolamento alla luce delle spore. Dopo l'isolamento, gli sporozoiti transgenici possono essere crioconservati o utilizzati freschi per studi di infezione in vivo o in vitro.
