Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal National Institutes of Health (GM093282 di PW; 3U54AI057158-06S1 a RDS) e fondi di avvio di Albert Einstein College of Medicine.

1. Uovo Raccolta e Dechorionation <ol><li> Raccogliere e trasferire le uova di pesce zebra piatto 35 millimetri di Petri, rimuovere l&#39;acqua il più possibile e si aggiunge 1 mg / ml E Pronease nel medio embrione E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) per digerire il corion. </li><li> Dopo 3-5 minuti, unire il piatto in un bicchiere pieno di pesci d&#39;acqua (60 mg &quot;Ocean istantanea&quot; per litro distillata H 2 O), e delicatamente trasferire le uova nel becher e lasciare le uova di &quot;caduta&quot; in acqua. </li><li> Lavare le uova con pesci d&#39;acqua tre volte. La maggior parte delle uova saranno liberati dalla loro corion. </li><li> Utilizzando un incendio lucidato vetro pipetta Pasteur, trasferire le uova dechorionated di agarosio rivestite piastre di Petri riempite con terreno di embrione E3. </li></ol> 2. Microiniezione con un PIL-FucAl <ol><li> Preparare i piatti dopo l&#39;iniezione del protocollo riportato 7. </li><li> Trasferimento uova dechorionated in piatti pieni di iniezione medio embrione E3. </li><li> Preparare l&#39;ago, e caricare con 2 microlitri soluzione iniettabile. Questa soluzione contiene 20 mM PIL FucAl sintetizzato chemoenzymatically 8 e sia Alexa Fluor 594-destrano (5% w / v) come tracciante o rosso fenolo carico colorante (0,1% w / v) in 0,2 M KCl. Come controllo negativo, sostituire il PIL con un PIL-FucAl-fucosio in soluzione iniettabile. </li><li> Rompere l&#39;ago e regolare la pressione di iniezione e la durata per produrre un 1 goccia nL 9. </li><li> Iniettare le uova con 1 nL di entrambe le soluzioni. </li><li> Trasferire le uova in agarosio rivestite piastre di Petri riempite con terreno di embrione E3. </li><li> Incubare le uova a 28 ° C ed eliminare le uova non fecondate entro tre o quattro ore dopo la fecondazione. </li></ol> 3. BTTES-Cu (I)-catalizzata reazione chimica Clicca <ol><li> Quando gli embrioni raggiungono desiderato stadi di sviluppo (ad esempio gastrula tardiva, la segmentazione dei tessuti e larve presto), cappotto alla base di una piastra da 96 pozzetti con agarosio. </li><li> Aggiungere 92 microlitri di media embrione E3 in ogni pozzetto, seguita da aggiunta di 4 microlitri Alexa Fluor-488 azide (da uno stock 2,5 mm H 2 O), 2 microlitri BTTES-CuSO 4 6:01 complesso, e agitare delicatamente per miscelare. </li><li> Trasferimento degli embrioni nel pozzo contenente il reagente chimico clic utilizzando un incendio lucidato vetro pipetta Pasteur. Ogni bene deve contenere meno di cinque embrioni. </li><li> Aggiungere 2,5 microlitri ascorbato di sodio preparata (da uno stock di 100 mm H 2 O) per iniziare l&#39;attacco su 3. Concentrazione finale di ogni reagente: Alexa Fluor-488 azide: 100 mM; CuSO 4: 50 micron; BTTES: 300 mM; ascorbato di sodio: 2,5 mm. </li><li> Dopo 3 minuti, aggiungere 2 microlitri bathocuproine solfonato (50 mM magazzino in H 2 O), un chelante del rame biocompatibile, per placare la reazione poi diluire subito con 100 microlitri di media embrione E3. </li><li> Trasferire gli embrioni per un piatto di vetro di Petri e lavare gli embrioni trattati 2 volte con 15 ml di media embrione E3. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Mettere una goccia di bassissimo punto di fusione agarosio (1,2% (w / v) in un mezzo embrione E3) su un fondo di vetro piatto MatTek pozzetti, e posto un embrione nella goccia di agarosio. </li><li> Posizionare gli embrioni dorsalmente o lateralmente e posizionare il piatto in ghiaccio per 5 minuti a solidificare la goccia di agarosio. Aggiungi medio E3 embrione dolcemente verso il piatto fino a coprire il calo di agarosio. </li><li> Immagini di campo fluorescenza e luminose vengono acquisiti in sequenza usando un microscopio confocale. Tutte le immagini degli embrioni vengono acquisite utilizzando un intervallo di fase 5 micron. Figure compositi sono stati preparati utilizzando il software ImageJ. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati La figura 1 mostra il flusso di lavoro della nostra strategia in due fasi di etichettatura. La Figura 2 mostra l&#39;etichettatura di embrioni di zebrafish via BTTES-mediata CuAAC al 9,5 ore dopo la fecondazione (HPF). BTTES è un (triazolylmethyl) ammina tris a base di legante. Accelera CuAAC drammaticamente quando coordinamento con il Cu generato in situ (I), e promuove la reazione di cicloaddizione rapidamente nei sistemi viventi senza tossicità apparente. Subito dopo un 3-minuti di reazione su, siamo in grado di rilevare l&#39;etichettatura robusta degli embrioni trattati PIL FucAl (Figura 2, pannelli a sinistra). Fluorescenza di fondo è rilevato solo per gli embrioni di controllo microiniettati con il PIL-fucosio (Figura 2, pannelli a destra). <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La strategia di etichettatura glicani fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. In imaging in vivo di glicani fucosylated durante l&#39;embriogenesi zebrafish via BTTES-Cu (I)-chimica catalizzata clic. Unicellulare embrioni di zebrafish fase sono microiniettati con una singola dose del PIL-FucAl e ha permesso di sviluppoop a 9,5 HPF. Gli embrioni vengono poi reagito con Alexa Fluor 488-azide catalizzata da BTTES-Cu (I). Gli embrioni vengono esposte reagito usando la microscopia confocale. Intensità massima di z-proiezione immagini di Alexa Fluor 488 fluorescenza (pannello superiore); campo Bright (pannello inferiore). Scala grafica: 100 micron. Risoluzione dei problemi <table border="1"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Causa </td><td> Rimedio </td></tr><tr><td> Gli embrioni aspetto malsano </td><td> La soluzione microiniettati contiene contaminanti </td><td> La purezza degli zuccheri nucleotide deve essere superiore all&#39;85%. Controlla la tua fonte. </td></tr><tr><td> Non c&#39;è sull&#39;etichetta dopo la reazione </td><td> Concentrazione di rame è inferiore a 30 micron </td><td> Fare attenzione a non diluire la soluzione di reazione con l&#39;aggiunta di eccesso di media embrione E3 quando si aggiungono gli embrioni, come la velocità di reazione diminuisce in maniera significativa quando la concentrazione di rame è inferiore a 30 micron. </td></tr><tr><td> Gli embrioni muoiono dopo la reazione </td><td> Uso improprio degli embrioni </td><td> Assicurarsi che la pipetta è fuoco lucidato e il recipiente di reazione è rivestita con uno strato molto sottile di 0,5% di agarosio. </td></tr><tr><td> Le immagini appaiono spotty </td><td> I reagenti non sono propriamente mescolati prima di aggiungere gli embrioni </td><td> Seguire l&#39;ordine consigliato di aggiunta dei reagenti, e assicurarsi che i reagenti clicca chimica sono stati opportunamente miscelati prima di aggiungere gli embrioni. </td></tr><tr><td> Le immagini mostrano gli embrioni vengono danneggiati </td><td> Vigorosa agitazione danni degli embrioni durante la reazione </td><td> Agitare delicatamente per meno di 10 secondi una volta gli embrioni sono nella soluzione. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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	<li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+glycome.">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li><li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+click+chemistry:+Covalent+labeling+in+living+systems.">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li><li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+copper(I)+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans.">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li><li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars.">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li><li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish.">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li><li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis.">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives.">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map.">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<p class="jove_content"&gt; Imaging biomolecole<em&gt; In vivo</em&gt; Fornisce spunti critici della loro attività biologica nel loro ambiente naturale. In questo video, ci dimostrano come l&#39;etichettatura dei glicani fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish è realizzato da microinjecting unicellulare embrioni stadio con il PIL-FucAl e una seconda fase coniugazione fluoroforo attraverso BTTES-mediata CuAAC biocompatibile<sup&gt; 3</sup&gt;. Etichettatura robusta può essere raggiunto entro 2-3 minuti, e il glicani etich...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Di rame (II) solfato pentaidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 azide </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> destrano, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+)-L-ascorbato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic acido </td><td> Acros Organics </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Con fondo di vetro piatto micropozzetti </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

imaging glycans in zebrafish embryos by metabolic labeling and bioorthogonal click chemistry

Glicani di imaging in vivo è stato recentemente attivato utilizzando un bioorthogonal strategia giornalista chimica trattando cellule o degli organismi con monosaccaridi azide-o alchini-tag 1, 2. Il monosaccaridi modificato, elaborato dalla macchina biosintetica glicani, sono incorporati in glicoconiugati superficie cellulare. I tag bioorthogonal azide o alchini quindi consentire coniugazione covalente con sonde fluorescenti per la visualizzazione, oppure con sonde affinità per l&#39;arricchimento e l&#39;analisi glycoproteomic. Questo protocollo descrive le procedure normalmente utilizzate per l&#39;imaging non invasivo di glicani fucosylated in embrioni di zebrafish, tra cui: 1) microiniezione di una cella-embrioni stadio con un PIL-5-alkynylfucose (PIL-FucAl), 2) l&#39;etichettatura glicani fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish con azide coniugato fluorofori via Cu biocompatibile (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC), e 3) l&#39;imaging mediante microscopia confocale 3. Il metodo descritto qui può essere facilmente esteso ad altre classi di visualizzare glicani, glicani contenenti ad esempio acido sialico 4 e N-acetilgalattosamina 5, 6, in zebrafish di sviluppo e in altri organismi viventi.

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Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Un click-chimica metodo basato che permette la rapida, etichettatura non invasivo, e robusto di alchini-tagged glicani in embrioni di zebrafish è descritto. Glicani Fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish in fase di gastrulazione fine erano ripreso in questo studio.

Glicani Imaging in embrioni di zebrafish con marcatura metabolica e Chimica Clicca Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

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13.5K Views.  Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University. Un click-chimica metodo basato che permette la rapida, etichettatura non invasivo, e robusto di alchini-tagged glicani in embrioni di zebrafish è descritto. Glicani Fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish in fase di gastrulazione fine erano ripreso in questo studio.