Questo lavoro è stato sostenuto da fondi Midwestern University College of Health Sciences Research facilitazione sovvenzione concessa a EEH e Midwestern University Ufficio di Ricerca e Programmi sponsorizzati intramurale sovvenzione concessa a KJL.

Questo protocollo è conforme al benessere Principi AVMA animali per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dalla cura e l&#39;uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) a Midwestern University. 1. Preparazione di Anestesia, attrezzature, &amp; Media <ol><li> Declorurare circa 1,5 L di acqua di rubinetto per mezzo di un agente commerciale declorante (disponibile nei negozi di animali da compagnia) o il ristagno d&#39;acqua per 24 ore. Ottenere tre bicchieri 1 L e riempire ogni con 500 ml di acqua senza cloro. Etichettare una per tenere il pesce prima di qualsiasi procedura e uno per il recupero. Per il terzo bicchiere, aggiungere 100 mg / ml di tricaine methanesulfonate; questo diventa il becher nel quale verranno anestetizzati pesci. </li><li> Riempire un vassoio poco profondo con ghiaccio, riscaldare il terreno di coltura (RPMI 1640, il 10% FBS (siero fetale bovino), 50 mg / ml di gentamicina, 100 mg / ml kanamicina, 25 HEPES mM) a RT, e raccogliere pinzette pulito del gioielliere. Pinzette pulite di immercantare le punte in etanolo al 70% e passare attraverso un becco Bunsen, permettendo l&#39;etanolo a bruciare. </li><li> Decidere se la procedura sarà eseguita senza ingrandimento, con uno spot, tavolo illuminato lente di ingrandimento con 2 - 10X di ingrandimento, o dissezione microscopio (interamente dipendente preferenze personali). </li></ol> 2. Stabilire Culture Explant <ol><li> Prendere il numero desiderato di pesce e mettere in un bicchiere di partecipazione. Trasferire un singolo pesce al bicchiere anestesia; è meglio per anestetizzare il pesce individualmente. </li><li> Monitorare gli effetti dell&#39;anestesia osservando il nuoto e branchie movimento del pesce. Come anestesia progredisce, il movimento branchia rallenta e il pesce nuoterà in modo irregolare e spesso a testa in giù; considerare pesci anestetizzati, non appena il movimento branchia cessa. Non lasciare il pesce per periodi più lunghi nel bagno anestesia in quanto ciò potrebbe comportare la morte dei pesci. </li><li> Togliere il pesce dal bicchiere anestesia e trasferimentoin ghiaccio, mettendo il pesce orizzontalmente con la coda rivolta verso la mano che tiene le pinzette. Se sperimentato con la tecnica e se più pesci devono essere utilizzati per rendere espianti, è consigliabile inserire il pesce successivo nel becher anestesia in questo momento. </li><li> Per rimuovere squame, pinzette posizione parallela al pesce con punta a bordo della scala. Premere parte piatta delle pinzette leggermente sul lato del pesce a causare la scala di elevare dal corpo del pesce. Afferrare scala con le pinzette, cavalo, e il luogo (senza inversione) nel piatto di coltura di tessuti. Ripetere la procedura, la rimozione di un massimo di 12 scale di una grande per adulti (6 da ogni lato), evitando la regione gill, la linea laterale, e pinne. </li><li> Posizionare il pesce nel becher recupero e monitorare per assicurare che recupera dagli effetti dell&#39;anestesia. In questo momento, i pesci possono essere trasferiti di nuovo ad un serbatoio di individuo. Lasciare che il pesce di recuperare per almeno 21 giorni per consentire la completa rigenerazione scala. </li><li> A seconda delladisegno sperimentale, posizionare fino a 20 scale per 35 millimetri piatto di plastica coltura trattata con tessuti o 4-6 scale per vetro piatto fondo. Consentire scale di aderire al piatto prima di aggiungere delicatamente supporti in modo da non staccare scale dal piatto. NOTA: Con l&#39;esperienza, più pesci possono essere elaborati prima supporto viene aggiunto al primo piatto. </li><li> Aggiungere 1,2 ml di supporti completo (vedi 1.2 sopra) in ogni piatto da 35 mm. </li><li> Preferibilmente incubare culture espianto a 28 ° C in 5% di CO 2 per il periodo di tempo desiderato, con o senza ulteriori trattamenti. In alternativa, incubare le culture su un palco microscopio riscaldata o all&#39;interno di una camera di coltura cellulare dal vivo per la microscopia video. </li></ol> 3. Brightfield e Video Microscopy <ol><li> Piatti di posizione contenenti fogli cellulari sul palco microscopio e inizialmente messa a fuoco utilizzando la lente dell&#39;obiettivo 4X. NOTA: Higher ingrandimenti possono essere utilizzati, a seconda dell&#39;esperimento. Marcatura la posizione diogni foglio e / o l&#39;orientamento del piatto sulla scena cellule agevoleranno prendendo immagini nel tempo con i fogli in circa lo stesso orientamento. </li><li> Rimuovere piatti della incubatore e la fotografia in vari momenti, secondo ogni protocollo sperimentale e mettere di nuovo nel incubatore se sono necessari solo immagini fisse nel periodo di tempo sperimentale. </li><li> Durante l&#39;esecuzione di microscopia video, prestare attenzione a quanto segue: <ol><li> Posizionare il / emergente strato cellulare scala all&#39;interno del campo visivo tale che il foglio cellule migrazione rimane nel campo di vista per la durata del video. NOTA: Questo potrebbe richiedere una certa esperienza nell&#39;osservare come le cellule migrano da sotto la scala. Per brevi video, questo è meno di una preoccupazione che per video più lunghi. </li><li> Per tempi più brevi, incubare a RT. Per tempi più lunghi (18+ HR), utilizzare un palcoscenico riscaldata o una camera di incubazione per mantenere la temperatura, l&#39;equilibrio del pH, e per ridurre al minimo l&#39;evaporazione della cultura medium. </li></ol></li></ol> 4. Fissazione per immunofluorescenza microscopia <ol><li> Preparare e pre-caldo tutte le soluzioni a 28 ° C. Per visualizzare cheratociti in fluorescenza, crescere culture espianto come sopra descritto con 35 millimetri piatti con fondo di vetro colture di tessuti. In alternativa, utilizzare le diapositive da camera di vetro. </li><li> Aggiungere 0,8 ml di paraformaldeide al 4% in PBS 1.1x ad ogni piatto. Non rimuovere il terreno di coltura prima. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione. </li><li> Aggiungere 0,8 ml di paraformaldeide al 4% in PBS 1.1x ad ogni piatto. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione. </li><li> Salvo usando ligandi esterni o epitopi esterni, cellule permeabilize aggiungendo 0,5 ml di 0,2% Triton X-100 in PBS 1X. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di 1% BSA in PBS 1x e incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C). NOTA: A seconda delle condizioni sperimentali, phalloidin può essere aggiunto in questa fase. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aspirare per rimuovere la soluzione e procedere con l&#39;anticorpo colorazione. In alternativa, memorizzare i piatti di coltura aggiungendo almeno 1 - 2 ml di 1% BSA in PBS 1x per 3 - 4 settimane a 4 ° C. </li></ol> 5. immunofluorescenza protocollo <ol><li> Preparare le soluzioni di anticorpi primari e secondari secondo le raccomandazioni del costruttore. NOTA: Se le raccomandazioni del produttore non sono disponibili, una buona diluizione iniziale di anticorpi primari (in 1% BSA in 1x PBS) è di 1: 500 per policlonali e 1: 1.000 per gli anticorpi monoclonali; una buona partenza per la diluizione degli anticorpi secondari è 1: 1.000. Regolare questi diluizioni del ceppo originario da parte del produttore più alto se il segnale è debole, più basso se il segnale è forte e lo sfondo è un problema. </li><li> Aspirare il BSA 1% in soluzione 1x PBS. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di anticorpo primario e incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C). </li&gt; <li> Rimuovere la soluzione di anticorpo primario, inserire in un ambiente pulito ed etichettato 1,5 ml provetta, e congelare a -20 ° C. NOTA: Questo permette il riutilizzo dell&#39;anticorpo primario, se necessario. </li><li> Lavare il piatto 3 - 5 volte con 1x PBS, la rimozione e scartando il PBS dopo ogni lavaggio. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di soluzione di anticorpo secondario. Se lo si desidera, aggiungere falloidina fluorescenza marcata (seguito concentrazione raccomandata di qualsiasi produttore) durante questa fase. Incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C). NOTA: L&#39;uso di falloidina fluorescenza marcata permette la visualizzazione di filamenti di actina; abbiamo scoperto che falloidina 488 marcato funziona meglio nelle nostre cheratociti zebrafish, ma altri fluorofori possono essere utilizzati. </li><li> Rimuovere e scartare la soluzione di anticorpo secondario. </li><li> Lavare il piatto 3 - 5 volte con 1x PBS, la rimozione e scartando il PBS dopo ogni lavaggio. NOTA: Il piatto può essere memorizzato, coperto dalla luce, a 4 ° C se non è possibile view immediatamente; assicurarsi 1x PBS viene aggiunto nel piatto prima della conservazione per assicurare le cellule non si seccano ma caldo a RT (20 - 30 min), quindi rimuovere il PBS appena prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Al momento di osservare, aggiungere 2 - 3 gocce di un mezzo di montaggio, con o senza DAPI, a seconda delle esigenze sperimentali, nel piatto e lasciate riposare per 10 minuti a RT. NOTA: Usiamo un mezzo di montaggio disponibile in commercio a base di glicerolo-con DAPI, ma altri mezzi di fissaggio possono essere utilizzati. Consentendo 10 min per il mezzo di montaggio per sedersi nel piatto consente una facile rimozione del vetrino di vetro dal fondo del recipiente. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, premere delicatamente ai lati del piatto per allentare e rimuovere il vetrino. Aggiungere un ulteriore calo dei mezzi di montaggio su un vetrino e porre il vetrino, celle in basso, sul vetrino. NOTA: Considerare tenuta il vetrino alla diapositiva con chiara unghia polacco se la diapositiva deve essere mantenuto per più di 1 - 2 giorni. </li><li> Osservare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza. NOTA: La maggior parte delle nostre immagini sono state scattate con una lente obiettivo 40X o 63X in olio da immersione, ma l &#39;obiettivo specifico utilizzato dipende dal protocollo sperimentale. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li><li>Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+zebrafish,+Danio+rerio+(cyprinidae),+using+scale+regeneration.">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+skin,+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses.">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La fase più critica per il successo della cultura keratocyte espianto sta permettendo la scala di aderire al piatto di coltura per circa 2 - 3 minuti prima dell&#39;aggiunta del terreno di coltura. Circa il 75% di scale aderire e crescere fogli (il numero di culture stabiliti per ogni esperimento dovrà essere adeguato di conseguenza). Fogli Keratocyte non formano intorno ad ogni scala rimosso dal pesce e messo in coltura per diversi motivi. In primo luogo, DAPI colorazione di espianti rivela che alcune scale hanno poc...

<html> Studi di motilità cellulare si sono tradizionalmente concentrati sulle cellule migrano individualmente. Cheratociti coltivate dai pesci e anfibi espianti hanno dimostrato di essere un sistema potente modello per studiare i meccanismi di motilità cellulare utilizzando la modellazione sia sperimentale e matematica approcci 1-6. Il lavoro sperimentale sulle cellule migrano singolarmente è aiutata dal rapido movimento scorrevolezza delle cellule, mantenendo uniforme forma, velocità e direzione. Tuttavia, in vivo, le cellule si muovono spesso insieme pur mantenendo giunzioni cellula-cellula, in particolare durante l&#39;embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi. Così, la migrazione cellulare collettiva è un settore in crescita e sempre più importante della ricerca nel campo della migrazione delle cellule. La migrazione collettiva di queste cellule è stata recentemente descritta 7 ed ha molte caratteristiche uniche che lo rendono un potente sistema per studiare la migrazione delle cellule collettiva in un modello di guarigione delle ferite. ove_content &quot;&gt; Quando le scale vengono pizzicate da un zebrafish adulto anestetizzato, alcuni tessuti epiteliali rimane attaccato alla parte inferiore della scala. Quando si aggiunge mezzo di coltura cellulare, queste cellule epiteliali, o cheratociti, migrano rapidamente come unità collettiva dalla scala. Il Espianto può essere visto come un modello di guarigione delle ferite epiteliale, in cui le cellule migrano dalla espianto come farebbero nella matrice provvisoria del letto della ferita per ristabilire un epitelio intatto. Dati recenti suggeriscono che questa coltura ex vivo imita molte caratteristiche di in vivo la guarigione delle ferite in zebrafish adulto. tassi chiusura della ferita 8 si traducono in una velocità di migrazione simile a quello osservato nella ex vivo sistema 7. Inoltre, in una ferita in vivo guarigione del modello, il trattamento con warfarin suggerisce che l&#39;emostasi non ha alcun effetto sul tasso di di guarigione, mentre il trattamento con idrocortisone per diminuire la risposta immunitaria non ritardare riepitelizzazione 8 </sup&gt;. Come il pesce zebra non sanguina quando la bilancia è rimosso dall&#39;animale, emostasi non è un giocatore importante. Anche se abbiamo trovato cellule immunitarie in espianti, non abbiamo studiato gli effetti che potrebbero avere sulla migrazione cellulare collettiva. Il protocollo presentato qui descritto come stabilire le culture zebrafish keratocyte espianto a garantire la coerenza e riproducibilità per l&#39;uso in molti saggi biologici. Queste culture espianto sono particolarmente convincenti modello in vitro per la migrazione delle cellule collettivo per diversi motivi. In primo luogo, cheratociti zebrafish sono pile utilizzate entro ore di stabilire culture espianto. Pertanto, queste cellule non hanno subito i cambiamenti morfologici e espressione genica associati con passaggio di cellule primarie 9-13. In secondo luogo, questo sistema rappresenta un modello per lo studio di riepitelizzazione in risposta al ferimento 14 e, come parte della risposta al ferimento, un epiteliale al mesenchimale transition processo (EMT) è iniziata come evidenziato da cambiamenti nell&#39;espressione genica e riarrangiamenti del citoscheletro 14,15. Così, lo sfondo cambiamenti nell&#39;espressione genica e motilità che si verificano in cellule non trattate sono stati caratterizzati e fornire un contesto per interpretare modifiche con trattamento. Inoltre, il pesce e la keratocyte cheratinociti umani sono funzionalmente equivalenti; entrambi sono le cellule epiteliali primarie dei rispettivi specie e svolgono un ruolo chiave nella epiteliale guarigione della ferita. In terzo luogo, zebrafish adulto stanno guadagnando il riconoscimento come sistema modello per una varietà di malattie umane 16-18 tra cui il melanoma e altri tumori 19-21, ferita cutanea guarigione 8,14 e Rigenerazione Tissutale 22-24. I vantaggi tecnici di questo modello di sistema sono altrettanto convincenti. Un numero crescente di linee mutanti e transgeniche sono disponibili dal non-profit, servizi centralizzati. In particolare, la mutazione progetto Zebrafish (ZMP) Presso il Wellcome Trust Sanger Institute mira a creare un allele knockout in ogni proteina gene nel genoma zebrafish. Attualmente, hanno mutato 11.892 geni, circa il 45% del genoma, con 24.088 alleli caratterizzati. Inoltre, ZMP accetta proposte e genererà knock-out gratuitamente. Metodi Recenti gene atterramento in larvale e adulto zebrafish 25-28 forniscono la flessibilità per studiare la funzione dei geni evolutivamente importanti per i quali approcci transgenici sono problematici o impraticabili. Grazie alla loro estremamente rapidi tassi di motilità di ~ 145 micron / h poco dopo creazione di culture 29, analisi possono essere completate rapidamente (di solito in 24 ore o meno). Come esperimenti possono essere concluse rapidamente e culture crescono bene a temperatura ambiente, molti degli ostacoli tecnici associati sono evitati mammiferi test di migrazione delle cellule che coinvolgono microscopio video. Inoltre, in età di serraggio bilanci di ricerca, zebrafish è facile ed economico mantenuto. La struttura e il comportamento del trapianto è complessa. Come il pesce non sanguinano quando la scala viene rimosso, è improbabile che molto più strati epidermici superficiali vengono rimossi con la scala. Cheratociti sembrano essere il tipo cellulare predominante nel espianto quando squame sono inizialmente rimossi dal pesce come la stragrande maggioranza delle cellule sembra macchiare con un anticorpo anti-E-caderina 14. Inoltre, non vi è alcuna prova di fibroblasti in coltura iniziale come giudicato dalla mancanza di vimentina colorazione mediante immunofluorescenza 14. Tuttavia, con la rimozione ripetuta scala, sembra che vi siano numerosi neutrofili nel espianto (vedi Video 1). Abbiamo identificato queste cellule come neutrofili basati su osservazioni morfologiche delle loro dimensioni, rapidamente motilità e la loro migrazione fuori dello strato di cellule quando esposto a LPS (dati non mostrati). Inoltre, queste cellule si colorano vivacemente with un anticorpo di neutrofili fattore citosolico e con una varietà di anticorpi secondari IgG, che indica che essi hanno FCRS abbondanti sulla loro superficie (dati non mostrati). Strati di cellule multiple sono presenti all&#39;interno del espianto. Microscopia confocale rivela la presenza di un solo strato vicino al bordo superiore per più di due strati di cheratinociti vicino scala con neutrofili visibili sopra, sotto, e tra i fogli keratocyte cellulare. A momenti iniziali, le cellule sul bordo del multi-layer espianto polarizzare, avviando la migrazione collettiva del cheratociti dalla espianto a tassi iniziali di ~ 145 micron / hr. L&#39;area coperta dal espianto aumenta rapidamente, portando a cellule diffusione, la tensione all&#39;interno del foglio, e un tasso ridotto di avanzamento del bordo d&#39;attacco. Interconversioni rapidi tra le cellule capo e follower si osservano sul bordo di entrata durante la formazione e la chiusura di fori spontaneamente costituiti all&#39;interno del foglio 7. ComeProcesso di EMT avviato con l&#39;espianto continua, i frammenti fogli e le cheratociti perdono la loro specializzazione, rapida motilità. Espressione genica e cambiamenti morfologici coerenti con EMT, la guarigione delle ferite, e le risposte infiammatorie si verificano entro 7 giorni di coltura con espianti presi in considerazione valida per circa 10 giorni 14.

<table><tbody><tr><td>35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area.</td></tr><tr><td>Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td><td>VWR</td><td>21909-460</td><td>We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.</td></tr></tbody></table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

Grazie alle loro proprietà uniche motilità, cheratociti pesce dissociate da sono da tempo utilizzati culture espianto per studiare i meccanismi della migrazione singola cellula. Tuttavia, quando si stabiliscono espianti, queste cellule si muovono anche collettivamente, mantenendo molte delle caratteristiche che rendono individuo cheratociti un modello interessante per lo studio della migrazione: rapidi tassi di motilità, vasta lamelle ricco di actina con un cavo actina perpendicolari, e di velocità relativamente costante e direzione di migrazione. Nei primi espianti, la rapida interconversione di cellule migranti singolarmente con quelli migrazione collettivamente consente di studiare il ruolo di adesioni cellula-cellula nel determinare la modalità di migrazione e sottolinea i legami molecolari tra le due modalità di migrazione. Le cellule in espianti successivi perdono la loro capacità di migrare rapidamente e collettivamente come la transizione epitelio mesenchimale verifica e geni associati con la guarigione della ferita e l&#39;infiammazione sono espressi in modo differenziale. Così, espianti keratocyte possono servire come modello in vitro per la riepitelizzazione cutanea che si verifica durante la guarigione della ferita e può rappresentare un sistema unico per studiare i meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di un programma definito di cambiamenti di espressione genica. Una varietà di linee di zebrafish mutanti e transgeniche sono disponibili, che consente di espianti di stabilire da pesce con diversi background genetico. Questo permette il ruolo di proteine ​​diverse all&#39;interno di questi processi da affrontare univoco. I protocolli descritti qui descrivono un metodo semplice ed efficace per stabilire queste culture espianto per l&#39;uso in una varietà di saggi legati alla migrazione cellulare collettiva.

Come illustrato in figura 1, fogli di cheratinociti possono essere osservati migrare da sotto la scala poche ore istituisce cultura espianto. Di tanto in tanto, un keratocyte migrazione personalizzato che si è staccato dal foglio collettivamente la migrazione può essere osservato. Inoltre, come è stato stabilito l&#39;espianto da un pesce precedentemente pizzicate, ci sono abbondanti neutrofili migrano attraverso il foglio. Nei periodi più lunghi di cultura, i frammenti foglio keratocyte le cellule ...

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Cheratociti zebrafish migrano in lastre alveolari da espianti e forniscono un modello in vitro per lo studio dei meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di epiteliale guarigione della ferita. Questi protocolli dettaglio un modo efficace per stabilire le culture espianto primarie per l&#39;uso in test di migrazione cellulare collettiva.

Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Views.  Midwestern University.  Cheratociti zebrafish migrano in lastre alveolari da espianti e forniscono un modello in vitro per lo studio dei meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di epiteliale guarigione della ferita. Questi protocolli dettaglio un modo efficace per stabilire le culture espianto primarie per l'uso in test di migrazione cellulare collettiva. 

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanical Injury Vessel in embrioni di zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Istituzione di un clinicamente rilevanti<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock chirurgia della cataratta modello per indagare epiteliale Wound Repair in un microambiente Native

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Dispositivo di Imaging dal vivo a lungo termine per una migliore manipolazione sperimentale delle larve di Zebrafish

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Bioingegneria

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Robusto trapianto di cellule di pesce zebra per la ricerca sulla rigenerazione e lo sviluppo

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Mappatura della connettività cellulare nel sistema nervoso del pesce zebra durante lo sviluppo e la rigenerazione

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Mechanical Injury Vessel in embrioni di zebrafish

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

L'utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

Istituzione di un clinicamente rilevanti

Dispositivo di Imaging dal vivo a lungo termine per una migliore manipolazione sperimentale delle larve di Zebrafish

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale