Questo lavoro è stato sostenuto da fondi Midwestern University College of Health Sciences Research facilitazione sovvenzione concessa a EEH e Midwestern University Ufficio di Ricerca e Programmi sponsorizzati intramurale sovvenzione concessa a KJL.

Questo protocollo è conforme al benessere Principi AVMA animali per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dalla cura e l&#39;uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) a Midwestern University. 1. Preparazione di Anestesia, attrezzature, &amp; Media <ol><li> Declorurare circa 1,5 L di acqua di rubinetto per mezzo di un agente commerciale declorante (disponibile nei negozi di animali da compagnia) o il ristagno d&#39;acqua per 24 ore. Ottenere tre bicchieri 1 L e riempire ogni con 500 ml di acqua senza cloro. Etichettare una per tenere il pesce prima di qualsiasi procedura e uno per il recupero. Per il terzo bicchiere, aggiungere 100 mg / ml di tricaine methanesulfonate; questo diventa il becher nel quale verranno anestetizzati pesci. </li><li> Riempire un vassoio poco profondo con ghiaccio, riscaldare il terreno di coltura (RPMI 1640, il 10% FBS (siero fetale bovino), 50 mg / ml di gentamicina, 100 mg / ml kanamicina, 25 HEPES mM) a RT, e raccogliere pinzette pulito del gioielliere. Pinzette pulite di immercantare le punte in etanolo al 70% e passare attraverso un becco Bunsen, permettendo l&#39;etanolo a bruciare. </li><li> Decidere se la procedura sarà eseguita senza ingrandimento, con uno spot, tavolo illuminato lente di ingrandimento con 2 - 10X di ingrandimento, o dissezione microscopio (interamente dipendente preferenze personali). </li></ol> 2. Stabilire Culture Explant <ol><li> Prendere il numero desiderato di pesce e mettere in un bicchiere di partecipazione. Trasferire un singolo pesce al bicchiere anestesia; è meglio per anestetizzare il pesce individualmente. </li><li> Monitorare gli effetti dell&#39;anestesia osservando il nuoto e branchie movimento del pesce. Come anestesia progredisce, il movimento branchia rallenta e il pesce nuoterà in modo irregolare e spesso a testa in giù; considerare pesci anestetizzati, non appena il movimento branchia cessa. Non lasciare il pesce per periodi più lunghi nel bagno anestesia in quanto ciò potrebbe comportare la morte dei pesci. </li><li> Togliere il pesce dal bicchiere anestesia e trasferimentoin ghiaccio, mettendo il pesce orizzontalmente con la coda rivolta verso la mano che tiene le pinzette. Se sperimentato con la tecnica e se più pesci devono essere utilizzati per rendere espianti, è consigliabile inserire il pesce successivo nel becher anestesia in questo momento. </li><li> Per rimuovere squame, pinzette posizione parallela al pesce con punta a bordo della scala. Premere parte piatta delle pinzette leggermente sul lato del pesce a causare la scala di elevare dal corpo del pesce. Afferrare scala con le pinzette, cavalo, e il luogo (senza inversione) nel piatto di coltura di tessuti. Ripetere la procedura, la rimozione di un massimo di 12 scale di una grande per adulti (6 da ogni lato), evitando la regione gill, la linea laterale, e pinne. </li><li> Posizionare il pesce nel becher recupero e monitorare per assicurare che recupera dagli effetti dell&#39;anestesia. In questo momento, i pesci possono essere trasferiti di nuovo ad un serbatoio di individuo. Lasciare che il pesce di recuperare per almeno 21 giorni per consentire la completa rigenerazione scala. </li><li> A seconda delladisegno sperimentale, posizionare fino a 20 scale per 35 millimetri piatto di plastica coltura trattata con tessuti o 4-6 scale per vetro piatto fondo. Consentire scale di aderire al piatto prima di aggiungere delicatamente supporti in modo da non staccare scale dal piatto. NOTA: Con l&#39;esperienza, più pesci possono essere elaborati prima supporto viene aggiunto al primo piatto. </li><li> Aggiungere 1,2 ml di supporti completo (vedi 1.2 sopra) in ogni piatto da 35 mm. </li><li> Preferibilmente incubare culture espianto a 28 ° C in 5% di CO 2 per il periodo di tempo desiderato, con o senza ulteriori trattamenti. In alternativa, incubare le culture su un palco microscopio riscaldata o all&#39;interno di una camera di coltura cellulare dal vivo per la microscopia video. </li></ol> 3. Brightfield e Video Microscopy <ol><li> Piatti di posizione contenenti fogli cellulari sul palco microscopio e inizialmente messa a fuoco utilizzando la lente dell&#39;obiettivo 4X. NOTA: Higher ingrandimenti possono essere utilizzati, a seconda dell&#39;esperimento. Marcatura la posizione diogni foglio e / o l&#39;orientamento del piatto sulla scena cellule agevoleranno prendendo immagini nel tempo con i fogli in circa lo stesso orientamento. </li><li> Rimuovere piatti della incubatore e la fotografia in vari momenti, secondo ogni protocollo sperimentale e mettere di nuovo nel incubatore se sono necessari solo immagini fisse nel periodo di tempo sperimentale. </li><li> Durante l&#39;esecuzione di microscopia video, prestare attenzione a quanto segue: <ol><li> Posizionare il / emergente strato cellulare scala all&#39;interno del campo visivo tale che il foglio cellule migrazione rimane nel campo di vista per la durata del video. NOTA: Questo potrebbe richiedere una certa esperienza nell&#39;osservare come le cellule migrano da sotto la scala. Per brevi video, questo è meno di una preoccupazione che per video più lunghi. </li><li> Per tempi più brevi, incubare a RT. Per tempi più lunghi (18+ HR), utilizzare un palcoscenico riscaldata o una camera di incubazione per mantenere la temperatura, l&#39;equilibrio del pH, e per ridurre al minimo l&#39;evaporazione della cultura medium. </li></ol></li></ol> 4. Fissazione per immunofluorescenza microscopia <ol><li> Preparare e pre-caldo tutte le soluzioni a 28 ° C. Per visualizzare cheratociti in fluorescenza, crescere culture espianto come sopra descritto con 35 millimetri piatti con fondo di vetro colture di tessuti. In alternativa, utilizzare le diapositive da camera di vetro. </li><li> Aggiungere 0,8 ml di paraformaldeide al 4% in PBS 1.1x ad ogni piatto. Non rimuovere il terreno di coltura prima. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione. </li><li> Aggiungere 0,8 ml di paraformaldeide al 4% in PBS 1.1x ad ogni piatto. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione. </li><li> Salvo usando ligandi esterni o epitopi esterni, cellule permeabilize aggiungendo 0,5 ml di 0,2% Triton X-100 in PBS 1X. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti quindi aspirare per rimuovere la soluzione. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di 1% BSA in PBS 1x e incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C). NOTA: A seconda delle condizioni sperimentali, phalloidin può essere aggiunto in questa fase. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aspirare per rimuovere la soluzione e procedere con l&#39;anticorpo colorazione. In alternativa, memorizzare i piatti di coltura aggiungendo almeno 1 - 2 ml di 1% BSA in PBS 1x per 3 - 4 settimane a 4 ° C. </li></ol> 5. immunofluorescenza protocollo <ol><li> Preparare le soluzioni di anticorpi primari e secondari secondo le raccomandazioni del costruttore. NOTA: Se le raccomandazioni del produttore non sono disponibili, una buona diluizione iniziale di anticorpi primari (in 1% BSA in 1x PBS) è di 1: 500 per policlonali e 1: 1.000 per gli anticorpi monoclonali; una buona partenza per la diluizione degli anticorpi secondari è 1: 1.000. Regolare questi diluizioni del ceppo originario da parte del produttore più alto se il segnale è debole, più basso se il segnale è forte e lo sfondo è un problema. </li><li> Aspirare il BSA 1% in soluzione 1x PBS. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di anticorpo primario e incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C). </li&gt; <li> Rimuovere la soluzione di anticorpo primario, inserire in un ambiente pulito ed etichettato 1,5 ml provetta, e congelare a -20 ° C. NOTA: Questo permette il riutilizzo dell&#39;anticorpo primario, se necessario. </li><li> Lavare il piatto 3 - 5 volte con 1x PBS, la rimozione e scartando il PBS dopo ogni lavaggio. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di soluzione di anticorpo secondario. Se lo si desidera, aggiungere falloidina fluorescenza marcata (seguito concentrazione raccomandata di qualsiasi produttore) durante questa fase. Incubare per 1 ora (a RT) o O / N (a 4 ° C). NOTA: L&#39;uso di falloidina fluorescenza marcata permette la visualizzazione di filamenti di actina; abbiamo scoperto che falloidina 488 marcato funziona meglio nelle nostre cheratociti zebrafish, ma altri fluorofori possono essere utilizzati. </li><li> Rimuovere e scartare la soluzione di anticorpo secondario. </li><li> Lavare il piatto 3 - 5 volte con 1x PBS, la rimozione e scartando il PBS dopo ogni lavaggio. NOTA: Il piatto può essere memorizzato, coperto dalla luce, a 4 ° C se non è possibile view immediatamente; assicurarsi 1x PBS viene aggiunto nel piatto prima della conservazione per assicurare le cellule non si seccano ma caldo a RT (20 - 30 min), quindi rimuovere il PBS appena prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Al momento di osservare, aggiungere 2 - 3 gocce di un mezzo di montaggio, con o senza DAPI, a seconda delle esigenze sperimentali, nel piatto e lasciate riposare per 10 minuti a RT. NOTA: Usiamo un mezzo di montaggio disponibile in commercio a base di glicerolo-con DAPI, ma altri mezzi di fissaggio possono essere utilizzati. Consentendo 10 min per il mezzo di montaggio per sedersi nel piatto consente una facile rimozione del vetrino di vetro dal fondo del recipiente. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, premere delicatamente ai lati del piatto per allentare e rimuovere il vetrino. Aggiungere un ulteriore calo dei mezzi di montaggio su un vetrino e porre il vetrino, celle in basso, sul vetrino. NOTA: Considerare tenuta il vetrino alla diapositiva con chiara unghia polacco se la diapositiva deve essere mantenuto per più di 1 - 2 giorni. </li><li> Osservare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza. NOTA: La maggior parte delle nostre immagini sono state scattate con una lente obiettivo 40X o 63X in olio da immersione, ma l &#39;obiettivo specifico utilizzato dipende dal protocollo sperimentale. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La fase più critica per il successo della cultura keratocyte espianto sta permettendo la scala di aderire al piatto di coltura per circa 2 - 3 minuti prima dell&#39;aggiunta del terreno di coltura. Circa il 75% di scale aderire e crescere fogli (il numero di culture stabiliti per ogni esperimento dovrà essere adeguato di conseguenza). Fogli Keratocyte non formano intorno ad ogni scala rimosso dal pesce e messo in coltura per diversi motivi. In primo luogo, DAPI colorazione di espianti rivela che alcune scale hanno poc...

<html> Studi di motilità cellulare si sono tradizionalmente concentrati sulle cellule migrano individualmente. Cheratociti coltivate dai pesci e anfibi espianti hanno dimostrato di essere un sistema potente modello per studiare i meccanismi di motilità cellulare utilizzando la modellazione sia sperimentale e matematica approcci 1-6. Il lavoro sperimentale sulle cellule migrano singolarmente è aiutata dal rapido movimento scorrevolezza delle cellule, mantenendo uniforme forma, velocità e direzione. Tuttavia, in vivo, le cellule si muovono spesso insieme pur mantenendo giunzioni cellula-cellula, in particolare durante l&#39;embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi. Così, la migrazione cellulare collettiva è un settore in crescita e sempre più importante della ricerca nel campo della migrazione delle cellule. La migrazione collettiva di queste cellule è stata recentemente descritta 7 ed ha molte caratteristiche uniche che lo rendono un potente sistema per studiare la migrazione delle cellule collettiva in un modello di guarigione delle ferite. ove_content &quot;&gt; Quando le scale vengono pizzicate da un zebrafish adulto anestetizzato, alcuni tessuti epiteliali rimane attaccato alla parte inferiore della scala. Quando si aggiunge mezzo di coltura cellulare, queste cellule epiteliali, o cheratociti, migrano rapidamente come unità collettiva dalla scala. Il Espianto può essere visto come un modello di guarigione delle ferite epiteliale, in cui le cellule migrano dalla espianto come farebbero nella matrice provvisoria del letto della ferita per ristabilire un epitelio intatto. Dati recenti suggeriscono che questa coltura ex vivo imita molte caratteristiche di in vivo la guarigione delle ferite in zebrafish adulto. tassi chiusura della ferita 8 si traducono in una velocità di migrazione simile a quello osservato nella ex vivo sistema 7. Inoltre, in una ferita in vivo guarigione del modello, il trattamento con warfarin suggerisce che l&#39;emostasi non ha alcun effetto sul tasso di di guarigione, mentre il trattamento con idrocortisone per diminuire la risposta immunitaria non ritardare riepitelizzazione 8 </sup&gt;. Come il pesce zebra non sanguina quando la bilancia è rimosso dall&#39;animale, emostasi non è un giocatore importante. Anche se abbiamo trovato cellule immunitarie in espianti, non abbiamo studiato gli effetti che potrebbero avere sulla migrazione cellulare collettiva. Il protocollo presentato qui descritto come stabilire le culture zebrafish keratocyte espianto a garantire la coerenza e riproducibilità per l&#39;uso in molti saggi biologici. Queste culture espianto sono particolarmente convincenti modello in vitro per la migrazione delle cellule collettivo per diversi motivi. In primo luogo, cheratociti zebrafish sono pile utilizzate entro ore di stabilire culture espianto. Pertanto, queste cellule non hanno subito i cambiamenti morfologici e espressione genica associati con passaggio di cellule primarie 9-13. In secondo luogo, questo sistema rappresenta un modello per lo studio di riepitelizzazione in risposta al ferimento 14 e, come parte della risposta al ferimento, un epiteliale al mesenchimale transition processo (EMT) è iniziata come evidenziato da cambiamenti nell&#39;espressione genica e riarrangiamenti del citoscheletro 14,15. Così, lo sfondo cambiamenti nell&#39;espressione genica e motilità che si verificano in cellule non trattate sono stati caratterizzati e fornire un contesto per interpretare modifiche con trattamento. Inoltre, il pesce e la keratocyte cheratinociti umani sono funzionalmente equivalenti; entrambi sono le cellule epiteliali primarie dei rispettivi specie e svolgono un ruolo chiave nella epiteliale guarigione della ferita. In terzo luogo, zebrafish adulto stanno guadagnando il riconoscimento come sistema modello per una varietà di malattie umane 16-18 tra cui il melanoma e altri tumori 19-21, ferita cutanea guarigione 8,14 e Rigenerazione Tissutale 22-24. I vantaggi tecnici di questo modello di sistema sono altrettanto convincenti. Un numero crescente di linee mutanti e transgeniche sono disponibili dal non-profit, servizi centralizzati. In particolare, la mutazione progetto Zebrafish (ZMP) Presso il Wellcome Trust Sanger Institute mira a creare un allele knockout in ogni proteina gene nel genoma zebrafish. Attualmente, hanno mutato 11.892 geni, circa il 45% del genoma, con 24.088 alleli caratterizzati. Inoltre, ZMP accetta proposte e genererà knock-out gratuitamente. Metodi Recenti gene atterramento in larvale e adulto zebrafish 25-28 forniscono la flessibilità per studiare la funzione dei geni evolutivamente importanti per i quali approcci transgenici sono problematici o impraticabili. Grazie alla loro estremamente rapidi tassi di motilità di ~ 145 micron / h poco dopo creazione di culture 29, analisi possono essere completate rapidamente (di solito in 24 ore o meno). Come esperimenti possono essere concluse rapidamente e culture crescono bene a temperatura ambiente, molti degli ostacoli tecnici associati sono evitati mammiferi test di migrazione delle cellule che coinvolgono microscopio video. Inoltre, in età di serraggio bilanci di ricerca, zebrafish è facile ed economico mantenuto. La struttura e il comportamento del trapianto è complessa. Come il pesce non sanguinano quando la scala viene rimosso, è improbabile che molto più strati epidermici superficiali vengono rimossi con la scala. Cheratociti sembrano essere il tipo cellulare predominante nel espianto quando squame sono inizialmente rimossi dal pesce come la stragrande maggioranza delle cellule sembra macchiare con un anticorpo anti-E-caderina 14. Inoltre, non vi è alcuna prova di fibroblasti in coltura iniziale come giudicato dalla mancanza di vimentina colorazione mediante immunofluorescenza 14. Tuttavia, con la rimozione ripetuta scala, sembra che vi siano numerosi neutrofili nel espianto (vedi Video 1). Abbiamo identificato queste cellule come neutrofili basati su osservazioni morfologiche delle loro dimensioni, rapidamente motilità e la loro migrazione fuori dello strato di cellule quando esposto a LPS (dati non mostrati). Inoltre, queste cellule si colorano vivacemente with un anticorpo di neutrofili fattore citosolico e con una varietà di anticorpi secondari IgG, che indica che essi hanno FCRS abbondanti sulla loro superficie (dati non mostrati). Strati di cellule multiple sono presenti all&#39;interno del espianto. Microscopia confocale rivela la presenza di un solo strato vicino al bordo superiore per più di due strati di cheratinociti vicino scala con neutrofili visibili sopra, sotto, e tra i fogli keratocyte cellulare. A momenti iniziali, le cellule sul bordo del multi-layer espianto polarizzare, avviando la migrazione collettiva del cheratociti dalla espianto a tassi iniziali di ~ 145 micron / hr. L&#39;area coperta dal espianto aumenta rapidamente, portando a cellule diffusione, la tensione all&#39;interno del foglio, e un tasso ridotto di avanzamento del bordo d&#39;attacco. Interconversioni rapidi tra le cellule capo e follower si osservano sul bordo di entrata durante la formazione e la chiusura di fori spontaneamente costituiti all&#39;interno del foglio 7. ComeProcesso di EMT avviato con l&#39;espianto continua, i frammenti fogli e le cheratociti perdono la loro specializzazione, rapida motilità. Espressione genica e cambiamenti morfologici coerenti con EMT, la guarigione delle ferite, e le risposte infiammatorie si verificano entro 7 giorni di coltura con espianti presi in considerazione valida per circa 10 giorni 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

Grazie alle loro proprietà uniche motilità, cheratociti pesce dissociate da sono da tempo utilizzati culture espianto per studiare i meccanismi della migrazione singola cellula. Tuttavia, quando si stabiliscono espianti, queste cellule si muovono anche collettivamente, mantenendo molte delle caratteristiche che rendono individuo cheratociti un modello interessante per lo studio della migrazione: rapidi tassi di motilità, vasta lamelle ricco di actina con un cavo actina perpendicolari, e di velocità relativamente costante e direzione di migrazione. Nei primi espianti, la rapida interconversione di cellule migranti singolarmente con quelli migrazione collettivamente consente di studiare il ruolo di adesioni cellula-cellula nel determinare la modalità di migrazione e sottolinea i legami molecolari tra le due modalità di migrazione. Le cellule in espianti successivi perdono la loro capacità di migrare rapidamente e collettivamente come la transizione epitelio mesenchimale verifica e geni associati con la guarigione della ferita e l&#39;infiammazione sono espressi in modo differenziale. Così, espianti keratocyte possono servire come modello in vitro per la riepitelizzazione cutanea che si verifica durante la guarigione della ferita e può rappresentare un sistema unico per studiare i meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di un programma definito di cambiamenti di espressione genica. Una varietà di linee di zebrafish mutanti e transgeniche sono disponibili, che consente di espianti di stabilire da pesce con diversi background genetico. Questo permette il ruolo di proteine ​​diverse all&#39;interno di questi processi da affrontare univoco. I protocolli descritti qui descrivono un metodo semplice ed efficace per stabilire queste culture espianto per l&#39;uso in una varietà di saggi legati alla migrazione cellulare collettiva.

Come illustrato in figura 1, fogli di cheratinociti possono essere osservati migrare da sotto la scala poche ore istituisce cultura espianto. Di tanto in tanto, un keratocyte migrazione personalizzato che si è staccato dal foglio collettivamente la migrazione può essere osservato. Inoltre, come è stato stabilito l&#39;espianto da un pesce precedentemente pizzicate, ci sono abbondanti neutrofili migrano attraverso il foglio. Nei periodi più lunghi di cultura, i frammenti foglio keratocyte le cellule ...

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Cheratociti zebrafish migrano in lastre alveolari da espianti e forniscono un modello in vitro per lo studio dei meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di epiteliale guarigione della ferita. Questi protocolli dettaglio un modo efficace per stabilire le culture espianto primarie per l&#39;uso in test di migrazione cellulare collettiva.

Zebrafish Keratocyte espianti per studiare la migrazione delle cellule collettiva e riepitelizzazione in guarigione delle ferite cutanee

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Views.  Midwestern University.  Cheratociti zebrafish migrano in lastre alveolari da espianti e forniscono un modello in vitro per lo studio dei meccanismi di migrazione cellulare collettiva nel contesto di epiteliale guarigione della ferita. Questi protocolli dettaglio un modo efficace per stabilire le culture espianto primarie per l'uso in test di migrazione cellulare collettiva. 

Video: Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Ottimizzazione del test ferita Scratch per rilevare i cambiamenti in murini mesenchimali stromali migrazione cellulare dopo i danni da fumo di sigaretta estratto solubile

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adenovirale Terapia genica per diabetici cheratopatia: Effetti sulla guarigione delle ferite e Stem Cell Marker Expression in Human Organ cornee-coltura e le cellule epiteliali Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Un dispositivo per realizzare la migrazione delle cellule / Wound Healing in una piastra a 96 pozzetti

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Un modello di Drosophila per studiare la poliploidizzazione indotta dalle ferite

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.