Gli autori non hanno riconoscimenti.

1. Preparazione del lavoro Aptamero l&#39;Archivio <ol><li> Seguire le istruzioni del produttore e sciogliere il oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la sequenza di riferimento 18) in acqua, raggiungendo una concentrazione finale di 100 micron. </li><li> Preparare la soluzione aptameri di lavoro diluendo lo stock oligonucleotide a 200 Nm con tampone assorbente (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2; 0,01% Tween20). </li><li> Incubare la miscela per 2 minuti a 90 ° C, lasciate raffreddare il campione immediatamente sul ghiaccio, e utilizzare il campione a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparazione del Ligand diluizione Series <ol><li> Per ogni ligando (adenosina trifosfato (ATP), adenosina difosfato (ADP), adenosina monofosfato (AMP), adenina, guanosintrifosfato (GTP), citosintrifosfato (CTP), deossiadenosina trifosfato (dATP), e S-adenosilmetionina (SAM) ; 10 mM magazzino ciascuno), preparare un diluti di serie 16-stepsu in 200 provette micro microlitri. NOTA: centrifugazione delle scorte ligando per 5 minuti a 14000 g può aiutare a rimuovere gli aggregati. Basso volume, si raccomanda provette vincolante basso per evitare l&#39;assorbimento delle molecole alle pareti del tubo. </li><li> Iniziare con una concentrazione massima di almeno 50 volte superiore all&#39;affinità stimata e ridurre la concentrazione del ligando del 50% in ogni fase di diluizione. NOTA: Lo strumento concentrazione finder implementato nel software di controllo simula dati vincolanti e aiuta a trovare l&#39;intervallo di concentrazione giusta per la serie di diluizioni. </li><li> Riempire 20 ml di legante magazzino (10 mm) in tubo 1. Aggiungere 10 ml di tampone di legame aptameri in tubi di reazione micro 2-16. </li><li> Trasferimento 10 ml di tubo da 1 a tubo 2 e miscelare correttamente pipettando su e giù parecchie volte. Trasferire 10 microlitri al tubo successivo e ripetere questa diluizione per i rimanenti tubi. </li><li> Eliminare l&#39;eccesso di 10 ml dall&#39;ultima provetta. Evitare qualsiasi Beffetti diluitivi Uffer. Il tampone nella provetta 1 e in tubi 2-16 deve essere identica. </li></ol> 3. Preparazione della miscela di reazione finale <ol><li> Preparare le singole reazioni di legame con un volume di 20 microlitri (10 ml di soluzione di lavoro aptamer + 10 ml di rispettiva diluizione ligando) per minimizzare errori di pipettamento. Un volume di soli 4 microlitri è suf fi ciente per il riempimento capillare. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro 200 nM aptameri a 10 microlitri di ogni diluizione ligando e miscelare correttamente pipettando su e giù diverse volte. </li><li> Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente e riempire i campioni nei capillari standard, immergendo i capillari nel campione. tempi di incubazione più lunghi possono essere necessari per alcune interazioni; Tuttavia, 5 min è adeguato per la maggior parte. Selezionare i capillari solo sui lati, NON sulla parte centrale, dove viene effettuata la misurazione ottica. </li><li> Posizionare i capillari si aVassoio capillare e ed avviare il dispositivo MST. </li></ol> 4. Avvio del dispositivo MST NOTA: Il dispositivo fornisce due pacchetti software preinstallati, l &#39; &quot;software per la messa a punto tecnica delle condizioni sperimentali e il controllo&#39; &#39;analisi&quot;&#39; software per l&#39;interpretazione dei dati prodotti. <ol><li> Prima di effettuare il vassoio capillare nel dispositivo MST, avviare il software di controllo e regolare la temperatura complessiva desiderata selezionando &#39;&#39; attivare il controllo manuale della temperatura &quot;del &#39;&#39; controllo della temperatura&quot; menu a discesa. Regolare la temperatura a 25 ° C in questo modo. NOTA: Gli strumenti MST possono essere a temperatura controllati attraverso 22 a 45 ° C. </li><li> Attendere che la temperatura per raggiungere il livello previsto e quindi inserire il vassoio capillare nel dispositivo MST. </li><li> Impostare il canale LED per &#39;&#39; rosso &quot;per le tinture Cy5 e regolare la potenza del LED per ottenere un fl uorescence segnale 300 a 1000 unità di fluorescenza del dispositivo MST con un sensore standard. potere LED 25% è utilizzato in questo studio. NOTA: 6.000 a 18.000 unità di fluorescenza sono raccomandati per il MST con un sensore ad alta sensibilità. </li></ol> 5. capillare Scan <ol><li> Effettuare una scansione capillare per controllare diversi aspetti di qualità del campione, scegliendo la posizione capillare sul software &quot;di controllo&quot; e cliccando su &quot;avviare la scansione cap&quot; prima della misurazione MST. </li><li> Ispezionare la scansione capillare per la fluorescenza valorizzazione / tempra e gli effetti che attaccano (a forma di U o appiattita picchi) nel software. NOTA: Maggiori dettagli sul rilevamento e la gestione della fluorescenza e gli effetti che attaccano possono essere trovati nella discussione. </li></ol> 6. Misura MST NOTA: Prima di iniziare la misura MST, assicurarsi di escludere attaccare effetti, valorizzazione / effetti tempra, oerrori di pipettamento, e garantire che la scansione capillare indica che il segnale fluorescenza è suf fi ciente. Per maggiori dettagli, vedere la discussione. <ol><li> Assegnare le concentrazioni di ligando della serie di diluizione alla rispettiva posizione capillare nel software &#39;&#39; di controllo &quot;consideri la fase di diluizione della miscelazione del aptamer e ligando. (1: 1). </li><li> Inserisci la più alta concentrazione di ligando (5 mm) per capillare # 1, selezionare il tipo di diluizione corretto (qui, 1: 1), cliccare sulla massima concentrazione, e utilizzare la funzione di trascinamento per assegnare automaticamente le restanti concentrazioni in capillari # 2 16. La concentrazione più bassa è 152,6 nM. </li><li> Inserire la concentrazione del aptamer uorescenti fl (qui, 100 nM) nella rispettiva sezione del software di controllo. </li><li> Utilizzare le impostazioni predefinite, che rilevano la fluorescenza fl per 5 secondi, registrare il MST per 30 secondi, e registrare la fluorescenza per altri 5 secondi dopo l&#39;inattivazione del t laser<html> o monitorare la diffusione posteriore delle molecole. </li><li> Regolare la potenza del laser al 20% nella rispettiva sezione del software di controllo. NOTA: per ricevere il miglior rapporto segnale-rumore e per evitare effetti non specifici, si consiglia una potenza laser di 20-40%. In casi specifici, una potenza del laser più elevato può essere richiesto per ottenere una buona separazione delle molecole non legati e legati. </li><li> Salvare l&#39;esperimento dopo aver selezionato la cartella di destinazione e avviare la misura MST premendo il pulsante &#39;&#39; misura di inizio MST &quot;. NOTA: Il file .ntp verrà generato nella cartella di destinazione. Usando questa configurazione, una misurazione dura 10-15 minuti. </li><li> Ripetere la procedura sperimentale almeno due volte per una determinazione più accurata del valore EC 50. NOTA: Al fine di testare la riproducibilità tecnica, gli stessi capillari possono essere acquisiti più volte (ripete tecnici). </li></ol> 7. Analisi dei dati MST nt &quot;&gt; NOTA: Il software di analisi permette l&#39;analisi dei dati sul fl y durante la misurazione Il software di analisi traccia le tracce del tempo MST e dei cambiamenti nel normalizzato fluorescenza (F norma) contro la concentrazione del ligando 37.. <ol><li> Avviare il software di analisi MST (Analisi MO.Affinity) e caricare il file .ntp dalla cartella di destinazione. Selezionare &quot;MST&quot; come tipo di analisi nel menu di selezione dei dati. NOTA: Nel caso di effetti di fluorescenza ligando-dipendente, la fluorescenza iniziale può essere scelto per l&#39;analisi. </li><li> Aggiungere la rispettiva corsa (s) tecnico o biologico per una nuova analisi con il drag-and-drop o premendo il tasto &quot;+&quot; al di sotto del rispettivo periodo sperimentale. </li><li> Premere il pulsante di informazioni al di sotto del rispettivo periodo di sperimentazione per ottenere informazioni sulle proprietà di questo esperimento, tracce MST, scansione capillare, forma capillare, fluorescenza iniziale e tasso di sbiancamento. NOTA: I dati grezzi possono alcosì da ispezionare in fasi successive dell&#39;analisi. </li><li> Visivamente le tracce MST per l&#39;aggregazione e la precipitazione effetti, visibile come urti e picchi. NOTA: Per ulteriori informazioni sul rilevamento e la gestione degli effetti di aggregazione, leggere la discussione. </li><li> Ispezionare visivamente la scansione capillare e la capillare forma di sovrapposizione per gli effetti di adsorbimento, visibile come picchi o appiattite a forma di U. Ispezionare visivamente la scansione capillare e la fluorescenza iniziale per gli effetti di fluorescenza. Ispezionare visivamente il tasso sbiancante per photobleaching effetti. </li><li> Passare alla modalità dose-risposta e modificare l&#39;impostazione di analisi in modalità &quot;esperto&quot; premendo il tasto corrispondente. Selezionare &quot;T-Jump&quot;, come la strategia di valutazione MST. </li><li> Selezionare il modello di &quot;Hill&quot; per la curva fi tting. saranno automaticamente calcolati i parametri vincolanti. Normalizzare i dati scegliendo il rispettivo tipo di normalizzazione nel menu &quot;confrontare i risultati&quot;. esportare ili dati sia come un file .xls o .pdf. Nota: La tabella sotto il grafico legame riassume i parametri vincolanti calcolati. </li></ol>

CE e TS sono dipendenti di 2bind GmbH, che fornisce servizi di analisi biofisici. spese di pubblicazione di questo video-articolo sono pagati dal 2bind GmbH.

Controlli di qualità: Aspecifico sticking / adsorbimento di materiale campione a superfici, così come gli effetti di aggregazione, hanno una influenza notevole sulla qualità dei dati di affinità. Tuttavia, solo un paio di tecnologie state-of-the-art offrono opzioni precise e rapide per monitorare ed evitare questi effetti. MST offre controlli di qualità integrati che consentono di rilevare e aiutano a superare questi problemi, consentendo l&#39;ottimizzazione graduale della configurazione ...

L&#39;interazione tra le molecole è la base della natura. Quindi, gli scienziati in molti campi della ricerca di base e applicata cercano di capire i principi fondamentali delle interazioni molecolari di diversi tipi. MicroScale termoforesi (MST) consente agli scienziati di effettuare il veloce, preciso, caratterizzazione economicamente efficiente e di qualità controllata delle interazioni molecolari in soluzione, con una scelta di buffer. Ci sono già più di 1.000 pubblicazioni utilizzando MST, a partire dal 2016 da solo, che descrive i diversi tipi di analisi, tra cui proiezioni di libreria, convalide di eventi, analisi della concorrenza, e gli esperimenti di legame con partner multipli vincolanti 1-8. In generale, MST consente lo studio dei parametri vincolanti classici, come affinità di legame (pM a mM), stechiometria e termodinamica, di qualsiasi tipo di interazione molecolare. Un grande vantaggio di MST è la capacità di studiare eventi di legame indipendenti dalla dimensione dei partner di interazione. anche Chalinterazioni lenging tra piccole aptameri di acidi nucleici (15-30 nt) e target, quali piccole molecole, farmaci, antibiotici, o metaboliti possono essere quantificati. Le attuali tecnologie state-of-the-art di caratterizzare le interazioni aptamer bersaglio sono o laboratorio-intenso e molto complesso o non riescono a quantificare aptameri-piccola molecola Interazioni 9,10. Risonanza plasmonica di superficie (SPR) a base di test di 11,12 e approcci calorimetrica veramente libero-label, come Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) 13-15, eluizione isocratica 16, equilibrio filtrazione 17,18, in linea di sondaggio 19, gel- spostare saggi, stopped- flusso fluorescenza spettroscopia 20,21, anisotropia di fluorescenza (FA) 22,23, singola molecola fluorescenza di imaging 24,25, e Bio-strato di interferometria (BLI) 26 siano anche imprecisi o incompatibile con la molecola aptameri-piccole interazioni. Altro Principal temi di questi metodi sono bassa sensibilità, elevato consumo di campione, l&#39;immobilizzazione, limitazioni di trasporto di massa su superfici e / o limitazioni del buffer. Solo pochi di queste tecnologie forniscono controlli integrati per aggregazione e di adsorbimento effetti. MST rappresenta un potente strumento per gli scienziati di superare questa limitazione per studiare le interazioni tra aptameri e piccole molecole 27-29, nonché altri obiettivi come le proteine 30-33. La tecnologia si basa sul movimento delle molecole attraverso gradienti di temperatura. Questo movimento diretto, chiamato &quot;termoforesi,&quot; dipende dalle dimensioni, carica, e shell idratazione della molecola 34,35. Il legame di un ligando alla molecola modificherà direttamente almeno uno di questi parametri, con un conseguente mobilità thermophoretic cambiato. Ligandi con le piccole dimensioni non possono avere un notevole impatto in termini di cambio formato dal non associata alla stato legato, ma possono avere dr<html> effetti Amatic sul guscio di idratazione e / o carica. I cambiamenti nel movimento delle molecole thermophoretic dopo interazioni con il partner legante consente la quantificazione dei parametri vincolanti di base 2,7,34,36,37. Come illustrato in figura 1A, il dispositivo MST costituito da un laser a infrarossi focalizzato sul campione entro i capillari di vetro con la stessa ottica come per la rilevazione della fluorescenza. Il movimento thermophoretic delle proteine tramite fluorescenza intrinseca di triptofani 6 o di un 3,8 socio interazione fluorescente può essere monitorato mentre il laser stabilisce un gradiente di temperatura (DT di 2-6 ° C). La differenza di temperatura risultante nello spazio, DT, porta alla deplezione o accumulo di molecole nella zona di temperatura elevata, che può essere quantificato dal Soret coefficiente (S T): g &quot;/&gt; c rappresenta caldo la concentrazione nella regione riscaldata, ec freddo è la concentrazione nella regione fredda iniziale. Come mostrato nella Figura 1B, un tipico esperimento MST ottiene un profilo di movimento MST (traccia temporale), costituito da diverse fasi, che possono essere separati dai rispettivi tempi. La fluorescenza iniziale è misurata nei primi 5 s in assenza del gradiente di temperatura per definire la precisione di fluorescenza iniziale e per controllare photobleaching o photoenhancement. Il salto di temperatura (T-Jump) rappresenta la fase in cui le variazioni di fluorescenza prima del movimento thermophoretic. Questa diminuzione iniziale della fluorescenza dipende da sbalzi termici-dipendente di fl uorophore resa quantica. La fase termoforesi segue, in cui diminuisce fluorescenza (o aumenta) dovuti al movimento thermophoretic delle molecole fino alla distribuzione dello stato stazionario viene raggiunto.Il tjump retromarcia e retrodiffusione concomitante di molecole fl uorescenti possono essere osservati come indicato in Figura 1B dopo il laser è spento. Per accedere ai parametri di base vincolanti, diversi rapporti molari dei partner di interazione sono analizzati e confrontati. Tipicamente, 16 differenti rapporti sono studiati in un esperimento MST, considerando che la molecola visibile ottica viene mantenuta costante ed è fornita con una quantità crescente di ligando non marcato. L&#39;interazione tra i due partner di legame induce cambiamenti nella termoforesi, e quindi nella fluorescenza normalizzato, F norma, che viene calcolato come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F calda e fredda F rappresentano una media di fl intensità fluorescenza a de fi nite momenti delle tracce MST. Affinità di legame (K D o valori di EC 50) possono essere calcolati curve montaggio (Figura 1C). Nel complesso, MST è un potente strumento per studiare le interazioni molecolari di qualsiasi tipo. Questo manoscritto offre un protocollo per caratterizzare l&#39;interazione sfida tra la piccola molecola di adenosina trifosfato (ATP; 0,5 kDa) e il 25-nt breve ssDNA aptameri DH25.42 (7,9 kDa). Nel corso del manoscritto, il sito di legame del aptamer sulla molecola ATP viene mappato verso il gruppo adenina dell&#39;ATP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Aptamer binding buffer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescently labeled ATP aptamer</td>
			<td>IDT, Leuven, Belgium</td>
			<td ></td>
			<td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-ATTGCGGAGGAAGG-3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2383</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ADP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2754</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AMP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2252</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A8626</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SAM</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A7007</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >11934511001</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>C1506</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >G8877</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115&#160;</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-G008</td>
			<td>Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115 capillaries Standard</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-K002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf PCR tubes</td>
			<td >Eppendorf, Germany</td>
			<td >30124537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MO.affinity analysis v2.1.1</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaleidagraph 4.5.2</td>
			<td >Synergy Software</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

In questo studio, MST è stato applicato per caratterizzare il sito di legame del DNA aptamer DH25.42 18 ATP. A differenza di altri studi che caratterizzano l&#39;interazione di ATP o ATP-mimando piccole molecole con proteine marcate casualmente con uno o più fluorofori 38-40, questo studio include una etichetta versione del aptamer 7,9 kDa ssDNA con una molecola Cy5 sull&#39;estremità 5&#39; . Diversi derivati ​​ATP e molecole correlate, che differiscono da A...

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

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Biochemistry

10.5K Views.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Quantificazione dei batteri istidina chinasi autophosphorylation usando un test nitrocellulosa Binding

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Ricerca

Biochimica

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

Determinazione di alta affinità antigene-anticorpo cinetica del legame con quattro piattaforme biosensore

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Rilevazione di piccolo GTPase prenilazione e GTP Binding mediante frazionamento di membrana e GTPase-collegata dell'immunosorbente

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Interazioni di proteine globulari e filamentose di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala submicronica (MST) di misura

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...