Gli autori desiderano ringraziare Karen Lawrence per il suo aiuto con sezione che descrive la costruzione della camera di elettroporazione.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Espianto elettroporazione è un mezzo semplice di quantificare cis-regolamentare l&#39;attività del mouse nella retina di sviluppo. Rispetto al cis-normativo analisi tramite transgenesi mouse, elettroporazione è molto più economico, che richiede solo cuccioli di topo neonato, il DNA, strumenti di dissezione, ed elettroporazione / cultura materiale dei tessuti. E &#39;anche molto meno tempo di consumo: esperimento si richiede solo poche ore di tempo di preparazione, un periodo di coltura di circa otto giorni, e poche ore alla fine della sperimentazione per l&#39;imaging e analisi dei dati. Espianto elettroporazione è anche superiore alla coltura cellulare a base di cis-regolamentazione analisi dal reale tessuto retinico viene utilizzato. La retina si sviluppa abbastanza normalmente in espianto cultura si forma tre strati distinti cellulare (strato esterno nucleare, nucleare strato interno e strato di cellule gangliari), anche se fotorecettori non riescono a elaborare segmenti esterni. Un ulteriore vantaggio è che elettroporazione espianto è altamente riproducibile. I costrutti stesso elettroporate in retine diversi, anche in giorni diversi, in genere si traduce in livelli stessa espressione relativa. Inoltre, poiché i plasmidi elettroporate si pensa siano mantenuti episomally nel nucleo e non sono incorporati nei cromosomi, essi non sembrano essere soggette agli effetti stesso sito di integrazione che tormentano cis-normativo analisi effettuate nei topi transgenici. Elettroporazione espianto ha diverse limitazioni. In primo luogo, solo le cellule che sono ancora nel ciclo cellulare può essere efficacemente trasdotte con elettroporazione 15. A P0, aste e altri più tardi, nato tipi di cellule della retina (cellule bipolari, cellule amacrine, M ller glia) sono i principali popolazioni di cellule bersaglio con questo metodo. Elettroporazione di fotorecettori cono da P0 elettroporazione è stato segnalato 16, ma l&#39;efficacia sembra essere basso. Un secondo limite è che la cultura espianto di là di due risultati settimane malformazione progressiva della retina e non è pertanto raccomandato. Se quantificazione promotore è tenuto a timepoints tardi, tuttavia, un elettroporazione in vivo 9 possono essere eseguite, seguita da dissezione della retina al timepoint desiderato, piatto di montaggio della retina sezionato, e quantificazione come descritto nella sezione 9. Una terza limitazione è che questo saggio è solo moderatamente elevato throughput. A differenza dei saggi di cultura a base di cellule che possono testare centinaia di costruzioni in un singolo esperimento, la tecnica descritta in questo protocollo richiede un minimo di un retina del mouse tutto per costruire. Così, solo un paio di dozzine di costruzioni possono essere ragionevolmente elettroporate in un giorno. Un avvertimento aggiuntivi rispetto alla quantificazione dell&#39;attività di promotore con l&#39;attuale approccio è che c&#39;è un potenziale di &#39;sanguinare-through&#39; di fluorescenza DsRed nel canale GFP, in particolare quando i promotori dosaggio molto forte. La ragione di questo è che lo spettro di emissione di DsRed in parte si sovrappone a quella di GFP. Per aggirare questo problema, filtri di emissioni ottimizzati dovrebbe essere utilizzato che riducano al minimo la sovrapposizione spettrale tra DsRed e GFP. Quando tali insiemi ottimizzato filtro non sono disponibili, un&#39;altra possibile soluzione sarebbe quella di utilizzare un blu-spostato proteina fluorescente (per esempio, BFP o CFP) al posto di GFP.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Elettroporazione piatto, Microslide 453 </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> Vedere la sezione 1 del protocollo per le modifiche </td></tr><tr><td> 100% gomma siliconica acquario cemento </td><td> Perfecto Produzione </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microprovette cremagliera in plastica </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Solo il manico cremagliera saranno utilizzati </td></tr><tr><td> Dremel strumento </td><td></td><td></td><td> Per tagliare il manico fuori del rack tubo di plastica </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> Concentrazione 100X </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> Per magazzino 1000X, risospendere in 5mg/ml in 5mM HCl e filtro-sterilizzare </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 onda quadra elettroporatore </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore filtri </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0.2μm </td></tr><tr><td> Tessuto cultura incubatore </td><td></td><td></td><td> 37 ° C, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Coprioggetto di vetro # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> 0,16 millimetri di spessore </td></tr><tr><td> Composto microscopio a fluorescenza dotato di telecamera </td><td></td><td></td><td> Fotocamera deve essere monocromatica (ad esempio, ORCA-ER fotocamera da Hamamatsu) </td></tr><tr><td> EGFP / DsRed set di filtri per il microscopio composto </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 86007 </td><td> Questo bleedthrough set di filtri riduce al minimo tra il chanenels rosso e verde </td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

Fattori di trascrizione genetica all&#39;interno di reti cellulari di controllo del modello spazio-temporali e livelli di espressione dei loro geni bersaglio legandosi a cis-normativo elementi (Cres), breve (~ 300-600 pb) tratti di DNA genomico che può mentire a monte, a valle, o entro gli introni dei geni che controllano. CRES (cioè, esaltatori / promotori) in genere costituiti da più siti raggruppati vincolante per entrambe le attivatori e repressori trascrizionali 1-3. Essi servono come integratori logica di input trascrizionale dare un rendimento unitario nella forma di attività promotore spatiotemporally preciso e quantitativo esatto. La maggior parte degli studi di mammiferi cis-regolazione fino ad oggi hanno fatto affidamento sulla transgenesi mouse come un mezzo per saggiare la funzione potenziatore del CRES 4-5. Questa tecnica richiede tempo, costosa e, a causa degli effetti di sito di inserimento, in gran parte non quantitativi. D&#39;altra parte, analisi quantitative per mammiferi funzione CRE sono stati sviluppati in sistemi di coltura tissutale (ad esempio, test dual luciferasi), ma la rilevanza in vivo di questi risultati è spesso incerto. Elettroporazione offre un&#39;ottima alternativa per transgenesi mouse tradizionale in quanto consente sia la valutazione spazio-temporale e quantitativa di cis-regolamentazione dell&#39;attività in tessuti viventi dei mammiferi. Questa tecnica è stata particolarmente utile nell&#39;analisi di cis-regolazione del sistema nervoso centrale, specialmente nella corteccia cerebrale e della retina 6-8. Mentre elettroporazione del mouse della retina, sia in vivo ed ex vivo, è stato sviluppato e ampiamente descritto da Matsuda e Cepko 6-7,9, abbiamo recentemente sviluppato un approccio semplice per quantificare l&#39;attività di fotorecettori specifici CRES in elettroporate topo retine 10. Dato che la quantità di DNA che viene introdotto nella retina mediante elettroporazione può variare da esperimento per esperimento, è necessario includere una co-elettroporate &#39;di controllo di carico&#39; in tutti gli esperimenti. A questo proposito, la tecnica è molto simile al dosaggio doppio luciferasi utilizzato per quantificare l&#39;attività promotore in cellule in coltura. Quando il saggio fotorecettore cis-regolamentazione dell&#39;attività, elettroporazione è di solito eseguita in topi neonati (giorno dopo la nascita 0, P0) che è il tempo del picco di produzione asta 11-12. Una volta che i tipi di cellule della retina diventano post-mitotico, elettroporazione è molto meno efficiente. Dato l&#39;alto tasso di natalità asta nei topi appena nati e il fatto che aste costituiscono oltre il 70% delle cellule della retina topo adulto, la maggior parte delle cellule che sono elettroporate a P0 sono aste. Per questo motivo, bastoncelli sono le più facili tipo di cellule della retina per studiare tramite elettroporazione. La tecnica che descriviamo qui è soprattutto utile per quantificare l&#39;attività del CRES fotorecettori.

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Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Questo protocollo descrive un modo semplice ed economico per quantificare l&#39;attività del cis-elementi normativi (ad esempio, enhancer / promoter), nel vivere retine del mouse tramite elettroporazione espianto. Preparazione di analisi del DNA, la dissezione della retina, elettroporazione, cultura espianto della retina, e post-fissazione e la quantificazione sono descritti.

Quantificare le attività di Cis-Regolamentazione Elementi nella retina di topo Elettroporazione Espianto

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

quantifying-activity-cis-regulatory-elements-mouse-retina-explant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

14.3K Views.  Washington University School of Medicine. Questo protocollo descrive un modo semplice ed economico per quantificare l'attività del cis-elementi normativi (ad esempio, enhancer / promoter), nel vivere retine del mouse tramite elettroporazione espianto. Preparazione di analisi del DNA, la dissezione della retina, elettroporazione, cultura espianto della retina, e post-fissazione e la quantificazione sono descritti.