Les auteurs tiennent à remercier Karen Laurent pour son aide à la construction de la section décrivant la chambre d&#39;électroporation.

<ol>
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Électroporation explant est un moyen simple de quantifier l&#39;activité cis-régulatrices dans la rétine de souris en développement. Comparé à cis-régulatrices analyse par transgénèse souris, l&#39;électroporation est beaucoup moins cher, nécessitant souriceaux nouveau-nés que l&#39;ADN, d&#39;instruments de dissection, et l&#39;électroporation / équipement de culture de tissus. Il est également beaucoup moins de temps de consommation: l&#39;expérience on exige seulement quelques heures de temps de préparation, une période de culture d&#39;environ huit jours, et quelques heures à la fin de l&#39;expérience de l&#39;imagerie et l&#39;analyse des données. Électroporation explant est également supérieure à la culture cellulaire à base de cis-régulation réelle analyse puisque le tissu rétinien est utilisé. La rétine se développe tout à fait normalement dans les explants culture qu&#39;elle forme trois couches distinctes cellulaire (couche externe nucléaire, couche intérieure nucléaire, et la couche de cellules ganglionnaires), mais ne parviennent pas à élaborer des photorécepteurs segments externes. Un autre avantage est que l&#39;électroporation explant est hautement reproductible. Les mêmes constructions électroporés dans les rétines différentes, voire des jours différents, se traduit généralement par les mêmes niveaux d&#39;expression relative. En outre, depuis les plasmides par électroporation sont pensés pour être maintenu épisomique dans le noyau et ne sont pas incorporés dans les chromosomes, ils ne semblent pas être soumis aux mêmes effets site d&#39;intégration qui perturbent cis-régulatrices analyse effectuée sur des souris transgéniques. Électroporation explantation ne présentent plusieurs limites. D&#39;abord, seules les cellules qui sont encore dans le cycle cellulaire peut être efficacement transduites par électroporation 15. Au P0, baguettes et autres plus tard-types de cellules rétiniennes (cellules bipolaires, cellules amacrines, M ller gliales) sont les principales populations de cellules ciblées par cette méthode. L&#39;électroporation des cônes photorécepteurs par P0 électroporation a été rapporté 16, mais l&#39;efficacité semble être faible. Une deuxième limitation est que la culture des explants-delà des résultats deux semaines dans la malformation progressive de la rétine et n&#39;est donc pas recommandé. Si la quantification promoteur est tenu au timepoints tard, cependant, une électroporation in vivo dans 9 peuvent être effectuées, suivies par une dissection rétine au point de temps désiré, plat de montage de la rétine disséqué, et la quantification comme décrit dans la section 9. Une troisième limitation est que ce test n&#39;est que modérément à haut débit. Contrairement à des analyses de culture à base de cellules qui peuvent tester des centaines de constructions en une seule expérience, la technique décrite dans ce protocole nécessite un minimum d&#39;une rétine de souris entier par la construction. Ainsi, seule une dizaine de constructions de couple peut être raisonnablement électroporation dans une journée. Une mise en garde supplémentaire à l&#39;égard de la quantification de l&#39;activité du promoteur en utilisant l&#39;approche actuelle est qu&#39;il ya un potentiel de «transpercement» de la fluorescence DsRed dans le canal de la GFP, en particulier lorsque les promoteurs dosant très forte. La raison de ceci est que le spectre d&#39;émission de DsRed recouvre partiellement celle de la GFP. Pour contourner ce problème, les filtres d&#39;émission optimisés devrait être utilisé que de minimiser le chevauchement spectral entre DsRed et GFP. Lorsque de tels ensembles de filtres optimisés ne sont pas disponibles, une autre solution possible serait d&#39;utiliser une protéine fluorescente décalée vers le bleu (par exemple, BFP ou CFP) en lieu et place de la GFP.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> L&#39;électroporation vaisselle, Microslide 453 </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> Voir la section 1 du protocole pour les modifications </td></tr><tr><td> 100% silicone caoutchouc aquarium de ciment </td><td> Perfecto fabrication </td><td></td><td></td></tr><tr><td> En rack microtube plastique </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Seule la poignée de porte sera utilisé </td></tr><tr><td> Dremel </td><td></td><td></td><td> Pour la coupe de la poignée hors du rack tube en plastique </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> La concentration 100X </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> Pour le stock de 1000X, resuspendre au 5mg/ml en 5mm HCl et filtre à stériliser </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Square-ondes électroporateur </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filtres Nuclepore </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0,2 um </td></tr><tr><td> Incubateur de culture tissulaire </td><td></td><td></td><td> 37 ° C, 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> Lamelles de verre # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> 0.16mm d&#39;épaisseur </td></tr><tr><td> Microscope composé fluorescent équipé d&#39;une caméra </td><td></td><td></td><td> Caméra doit être monochromatique (par exemple, l&#39;ORCA-ER caméra par Hamamatsu) </td></tr><tr><td> EGFP / DsRed ensemble de filtres pour microscope composé </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 86007 </td><td> Cette bleedthrough ensemble de filtres minimise entre le rouge et le vert chanenels </td></tr><tr><td> Logiciel ImageJ </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

Les facteurs de transcription dans les réseaux de gènes cellulaires de contrôle du modèle spatio-temporelle et les niveaux d&#39;expression de leurs gènes cibles en se liant aux éléments cis-régulateurs (CRE), courte (~ 300-600 pb) s&#39;étend de l&#39;ADN génomique qui peut rester en amont, en aval, ou dans les introns des gènes qu&#39;ils contrôlent. CRES (ie, exhausteurs / promoteurs) se composent généralement de plusieurs clusters sites de liaison pour les activateurs de la transcription et de répresseurs 1-3. Ils servent d&#39;intégrateurs logique de l&#39;entrée de la transcription de donner une sortie unitaire dans la forme de l&#39;activité du promoteur spatio-temporellement précis et quantitativement exacte. La plupart des études des mammifères cis-régulation à ce jour se sont appuyés sur la transgenèse de la souris comme un moyen de dosage de la fonction enhancer du CRE 4-5. Cette technique est fastidieuse, coûteuse et, à cause des effets de site d&#39;insertion, en grande partie non quantitatives. D&#39;autre part, les tests quantitatifs pour la CRE fonction de mammifères ont été développés dans les systèmes de culture de tissus (par exemple, deux tests luciférase), mais la pertinence in vivo de ces résultats est souvent incertaine. L&#39;électroporation offre une excellente alternative à la transgenèse souris traditionnelle en ce qu&#39;elle permet à la fois l&#39;évaluation spatio-temporelle et quantitative de l&#39;activité cis-régulatrices dans les tissus vivants de mammifères. Cette technique a été particulièrement utile dans l&#39;analyse de cis-régulation dans le système nerveux central, en particulier dans le cortex cérébral et la rétine 6-8. Alors que l&#39;électroporation de souris de la rétine, à la fois in vivo et ex vivo, a été développé et largement décrites par Matsuda et Cepko 6-7,9, nous avons récemment développé une méthode simple pour quantifier l&#39;activité des photorécepteurs spécifiques CRE de la souris électroporées rétines 10. Étant donné que la quantité d&#39;ADN qui est introduit dans la rétine par électroporation peut varier d&#39;une expérience à, il est nécessaire d&#39;inclure «le contrôle de chargement &#39;un co-électroporation dans toutes les expériences. À cet égard, la technique est très similaire à l&#39;essai à double luciférase utilisée pour quantifier l&#39;activité du promoteur dans les cellules cultivées. Lorsque dosant photorécepteur cis-régulatrices d&#39;activité, l&#39;électroporation est généralement effectuée sur des souris nouveau-nés (jour postnatal 0, P0) qui est le temps de la tige de production de pointe 11-12. Une fois les types de cellules rétiniennes deviennent post-mitotiques, l&#39;électroporation est beaucoup moins efficace. Compte tenu du taux élevé de natalité tige dans souriceaux nouveau-nés et le fait que les tiges constituent plus de 70% des cellules dans la rétine de souris adultes, la majorité des cellules qui sont électroporation à P0 sont des tiges. Pour cette raison, les photorécepteurs tige sont le type le plus facile de cellules rétiniennes à l&#39;étude par électroporation. La technique que nous décrivons ici est principalement utile pour quantifier l&#39;activité de la CRE photorécepteur.

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Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Ce protocole décrit une méthode simple et peu coûteux afin de quantifier l&#39;activité des éléments cis-régulateurs (par exemple, enhancer / promoteur) dans la vie des rétines de souris par électroporation explant. Analyse préparation de l&#39;ADN, la dissection de la rétine, l&#39;électroporation, la culture des explants rétiniens, et post-fixation et de quantification sont décrits.

Quantifier l&#39;activité des Cis Éléments de la réglementation-dans la rétine de souris par électroporation explantation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

quantifying-activity-cis-regulatory-elements-mouse-retina-explant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

14.3K vues.  Washington University School of Medicine. Ce protocole décrit une méthode simple et peu coûteux afin de quantifier l'activité des éléments cis-régulateurs (par exemple, enhancer / promoteur) dans la vie des rétines de souris par électroporation explant. Analyse préparation de l'ADN, la dissection de la rétine, l'électroporation, la culture des explants rétiniens, et post-fixation et de quantification sont décrits.