著者らは、エレクトロポレーションチャンバーのセクションを記述建設で彼女の助けのためにカレンローレンスに感謝します。

<ol>
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利害の衝突は宣言されません。

外植片のエレクトロポレーションは、開発途上のマウス網膜でのシス調節活性を定量化する簡単な手段です。マウスの遺伝子導入を介してシス調節の解析と比較して、エレクトロポレーションは、新生仔マウス、DNA、解剖器具、およびエレクトロポレーション/組織培養装置を必要とする、はるかに安いです。また、消費するはるかに短い時間です：一つの実験では、唯一の準備時間の数時間、約8日間の培養期間、およびイメージングとデータ解析のための実験の終わりに数時間を必要とします。外植片のエレクトロポレーションは、また細胞培養ベースの実際の網膜組織が ​​利用されているので、 シス調節の解析に優れています。網膜は、外植片ではかなり正常に発達文化 - それは、光受容体は、外側のセグメントを詳しく説明するために失敗するものの、3つの異なる細胞の層を（外顆粒層、内顆粒層、および神経節細胞層）を形成する。 さらなる利点は、外植片のエレクトロポレーションは非常に再現性があります。一般的にであっても別の日に、別の網膜中にエレクトロ同じ構造、同じ相対的な発現レベルの結果。さらに、エレクトロポレーションプラスミドを核内でエピソームに保持されると考えられていると染色体に組み込まれていないので、彼らは、トランスジェニックマウスで行われたシス調節の解析をイライラさせる、同じ組込み部位の影響を受けるように表示されません。 外植片のエレクトロポレーションは、いくつかの制限があります。最初に、細胞周期に残っている細胞のみが効率的にエレクトロ15で形質導入することができます。 P0で、ロッドと他の後の生まれの網膜細胞の種類は（双極細胞、アマクリン細胞、M llerのグリア細胞）この方法の対象となる主要な細胞集団です。 P0エレクトロポレーションにより、錐体光受容体のエレクトロポレーションは、16を報告したが、効率は低いように見えるされています。 2つ目の制限は、網膜の進行性の奇形で2週間の結果を超えてその移植片培養であるため、推奨されません。プロモーターの定量化が遅いタイムポイントで必要な場合はセクション9で説明したように、しかし、in vivoでのエレクトロポレーション9、目的のタイムポイントで網膜切開続いて、実行解剖網膜のフラットマウント、および定量化されることがあります。 3番目の制限は、このアッセイが適度にハイスループットであることです。細胞培養ベースの単一の実験での構造の何百ものテストができるアッセイとは異なり、このプロトコールに記載された技術は、構造ごとに全体のマウス網膜の最小値を必要とします。従って、唯一の数十個の構造は合理的に一日に電気穿孔することができます。 現在のアプローチを使用して、プロモーター活性の定量化に関するつの追加の注意点は非常に強力なプロモーターを測定する際、特に、GFPのチャンネルにDsRedの蛍光​​の&quot;ブリードスルー&quot;の可能性があるということです。その理由は、GFPのDsRedの一部が重なるのその発光スペクトルである。この問題を回避するために、最適化された発光フィルターは、DsRedのとGFPとの間のスペクトルの重なりを最小限にすることを使用する必要があります。このような最適化されたフィルタセットが利用できないときは、別の潜在的な解決策は、GFPの代わりにブルーシフトした蛍光タンパク質（ 例えば 、BFPやCFP）を使用することです。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>エレクトロポレーション料理、Microslide 453 </td><td> BTXハーバード装置</td><td> 45から0105 </td><td>修正のためにプロトコルのセクション1を参照してください</td></tr><tr><td> 100％のシリコーンゴム水族館のセメント</td><td>パーフェクトマニュファクチャリング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製のマイクロチューブのラック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 05から541 </td><td>のみラックハンドルが使用されます。 </td></tr><tr><td>ドレメルツール</td><td></td><td></td><td>プラスチックチューブのラックからハンドルを切断するための</td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 10378-016 </td><td> 100X濃度</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I - 6634 </td><td> 1000X株式の場合は、5mMの塩酸で5mg/mlに再懸濁し、ろ過滅菌</td></tr><tr><td> FBS </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830方形波エレクトロ</td><td> BTXハーバード装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleporeフィルター</td><td>ワットマン紙</td><td> 110606 </td><td> 25ミリメートル、0.2μmの</td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td></td><td></td><td> 37℃、5％CO 2 </td></tr><tr><td>ガラス製カバースリップ＃1.5 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 12 - 544E </td><td>厚さ0.16ミリメートル</td></tr><tr><td>カメラを装備した蛍光化合物の顕微鏡</td><td></td><td></td><td>カメラは単色（浜松などし、ORCA - ERカメラ）でなければなりません</td></tr><tr><td> EGFP /複合顕微鏡のためのDsRedのフィルタセット</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> 86007 </td><td>赤と緑のchanenelsの間でこのフィルタセットを最小限に抑えるbleedthrough </td></tr><tr><td> ImageJのソフトウェア</td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

短い細胞遺伝子ネットワーク内の転写因子のシス調節エレメント（CRES）に結合することにより、その標的遺伝子の発現の時空間パターンとレベルを制御する、（〜300〜600 bp）は下流、または内で、上流に位置することができるゲノムDNAの伸び彼らが制御する遺伝子のイントロン。クレス（ すなわち 、エンハンサー/プロモーターは）一般的に1から3の転写活性化因子およびリプレッサーの両方のクラスタ化された複数の結合部位で構成されています。彼らは、時空間に、正確で定量的に正確なプロモーター活性の形で単一出力を与える転写入力の論理的な積分器として機能する。これまでのシス調節哺乳類のほとんどの研究は4-5 CRESのエンハンサー機能をアッセイするための手段として、マウスの遺伝子導入に頼ってきた。この手法は、時間のかかるコストと、挿入部位の効果のアカウントで、大半は非定量的である。一方、哺乳類のCREの機能の定量的アッセイは、組織培養系（ 例えば 、デュアルルシフェラーゼアッセイ）で開発されているが、これらの結果の生体適合性でしばしば不明である。 エレクトロポレーションは、哺乳類の生体組織におけるシス調節活性の時空間と定量的に評価の両方を可能にするという点で従来のマウスの遺伝子導入に優れた代替手段を提供しています。この手法は、特に大脳皮質や網膜6-8に、中枢神経系におけるシス調節の解析に特に役立っています。 in vivoおよびex vivoの両方でマウス網膜エレクトロは、開発し、広範囲に松田とCepko 6-7,9で説明してきたが、我々は最近、エレクトロポレーション、マウスの網膜10に光受容体特異的なCRESの活性を定量化するシンプルなアプローチを開発しました。エレクトロポレーションによって網膜に導入されるDNA量は実験から実験に変えることができることを考えると、それは全ての実験において共同エレクトロポレーション&quot;ローディングコントロール&quot;を含める必要があります。この点で、手法は、培養細胞でのプロモーター活性を定量化するために使用するデュアルルシフェラーゼアッセイに非常によく似ています。 光受容体のシス調節活性を測定するときに、エレクトロポレーションは、通常、ピークロッドの製作11月12日の時間である新生マウス（生後0日、P0）で実行されます。一度網膜細胞の種類は、有糸分裂後になって、エレクトロポレーションは、あまり効率的です。新生児マウスのロッドの出生率の高さとロッドは成体マウスの網膜では細胞の70％以上を占めているという事実を考えると、P0でエレクトロポレーションされている細胞の大部分はロッドです。このような理由から、桿体は、エレクトロポレーションを経由して勉強する最も簡単な網膜細胞のタイプです。我々はここで説明するテクニックは、感光体のCRESの活性を定量化するために主に有用です。

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Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

このプロトコルは、外植片のエレクトロポレーションを使用してマウスの網膜を生体内でのシス調節エレメント（例えば、エンハンサー/プロモーター）の活性を定量化するための簡単​​で安価な方法を説明します。 DNA調製、網膜切開、エレクトロポレーション、網膜移植片培養、お​​よびポスト固定分析と定量化が説明されています。

の活動の定量化シス</em植片エレクトロポレーションによってマウス網膜で>調節エレメント

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

quantifying-activity-cis-regulatory-elements-mouse-retina-explant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

14.3K ビュー.  Washington University School of Medicine. このプロトコルは、外植片のエレクトロポレーションを使用してマウスの網膜を生体内でのシス調節エレメント（例えば、エンハンサー/プロモーター）の活性を定量化するための簡単​​で安価な方法を説明します。 DNA調製、網膜切開、エレクトロポレーション、網膜移植片培養、お​​よびポスト固定分析と定量化が説明されています。

の活動の定量化シス調節エレメント