Os autores gostariam de agradecer a Karen Lawrence por sua ajuda com a construção seção que descreve da câmara de eletroporação.

<ol>
	<li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design. , (2005).</li><li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genomic regulatory systems : development and evolution. , (2001).</li><li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; signals. , (2002).</li><li>Blow, M. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Eletroporação explante é um meio simples de quantificar cis-regulatórias atividade na retina do rato em desenvolvimento. Comparado com cis-regulatórias análise via transgenia mouse, eletroporação é muito mais barato, exigindo filhotes de rato recém-nascidos só, DNA, instrumentos de dissecação, e eletroporação / equipamentos de cultura de tecidos. É também muito menos tempo consumindo: um experimento requer apenas algumas horas de tempo de preparação, um período de cultura de cerca de oito dias e algumas horas no final do experimento para geração de imagens e análise de dados. Eletroporação explante também é superior à análise de cultura de células baseado em cis-regulatórias desde tecido da retina real é utilizado. A retina desenvolve bastante normalmente em explante cultura faz três distintas camadas celulares (camada nuclear externa, camada nuclear interna e camada de células ganglionares), apesar de fotorreceptores não formulam segmentos externos. Uma outra vantagem é que eletroporação explante é altamente reprodutível. As construções mesmo em retinas electroporated diferentes, mesmo em dias diferentes, geralmente resulta no mesmo nível de expressão relativa. Além disso, como os plasmídeos electroporated são pensados ​​para ser mantida episomally no núcleo e não são incorporados nos cromossomos, que parecem não estar sujeitos aos efeitos da integração mesmo site que atormentam cis-regulatórias análise realizada em camundongos transgênicos. Eletroporação explante tem várias limitações. Primeiro, apenas as células que ainda estão no ciclo celular pode ser eficientemente transduzidas por eletroporação 15. Em P0, varetas e outros mais tarde, nascido tipos de células da retina (células bipolares, células amácrinas, M ller glia) são as populações de células principais visados ​​por este método. Eletroporação de cones fotorreceptores por P0 eletroporação tem sido relatada 16, mas a eficiência parece ser baixa. Uma segunda limitação é que a cultura de explantes além de dois resultados semanas em malformação progressiva da retina e não é recomendada. Se quantificação promotor é necessário em intervalo de tempo final, no entanto, uma eletroporação in vivo 09 de maio será realizada, seguida de dissecção da retina no ponto no tempo desejado, flat-fixação da retina dissecados e quantificação conforme descrito na seção 9. Uma terceira limitação é que este ensaio é apenas moderadamente alto rendimento. Ao contrário dos ensaios de cultura de células-based que pode testar centenas de construções em um único experimento, a técnica descrita neste protocolo requer um mínimo de uma retina do rato por toda construir. Assim, apenas uma dúzia de construções podem ser razoavelmente electroporated em um dia. Uma ressalva adicionais com respeito à quantificação da atividade do promotor com a presente abordagem é que há um potencial para &quot;sangrar-through &#39;de fluorescência DsRed no canal GFP, particularmente quando se examina promotores muito forte. A razão para isto é que o espectro de emissão de DsRed parcialmente idêntica à do GFP. Para contornar esse problema, filtros de emissão otimizada deve ser usado que minimizam a sobreposição espectral entre DsRed e GFP. Quando tal otimizado conjuntos de filtros não estão disponíveis, outra possível solução seria a utilização de uma proteína fluorescente azul-deslocada (por exemplo, BFP ou PCP) em vez de GFP.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Prato eletroporação, MICROSLIDE 453 </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> Ver protocolo seção 1 para modificações </td></tr><tr><td> 100% de borracha de silicone de cimento aquário </td><td> Perfecto Manufacturing </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rack de microtubo de plástico </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Apenas a alça de rack será usado </td></tr><tr><td> Ferramenta Dremel </td><td></td><td></td><td> Para cortar a alça fora do rack tubo de plástico </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> Concentração 100X </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> Para o estoque 1000X, ressuspender a 5mg/ml em HCl 5mM e filtro-esterilize </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 electroporator de onda quadrada </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filtros Nuclepore </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0,2 Hm </td></tr><tr><td> Cultura de tecidos incubadora </td><td></td><td></td><td> 37 ° C, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Lamínulas de vidro # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> 0,16 milímetros de espessura </td></tr><tr><td> Microscópio composto fluorescente equipado com câmera </td><td></td><td></td><td> Câmera deve ser monocromática (por exemplo, ORCA-ER câmera Hamamatsu) </td></tr><tr><td> EGFP / conjunto de filtros para DsRed microscópio composto </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 86007 </td><td> Este conjunto de filtros bleedthrough minimiza entre o chanenels vermelho e verde </td></tr><tr><td> Software ImageJ </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

Fatores de transcrição de genes dentro das redes celulares controlar o padrão espaço-temporal e os níveis de expressão de seus genes-alvo pela ligação a elementos cis-reguladores (CREs), de curta duração (~ 300-600 pb) trechos de DNA genômico, que pode mentir montante, a jusante, ou dentro os íntrons dos genes que controlam. CREs (ie, enhancers / promotores) tipicamente consistem de múltiplos agrupados sítios de ligação para ambos os ativadores e repressores transcripcional 1-3. Eles servem como integradores de lógica de entrada de transcrição dando uma saída unitária na forma de atividade do promotor espaço-temporalmente preciso e quantitativamente exata. A maioria dos estudos de mamíferos cis-regulação, até à data têm contado com transgênese mouse como um meio de doseamento a função realçador de CREs 4-5. Esta técnica é demorado, caro e, por conta dos efeitos local de inserção, em grande parte não-quantitativo. Por outro lado, ensaios quantitativos para a função CRE mamíferos têm sido desenvolvidos em sistemas de cultura de tecidos (por exemplo, dual ensaios luciferase), mas o in vivo relevância destes resultados é muitas vezes incerto. Eletroporação oferece uma excelente alternativa para transgenia mouse tradicional na medida em que permite tanto a avaliação espaço-temporal e quantitativa da cis-regulatórias atividade no tecido vivo em mamíferos. Esta técnica tem sido particularmente útil na análise de cis-regulação no sistema nervoso central, especialmente no córtex cerebral e da retina 6-8. Enquanto eletroporação do mouse na retina, tanto in vivo e ex vivo, foi desenvolvida e amplamente descrito por Matsuda e Cepko 6-7,9, desenvolvemos recentemente uma abordagem simples para quantificar a atividade dos fotorreceptores específicos CREs em electroporated rato retinas 10. Dado que a quantidade de DNA que é introduzido na retina por eletroporação pode variar de experimento para experimento, é necessário incluir um co-electroporated &quot;controle de carga&quot; em todos os experimentos. A este respeito, a técnica é muito semelhante ao ensaio de luciferase dupla utilizada para quantificar atividade do promotor em células em cultura. Quando se examina as fotorreceptoras atividade cis-regulatórias, eletroporação é geralmente realizado em ratos recém-nascidos (dia pós-natal 0, P0) que é o tempo de produção da haste de pico 11-12. Uma vez que os tipos de células da retina tornam-se pós-mitótico, eletroporação é muito menos eficiente. Dada a elevada taxa de nascimento haste em ratos recém-nascidos eo fato de que hastes constituem mais de 70% das células da retina de camundongos adultos, a maioria das células que estão em electroporated P0 são hastes. Por esta razão, os bastonetes são o tipo mais fácil de células da retina para estudar via eletroporação. A técnica aqui descrita é útil principalmente para quantificar a atividade de CREs fotorreceptoras.

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Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Este protocolo descreve uma maneira simples e barata para quantificar a atividade de cis-regulatórias elementos (ie, enhancer / promotores) na vida retinas do mouse via eletroporação explante. Preparação de DNA, a dissecção da retina, eletroporação, a cultura de explantes de retina, e pós-fixação análise e quantificação são descritos.

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

quantifying-activity-cis-regulatory-elements-mouse-retina-explant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

14.4K visualizações.  Washington University School of Medicine. Este protocolo descreve uma maneira simples e barata para quantificar a atividade de cis-regulatórias elementos (ie, enhancer / promotores) na vida retinas do mouse via eletroporação explante. Preparação de DNA, a dissecção da retina, eletroporação, a cultura de explantes de retina, e pós-fixação análise e quantificação são descritos.