Die Autoren bedanken sich bei Karen Lawrence für ihre Hilfe danken, mit dem Abschnitt über Bau der Elektroporation Kammer.

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Explantation Elektroporation ist eine einfache Möglichkeit zur Quantifizierung der cis-regulatorische Aktivität in den Entwicklungsländern Maus Netzhaut. Im Vergleich zu cis-regulatorische Analyse per Maus Transgenese, ist die Elektroporation viel billiger und erfordert nur neugeborenen Maus Welpen, DNA, Sezierbesteck und Elektroporation / Gewebekultur Ausrüstung. Es ist auch weit weniger zeitaufwendig: Ein Experiment erfordert nur ein paar Stunden Vorbereitungszeit, eine Kultur Zeitraum von etwa acht Tage, und ein paar Stunden am Ende des Experiments für die Bildgebung und Datenanalyse. Explantation Elektroporation ist auch überlegen Zellkultur-basierten cis-regulatorische Analyse, da tatsächliche Netzhautgewebe genutzt wird. Die Netzhaut entwickelt ganz normal in Explantation Kultur-und bildet drei verschiedene Zellschichten (äußere Körnerschicht, innere Körnerschicht und Ganglienzellschicht), obwohl Photorezeptoren äußeren Segmente aufwendigen scheitern. Ein weiterer Vorteil ist, dass Explantation Elektroporation ist in hohem Maße reproduzierbar. Das gleiche Konstrukte in verschiedenen Netzhaut elektroporiert, auch an verschiedenen Tagen, führt in der Regel den gleichen relativen Expression. Darüber hinaus, da die Elektroporation Plasmide gedacht werden, um episomal in den Zellkern gehalten werden und sind nicht in Chromosomen integriert, scheinen sie nicht zu unterliegen den gleichen Integrationsstelle Effekte, die cis-regulatorische Analyse in transgenen Mäusen durchgeführt verteufeln. Explantation Elektroporation hat mehrere Einschränkungen. Erstens können nur Zellen, die sich noch in den Zellzyklus effizient transduziert werden durch Elektroporation 15. Bei P0, Stäbe und andere später geboren retinalen Zelltypen (bipolar, Amakrinzellen, M ller Glia) die wichtigsten Zellpopulationen durch diese Methode gezielt. Elektroporation von Zapfen-Photorezeptoren durch P0 Elektroporation wurde vor 16 berichtet, aber die Effizienz scheint gering zu sein. Eine zweite Einschränkung ist, dass Explantation Kultur über zwei Wochen zu einer fortschreitenden Fehlbildung der Netzhaut und wird daher nicht empfohlen. Wenn Promoter Quantifizierung am späten Zeitpunkten erforderlich ist, jedoch eine in vivo Elektroporation 9 durchgeführt, kann durch Netzhaut-Dissektion gefolgt werden an der gewünschten Zeitpunkt, Flachbild-Montage des seziert Netzhaut und Quantifizierung, wie in Abschnitt 9 beschrieben. Eine dritte Einschränkung ist, dass dieser Test nur mäßig hohem Durchsatz ist. Im Gegensatz zu Zellkultur-basierte Assays, dass Hunderte von Konstrukten in einem einzigen Experiment testen können, benötigt die Technik in diesem Protokoll beschriebenen mindestens eine ganze Maus Netzhaut pro Konstrukt. So kann nur ein paar Dutzend Konstrukte vernünftigerweise an einem Tag elektroporiert werden. Eine weitere Einschränkung in Bezug auf die Quantifizierung der Promotoraktivität mit dem vorliegenden Ansatz ist, dass es ein Potential für &quot;Durchschlagen&quot; der DsRed-Fluoreszenz in den GFP-Kanal, vor allem wenn Assay sehr starke Promotoren. Der Grund dafür ist, dass das Emissionsspektrum teilweise mit der von GFP DsRed. Zur Umgehung dieses Problems sollten optimiert Emissionsfilter verwendet werden, minimieren die spektrale Überlappung zwischen DsRed und GFP werden. Wenn eine solche optimierte Filter-Sets nicht verfügbar sind, wäre eine weitere mögliche Lösung sein, um einen blau-verschoben fluoreszierenden Proteins (zB BFP oder CFP) statt der GFP zu verwenden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Elektroporation Gericht, MicroSlide 453 </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> Siehe Protokoll Abschnitt 1 für Änderungen </td></tr><tr><td> 100% Silikon Aquarium Zement </td><td> Perfecto Fertigung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plastic Mikroröhrchen Rack </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Nur das Gestell Griff verwendet werden </td></tr><tr><td> Dremel </td><td></td><td></td><td> Zum Schneiden der Griff aus dem Kunststoffrohr-Rack </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100X-Konzentration </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> Für 1000X Aktien, zu 5mg/ml in 5mM HCl und Filter-sterilisiert resuspendieren </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Square-wave Elektroporator </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Filter </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0,2 um </td></tr><tr><td> Gewebekultur-Inkubator </td><td></td><td></td><td> 37 ° C, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Deckgläser # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> 0,16 mm dick </td></tr><tr><td> Fluoreszierende Verbindung Mikroskop mit Kamera ausgestattet </td><td></td><td></td><td> Kamera sollte einfarbig (zB ORCA-ER-Kamera von Hamamatsu) werden </td></tr><tr><td> EGFP / DsRed-Filter-Set für zusammengesetzte Mikroskop </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 86007 </td><td> Dieser Filter gesetzt minimiert Übersprechen zwischen den roten und grünen chanenels </td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

Transkriptionsfaktoren innerhalb der zellulären Gen-Netzwerke Kontrolle der raum-zeitlichen Muster und Ebenen des Ausdrucks ihrer Zielgene durch Bindung an cis-regulatorischen Elemente (Cres), kurz (~ 300-600 bp) erstreckt sich von genomischer DNA, die sich stromaufwärts liegen kann, stromabwärts oder innerhalb die Introns der Gene, die sie kontrollieren. Cres (dh, Enhancer / Promotoren) bestehen typischerweise aus mehreren gruppierten Bindungsstellen für beide Transkriptionsaktivatoren und Repressoren 1-3. Sie dienen als logische Integratoren von Transkriptions-Eingang gibt eine einheitliche Ausgabe in Form von raumzeitlich präzise und quantitativ exakt Promotoraktivität. Die meisten Studien von Säugetier-cis-Regelung bis dato auf Maus Transgenese als Mittel zur Untersuchung der Enhancer-Funktion von Cres 4-5 verlassen. Diese Technik ist zeitaufwendig, kostenintensiv und wegen der Insertionsstelle Effekte weitgehend nicht quantitativ. Auf der anderen Seite, haben quantitative Tests für Säugetier-CRE-Funktion in Gewebekultur-Systemen (zB Dual-Luciferase-Assays) entwickelt worden, aber die in-vivo-Relevanz dieser Ergebnisse ist oft ungewiss. Die Elektroporation bietet eine hervorragende Alternative zu herkömmlichen Maus Transgenese in dem Sinn, dass sowohl raum-zeitliche und quantitative Bewertung der cis-regulatorische Aktivität in lebenden Säugetiergewebe. Diese Technik ist besonders nützlich bei der Analyse von cis-Regelung in das zentrale Nervensystem, vor allem in der Hirnrinde und der Netzhaut 6-8. Während Maus Netzhaut Elektroporation, sowohl in vivo und ex vivo, entwickelt worden ist und ausgiebig von Matsuda und Cepko 6-7,9 beschrieben, haben wir kürzlich einen einfachen Ansatz, um die Aktivität der Photorezeptor-spezifischen CREs in elektroporiert Maus Netzhaut 10 quantifizieren entwickelt. Da die Menge an DNA, die in der Netzhaut durch Elektroporation eingebracht wird, kann von Experiment zu Experiment variieren, ist es notwendig, eine Zusammenarbeit elektroporiert &quot;loading control &#39;in allen Experimenten sind. In dieser Hinsicht ist die Technik sehr ähnlich wie die Dual-Luciferase-Assay verwendet, um die Promotoraktivität in kultivierten Zellen zu quantifizieren. Wenn Testen Photorezeptor cis-regulatorische Aktivität, ist die Elektroporation in der Regel in neugeborenen Mäusen (postnatalen Tag 0, P0), die zum Zeitpunkt der Spitze Stab Produktion 11-12 wird durchgeführt. Sobald retinalen Zelltypen werden post-mitotischen, ist die Elektroporation viel weniger effizient. Angesichts der hohen Rate der Stange Geburt in neugeborene Mäuse und die Tatsache, dass Stäbe mehr als 70% der Zellen in der adulten Maus Netzhaut bilden, sind die Mehrzahl der Zellen, die bei P0 elektroporiert sind Stäbe. Aus diesem Grund sind Stäbchen-Photorezeptoren der einfachste Netzhaut Zelltyp über Elektroporation zu studieren. Die Technik, die wir hier beschreiben, ist in erster Linie sinnvoll für die Quantifizierung der Aktivität von Photorezeptoren Cres.

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Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, um die Aktivität von cis-regulatorischen Elemente (dh Enhancer / Promotoren) in lebenden Maus Netzhaut via Explantation Elektroporation zu quantifizieren. DNA-Präparation, Netzhaut-Dissektion, die Elektroporation, Netzhaut-Explantat-Kultur, und nach der Fixierung Analyse und Quantifizierung beschrieben.

Die Quantifizierung der Aktivität von Cis-Regulatorische Elemente in der Maus Retina durch Explantation Elektroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

quantifying-activity-cis-regulatory-elements-mouse-retina-explant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

14.3K Aufrufe.  Washington University School of Medicine. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, um die Aktivität von cis-regulatorischen Elemente (dh Enhancer / Promotoren) in lebenden Maus Netzhaut via Explantation Elektroporation zu quantifizieren. DNA-Präparation, Netzhaut-Dissektion, die Elektroporation, Netzhaut-Explantat-Kultur, und nach der Fixierung Analyse und Quantifizierung beschrieben.