Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Gongpu Zhao e Danxia Ke per il supporto tecnico. Ringraziamo Drs. Edward Egelman e Niko Grigorieff per condividere il loro software di elaborazione delle immagini. Riconosciamo anche il personale che assiste la biologia strutturale Cryo-EM struttura e cluster Beowulf e griglia presso l&#39;Università di Pittsburgh School of Medicine. Questo lavoro è stato sostenuto da GM082251 e GM085043.

1. Frozen-idratata EM campione preparazione Perché l&#39;HIV-1 proteina del capside (CA) assemblee 9 ​​sono stabili solo in sale alta (1M NaCl) tampone, che contribuisce forte rumore di fondo in Cryo-EM immagini, si usa una rapida diluizione e back-side metodo assorbente per ridurre temporaneamente il sale concentrazione nella preparazione del gelato-idratata griglia EM. <ol><li> Glow discharge il lato di carbonio di 200-mesh R2 / 1 griglie di rame Quantifoil sotto 25mA per 25 secondi. </li><li> Utilizzare un nebulizzatore per portare l&#39;umidità nella camera ambientale, un fatto in casa stantuffo gravità manuale, al 80%. </li><li> Nella FEI Vitrobot pistone dewar, fresco etano liquido con azoto liquido. Montare il tuffo-congelamento dewar sul pistone gravità manuale. </li><li> Applicare 2,5 ml di soluzione CA preassemblati sul lato di carbonio della griglia, che è montato su pinza, e caricare la pinza sul pistone con il lato di carbonio della griglia di fronte lontano da voi. </li><li> Aggiungere 3 ml di tampone a bassa diluizione di sale (100 mM NaCl) per la parte posteriore della griglia e asciugare immediatamente tamponando la parte posteriore della griglia con un pezzo di carta da filtro. L&#39;intera superficie posteriore della griglia dovrebbe essere a stretto contatto con la carta da filtro per circa 6 secondi, prima di rimuovere la carta da filtro. Immediatamente tuffo la griglia in etano liquido dopo aver rimosso la carta da filtro. </li><li> Rimuovere la pinza dal pistone e trasferire rapidamente la griglia in un contenitore griglia. </li></ol> 2. Crio-microscopio elettronico di CA assemblee tubolari <ol><li> Caricare il frozen-idratata griglia in una Polara microscopio FEI G2 operativo di elettroni a 200kV e dotato di una fotocamera Gatan 4Kx4K CCD. </li><li> Sotto basse dosi-modalità di ricerca, con un ingrandimento di circa 200x e con una dose &lt;0.001e - / A 2, la griglia schermo intero per le zone con ghiaccio idonee e salvare la posizione di queste aree in un file di scena. </li><li> Ricordiamo le posizioni salvate e schermo ulteriormente queste aree con un ingrandimento di 3.900 x in basse dosi-modalità di ricerca. Selezionare le aree con un uniforme, sottile strato di ghiaccio contenente ben separati, lunghi tubi sopra i buchi, per la raccolta dati. Salva la posizione di queste aree in un file di seconda fase. </li><li> Passa alla modalità di esposizione con un ingrandimento di 59.000 x, inserto di 100 micron apertura obiettivo, e regolare la stigmatism obiettivo e l&#39;intensità del fascio per una dose di ~ 15 e - / a 2 per l&#39;esposizione. </li><li> Tornare alla modalità a basso dosaggio di ricerca, passare a una posizione salvata e di identificare e centro di un tubo di buona con la fotocamera CCD. Passare alla modalità di messa a fuoco, regolare il fuoco, e impostare un valore di defocus, normalmente tra 0,5 e 2,5 micron. Passare alla modalità di esposizione, impostare un tempo di esposizione di 0.3-0.5 secondi, per una dose di 15 e - / A 2, e raccogliere un&#39;immagine. Le immagini sono raccolte in una fotocamera piatto, e il film dovrebbe essere permesso di stabilirsi per 10 secondi prima che l&#39;esposizione sia preso. </li><li> Passare alla posizione successiva salvati e ripetere il passaggio 5 per raccogliere altre immagini. </li><li> I film sono sviluppati in piena forza D19 per 12 minuti e digitalizzati utilizzando un Nikon Super Coolscan 9000 ED Scanner con una dimensione dei pixel di 6,35 micron. Il formato di file di immagine TIFF è. </li></ol> 3. Elicoidale indicizzazione Un oggetto elicoidali possono essere indicizzati da due parametri: l&#39;ordine di Bessel, n, e la linea il numero di livelli, l. Ogni linea di livello nella trasformata di Fourier, in quanto caratterizzato da (n, l), corrisponde a un insieme di linee sul reticolo superficie dell&#39;oggetto elicoidale indicati con (h, k) gli indici, utilizzando la notazione da un reticolo 2D. Per ogni (h, k), una (n hk, l hk) linea strato è una combinazione lineare di due vettori di base (n = 10, l 10) e (n 01, l 01), che sono i valori di n e l le due linee principali strato (1, 0) e (0, 1). litri è disponibile presso l&#39;altezza della linea strato misurato lungo l&#39;asse Z la trasformata di Fourier. Il valore di n può essere stimato utilizzando la seguente equazione 10 πRr ≈ J n ≈ 1.1 | n | -0,9 .....................( 1) dove J n è la funzione di Bessel, che determina l&#39;intensità della linea n ° strato, r è il raggio dell&#39;oggetto elicoidale, e R è il raggio della massima ampiezza della linea strato. Il numero di riga strato, l, è legato al n per la regola di selezione 11 l = tn + um ....................( 2) dove t e u sono costanti dell&#39;elica. Per qualsiasi elica data, ci possono essere unità esattamente u esattamente (o molto vicino) t complete giri. <ol><li> Box in un tubo relativamente dritto e lungo con diametro uniforme utilizzando il programma di EMAN 12 helixboxer e salvare l&#39;immagine in formato MRC. </li><li> Determinare la distanza elicoidale ripeto, c, utilizzando un cross-correlazione programma basato, come &#39;imgccf&#39;, nel pacchetto MRC 13. </li><li> Calcolare la trasformata di Fourier con una lunghezza nuova scatola che è parte integrante della distanza ripeto, c. </li><li> Scegliere due linee principali strati che definiscono due vettori di base reticolo superficiale (1,0) e (0,1). </li><li> Misurare il raggio del tubo, r, e l&#39;altezza e il raggio delle due linee principali strato in trasformata di Fourier, L 10, R 10, L 01 ​​R 01, rispettivamente (Fig. 1). </li><li> Calcolare n 10 e n 01 secondo l&#39;equazione (1). </li><li> Dal momento che n valori sono solo stime, alcune combinazioni di n 10 en 01 sono testati nelle fasi successive (vedere il punto 4.2) per trovare la corretta simmetria elicoidale IHRSR utilizzando il pacchetto di programmi. </li><li> Calcolare la simmetria vite descritto da due numeri reali: la rotazione tra subunità (Δφ) e la crescita assiale (Δz) di one-stella elica (n = 1). Dato l 10, l 01, n 10, n 01 e ​​valori, u e t può essere ottenuta con test un intervallo di valori m (per esempio, -50 &lt;m &lt;50) secondo la regola di selezione. Infine, Δφ e Δz sono calcolati utilizzando Δφ = 360 t / u e Δz = c / u. </li></ol> 4. Ricostruzione tridimensionale <ol><li> Particelle di segmentazione <ol><li> Aprire una micrografia contenente particelle elicoidale, con il Boxer grafica del programma, che è un programma nel pacchetto EMAN. </li><li> Tagliare la particella elicoidale in segmenti che si sovrappongono. Nel pannello di controllo di Boxer, scegliete la modalità Helix e impostare i parametri per il pugilato: la dimensione della casella deve essere maggiore del diametro della particella e il valore per &#39;Olap&#39; dovrebbe essere ~ 90% della dimensione del box. </li><li> Dopo aver lasciato clic su entrambe le estremità della particella elicoidale, Boxer genera automaticamente una serie di caselle particella lungo la lunghezza elica. </li><li> Salva segmenti in scatola e le loro coordinate. </li></ol></li><li> Iniziale ricostruzione 3D utilizzando programmi IHRSR <ol><li> Invertire il contrasto della Cryo-EM immagini e applicare filtri passa-basso 14 (opzionale) prima del trattamento con il metodo iterativo elicoidale reale ricostruzione spazio (IHRSR). </li><li> Aprire l&#39;interfaccia grafica del programma IHRSR digitando &quot;Generator&quot;. Forniscono l&#39;interfaccia grafica con tutte le informazioni per la pila in scatola particelle, incluso il nome e il percorso dello stack, il numero di immagini in stack, i valori per i parametri di simmetria, ecc Clicca su &quot;Fine&quot; per creare lo script ricostruzione, b25.spi. </li><li> Utilizzare un cilindro pieno o vuoto come riferimento iniziale e consentire la procedura di ciclo fino a quando non ci sono cambiamenti nella simmetria vite definito, che si verifica in genere dopo pochi cicli. Una simmetria elicoidale destra dovrebbe dare una ricostruzione stabilmente convergente. La ricostruzione generata nel ciclo verrà utilizzato come riferimento iniziale per un ulteriore affinamento. IHRSR esegue ricostruzione 3D tramite programmi di SPIDER. </li></ol></li><li> Ricostruzione con raffinamento iterativo 15 La ricostruzione 3D generato da IHRSR è ora utilizzato come riferimento iniziale per ulteriore affinamento. Durante la raffinatezza, la simmetria elicoidale è fissata a Δφ e Δz, che sono determinati dalla procedura IHRSR. <ol><li> Determinare la defocus e presente astigmatismo nella micrografia utilizzando programmi CTFFIND3 e CTFTILT 16. </li><li> Moltiplicare i segmenti delle particelle dal CTF utilizzando programmi SPIDER 17. L&#39;operazione denominata FT nella suite SPIDER è utilizzata per calcolare la trasformata di Fourier (FFT) dell&#39;immagine 2D. Successivamente, la FFT è moltiplicato per i valori CTF, determinati nei passi precedenti, con l&#39;operazione denominata MU all&#39;interno della suite SPIDER. Il valore ottenuto viene poi trasformata inversa di nuovo per formare una nuova immagine (CTF-corrected) nello spazio reale utilizzando l&#39;operazione SPIDER, FT di nuovo. </li><li> Eseguire corrispondenza proiezione confrontando proiezioni dei volumi di riferimento con il CTF-correzione delle immagini, con riferimento multi-allineamento. La variazione in out-of-plane angolo di inclinazione è limitata a + / -10 ° e campionato di 1 °. Introdurre vincoli, come ad esempio i coefficienti di correlazione elevata, nel piano angoli vicino a 0 ° o 180 ° e limitati x-turni, per i parametri di allineamento di ogni segmento. Includere nella ricostruzione solo i segmenti che soddisfano i vincoli. </li><li> Dopo ogni ciclo iterativo raffinatezza, una ricostruzione 3D viene generato utilizzando la proiezione posteriore e somma divisa per il CTF2. </li><li> Imporre la simmetria elicoidale di generare un volume simmetrizzate. Il raffinamento iterativo termina quando nessun ulteriore miglioramento nella risoluzione della nuova ricostruzione 3D si verifica. </li><li> L&#39;elaborazione dell&#39;immagine SPIDER pacchetto viene utilizzato per la maggior parte dei passi di raffinamento. Una serie di operazioni sono controllate da script SPIDER, che sono file creati dall&#39;utente controllo batch contenente sequenze di operazioni e di valori dei parametri. La ricostruzione finale viene calcolato utilizzando programmi in SPIDER suite. </li></ol></li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Un singolo di HIV-1 CA A92E tubo (Fig. 1a) era fuori in scatola e la sua trasformata di Fourier (Fig. 1b) è stata calcolata per l&#39;indicizzazione elicoidale. Per linee strato (1, 0) e (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Dato un raggio del tubo di 211.57Å, abbiamo approssimato n 10 =- 12, n 01 = 11 (qui, la prepotenza era predeterminato). Con una distanza di ripetere 5195.48Å, la simmetria vite del tubo è stato determinato come Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz e Δφ erano raffinato per 7.1321Å e 328,86 ° con IHRSR (Fig. 2a) e la ricostruzione iniziale è mostrato in fig. 2b. La ricostruzione finale (Fig. 3), dopo il raffinamento iterativo, ha migliorato la mappa densità significativamente dal modello iniziale calcolato con IHRSR (Figura 2b). <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Indicizzazione di HIV-1 tubo CA elicoidale. (A) Un singolo virus HIV-1 CA immagine tubo A92E. Scala grafica, 30 nm. (B) La trasformata di Fourier del tubo mostrato in (A). Gli indici elicoidale (n = 10 =- 12, n 01 = 11) sono indicati. I punti di punta di freccia alla linea di livello alla risoluzione 23A. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Una prima ricostruzione utilizzando IHRSR. (A) simmetria determinazione a vite per ogni ciclo iterativo. Δφ e Δz, a partire dai valori iniziali, convergono ai valori stabili dopo 10 cicli iterativi raffinatezza. (B) La mappa 3D di densità iniziale dopo 10 cicli iterativi. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. La mappa 3D di densità dopo il raffinamento iterativo. (AC) La mappa densità di CA tubi viene visualizzato come tre fette ortogonali: parallela all&#39;asse del tubo e vicino alla superficie (A), perpendicolare all&#39;asse del tubo (B), e la parallela e attraverso l&#39;asse del tubo (C) . Barre di scala, a 10 nm. (D) il rendering di superficie della mappa 3D di densità sagomato a 1.8s racchiude 100% vol.

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	<li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice.">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern.">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li><li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method:+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers.">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li><li>Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-Actin+Is+a+Helix+with+a+Random+Variable+Twist.">F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist.</a> Nature. 298, 131-135 (1982).</li><li>Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+model+of+the+microtubule.">High-resolution model of the microtubule.</a> Cell. 96, 79-88 (1999).</li><li>Jimenez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structure+of+an+SH3+amyloid+fibril+and+model+of+the+molecular+packing.">Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.</a> Embo J. 18, 815-821 (1999).</li><li>Butler, P. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+particle+of+tobacco+mosaic+virus+from+RNA+and+disks+of+protein.">Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein.</a> Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).</li><li>Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+core+and+central+channel+of+bacterial+flagella.">Structure of the core and central channel of bacterial flagella.</a> Nature. 342, 648-654 (1989).</li><li>Byeon, I. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Convergence+between+Cryo-EM+and+NMR+Reveals+Intersubunit+Interactions+Critical+for+HIV-1+Capsid+Function.">Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function.</a> Cell. 139, 780-790 (2009).</li><li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction.">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li><li>Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+I.+Indexing+of+diffraction+patterns.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns.</a> Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening.">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+electron+cryo-microscopy:+towards+atomic+resolution.">Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.</a> Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).</li><li>Sachse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens:+A+fresh+look+at+Tobacco+Mosaic+Virus.">High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus.</a> J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state.">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vi presentiamo una serie di protocolli per fornire un approccio diretto per ottenere strutture 3D di oggetti elicoidali. Usando le procedure descritte, abbiamo acquisito una struttura 3D di HIV-1 di assemblaggio del capside da un&#39;immagine singolo tubo (176 segmenti). Strutture ad alta risoluzione può essere ottenuto inserendo i dati delle immagini più. Ci sono diversi punti critici per ottimizzare la raccolta e analisi dei dati: in primo luogo, durante la preparazione di un Cryo-EM campione, la soluzione campione deve essere cancellato, lasciando una divisa, sottile strato di soluzione che è leggermente più spesso rispetto alla dimensione del campione. Ci sono diversi modi per cancellare il campione. Per le cellule batteriche e campioni tubolari, come l&#39;HIV-1 CA di montaggio, cancellando da un lato, in particolare dal lato posteriore, è più appropriato. In secondo luogo, la prepotenza della spirale deve essere determinato, in quanto questo non può essere fatto con l&#39;indicizzazione elicoidale o ricostruzione. Una pratica comune è quella di utilizzare freeze-etching, seguita da rotante shadowing 18 a determinare la manualità. Manualità può essere determinata anche post-ricostruzione quando la risoluzione della mappa di densità è sufficientemente alto, i modelli 3D atomici dei singoli componenti dovrebbe inserirsi bene nella mappa della densità quando una manualità corretta è assunto. Altrimenti, la prepotenza opposto dovrebbe essere assunto. In terzo luogo, un filtro Wiener deve essere usato durante l&#39;elaborazione delle immagini, sia per la correzione di fase e ampiezza, per ridurre l&#39;amplificazione del rumore. Dal momento della CTF da una singola immagine è sempre zero crossing, parte delle informazioni nello spazio reciproco è perduto. Pertanto, è necessario disporre di dati più set di proiezione 3D incluso per la ricostruzione, ognuno ripreso a valori defocus diversi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Fonte </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Glow-scarico dispositivo 100X </td><td> Glow-scarico dispositivo 100X </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 microscopio con una pistola Field Emission </td><td> FEI, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K x 4K telecamera CCD </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Tuffo-congelamento dispositivo </td><td></td><td> Fatto in casa manuale stantuffo gravità </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 mesh holely-carbonio griglie di rame </td><td> Quantifoil Micro Strumenti, Jena, Germania </td><td></td></tr><tr><td> EM software EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM software IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Programmi disponibili da Edward H. Egelman </td></tr><tr><td> EM software Spider </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC base elicoidale software di elaborazione </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Programmi disponibili da Koji Yonekura </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT e Real-space software raffinatezza elicoidale </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure of hiv-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction

Cryo-microscopia elettronica (cryo-EM), combinata con l&#39;elaborazione delle immagini, è uno strumento sempre più potente per la determinazione della struttura di complessi proteici macromolecolari e assiemi. In realtà, solo la microscopia elettronica di particelle 1 e bidimensionali (2D) cristallografia elettroni 2 sono diventati metodologie relativamente di routine e un gran numero di strutture sono stati risolti con questi metodi. Allo stesso tempo, l&#39;elaborazione delle immagini e tridimensionali (3D) la ricostruzione di oggetti elicoidale si è rapidamente sviluppata, in particolare, il iterativo elicoidale nello spazio reale ricostruzione (IHRSR) metodo 3, che utilizza solo strumenti di analisi delle particelle in collaborazione con simmetria elicoidale. Molte entità biologiche funzione in forme filamentose o elicoidali, tra filamenti di actina 4, microtubuli 5, fibre amiloidi 6, virus del mosaico del tabacco 7, e flagelli batteri 8, e, perché una mappa 3D di densità un&#39;entità elicoidale può essere raggiunta da un&#39;unica proiezione immagine, rispetto alle molte immagini necessarie per la ricostruzione 3D di un oggetto non-elicoidale, con il metodo IHRSR, l&#39;analisi strutturale di tali assiemi flessibili e disordinato elicoidale è ora raggiungibile. In questo articolo video, forniamo protocolli dettagliati per l&#39;ottenimento di una mappa 3D di densità di un assemblaggio di proteine ​​elicoidale (HIV-1 capside 9 è il nostro esempio), compresi i protocolli per Cryo-EM preparazione dei campioni, a bassa dose di raccolta dati da parte di Cryo-EM, l&#39;indicizzazione di modelli di diffrazione elicoidali, e l&#39;elaborazione delle immagini e la ricostruzione 3D utilizzando IHRSR. Rispetto ad altre tecniche, Cryo-EM offre la conservazione ottimale del campione in condizioni quasi nativa. I campioni sono incorporati in un sottile strato di ghiaccio vitreo, di congelamento rapido, e ripreso in microscopi elettronici alla temperatura dell&#39;azoto liquido, in condizioni di basse dosi di ridurre al minimo i danni da radiazioni. Immagini di esempio sono ottenuti in condizioni quasi nativa a discapito di segnale basso e basso contrasto nel micrografie registrato. Fortunatamente, il processo di ricostruzione elicoidale è stato in gran parte automatizzato, con l&#39;eccezione di indicizzazione del modello elicoidale di diffrazione. Qui, descriviamo un approccio alla struttura dell&#39;indice elicoidale e determinare simmetrie elicoidale (parametri elicoidale) da micrografie digitalizzati, un passo essenziale per la ricostruzione 3D elicoidale. In breve, si ottiene una mappa 3D di densità iniziale applicando il metodo IHRSR. Questa mappa iniziale è poi iterativamente raffinato con l&#39;introduzione di vincoli per i parametri di allineamento di ogni segmento, controllando così la loro gradi di libertà. Un ulteriore miglioramento si ottiene attraverso la correzione per la funzione di trasferimento contrasto (CTF) del microscopio elettronico (correzione di ampiezza e fase) e ottimizzando la simmetria elicoidale del gruppo.

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Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Questo articolo descrive un metodo per ottenere un modello tridimensionale (3D) struttura delle molecole elicoidale assemblati con crio-microscopia elettronica. In questo protocollo, utilizziamo gruppi di HIV-1 capside per illustrare la procedura dettagliata ricostruzione 3D per ottenere una mappa della densità del iterativo elicoidale reale spazio metodo di ricostruzione.

Struttura del virus HIV-1 Assemblee Capsidico da Cryo-microscopia elettronica e iterativo ricostruzione elicoidale reale spazio

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

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JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. Questo articolo descrive un metodo per ottenere un modello tridimensionale (3D) struttura delle molecole elicoidale assemblati con crio-microscopia elettronica. In questo protocollo, utilizziamo gruppi di HIV-1 capside per illustrare la procedura dettagliata ricostruzione 3D per ottenere una mappa della densità del iterativo elicoidale reale spazio metodo di ricostruzione.

Video: Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

Valutazione della immunologicamente rilevanti dinamiche Caratteristiche strutturali del terziario di HIV-1 sequenza R2 Loop Corona V3 da Ab initio Pieghevole

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

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Immunologia e infezioni

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Forno a microonde Assist diagnosi rapida di malattie virali piante da microscopia elettronica a trasmissione

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Pronostico di HIV-1 Uso corecettore (tropismo) mediante analisi della sequenza utilizzando un approccio genotipica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In uncoating vitro di HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrazione di attività del virus HIV-1 preintegrazione Complessi

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...