We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

1. Cryo-titolare di preparazione e manutenzione NOTA: La stazione di pompaggio a secco, composto da una stazione di pompaggio turbo e uno o più controllori stadio freddi, viene utilizzato principalmente per tre scopi: a) è un luogo sicuro per memorizzare i titolari cryo quando non vengono utilizzati. Il modo corretto per memorizzare i titolari è di lasciarli nella stazione sotto vuoto. b) far evaporare l&#39;accumulo gelo e l&#39;umidità che si verifica quando l&#39;azoto liquido viene rimosso dal dewar e la punta del supporto cryo esposta; ciò si ottiene con il ciclo di riscaldamento. c) Per rigenerare l&#39;essiccante zeolite, e di ottenere un elevato vuoto nei dewar cryoholder. Ciò è necessario per tenere una temperatura costante quando facendo microscopia cryo elettronico. <ol><li> Ciclo di riscaldamento. <ol><li> Inserire il supporto cryo in una delle porte di pompaggio della stazione di pompaggio. Collegare uno dei tubi di evacuazione verso l&#39;uscita di metallo sotto la valvola del vuoto del titolare. FareAssicurarsi che tutte le valvole sulla stazione (V1, V2, e V3) e sul supporto crio sono chiusi. </li><li> Accendere il controller palco freddo e collegarlo al titolare attraverso il cavo di controllo. Accendere l&#39;interruttore di alimentazione della stazione di pompaggio turbo. </li><li> Avviare l&#39;opzione ciclo Warm-up nel controllore fase fredda. Quando il vuoto nella stazione di pompaggio turbo legge 10 -3 Torr o meglio, aprire la valvola a farfalla V2, attendere che il vuoto si stabilizza, e quindi aprire la V1 valvola a farfalla. </li><li> Eseguire il ciclo di riscaldamento per circa 30 minuti fino a quando la temperatura nel supporto è stabile sopra i 20 ° C. Chiudere V1, e quindi fermare il ciclo. </li></ol></li><li> Ciclo Zeolite. Eseguire il Ciclo Zeolite Tra 4 ore e O / N prima di una sessione CryoEM, e una volta a settimana se non in uso. <ol><li> Avviare l&#39;opzione ciclo di zeolite e selezionare il tempo necessario per raggiungere un buon vuoto, nel range di 1-2 x 10 -4 Torr, e tempo di attesa così lunga. Quando il vuoto raggiunge 10 -3Torr, aprire la valvola dewar evacuazione, V3. La stazione di pompaggio poi evacuare la linea al titolare; attendere il vuoto stabilizza. </li><li> Aprire la valvola sul supporto cryo. Quando il ciclo è completo, chiudere le valvole nell&#39;ordine opposto in cui sono stati aperti: la valvola sul supporto, poi V3, V2, e infine V1. Spegnere la stazione di pompaggio turbo e il controller fase fredda, e staccare il supporto crio dal controller fase fredda e la stazione di pompaggio turbo. </li></ol></li></ol> 2. Griglia di preparazione <ol><li> Pulizia. NOTA: Quando si utilizzano griglie bucate commerciali, si raccomanda di pulirli prima dell&#39;uso, in modo da rimuovere eventuali residui di polimero che è stato utilizzato nel processo di fabbricazione. Fate questo in una capsula di Petri in vetro con 5 strati di carta filtro previste nella parte inferiore. <ol><li> Posizionare le griglie sulla carta da filtro con il lato rivolto verso l&#39;alto carbonio bucata. </li><li> Utilizzando un vetro pipetta Pasteur, bagnare la carta con alcune gocce of cloroformio intorno alle griglie fino a che non appena iniziano a galleggiare. </li><li> Coprire la capsula di Petri con il coperchio leggermente aperto in una cappa aspirante O / N. </li></ol></li><li> NOTA: il supporto di carbonio sottile (punti 2.2-2.3) può essere omesso come strato di ghiaccio può essere formato direttamente attraverso i piccoli fori nella griglia di carbonio bucata. <ol><li> Utilizzando un paio di pinzette, fendere un pezzo di mica per esporre due nuove superfici. Posizionare le nuove superfici esposte di mica faccia-up su un pezzo di carta bianca in una capsula di Petri. </li><li> Porre la capsula Petri nella campana di un evaporatore di carbonio. Avviare la sequenza della pompa verso il basso fino a vuoto è inferiore a 2 x 10 -6 Torr. Per evaporare eventuali impurità sulla superficie dell&#39;asta di carbonio, eseguire un pre-evaporazione con il piatto Petri coperta. Poi in onda la campana e rimuovere il coperchio dalla piastra di Petri. </li><li> Eseguire la sequenza pompa finché il vuoto è inferiore a 10 -6 Torr e rivestire la mica con uno strato sottile (~ 5 nm) di carbonio. Usare la protezione degli occhi durante carbonioevaporazione. Monitorare lo spessore del film di carbonio dal buio risultante sulla carta che era stato posto sotto i fogli di mica. </li></ol></li><li> Trasferire il Carbon Thin al TEM griglia. <ol><li> Tagliare un 0,5 x 1 cm pezzo di mica rivestite e galleggiare il carbonio sulla superficie piatta filtrata, acqua deionizzata. Usare carta per lenti ottiche per ottenere una superficie di acqua piatta. Usando le pinzette, mettere il lato bucata carbonio della griglia a contatto con la superficie superiore dello strato di carbonio variabile e raccoglierlo. </li><li> Ripetere i punti 2.3.1 e 2.3.2 fino sono preparati un numero sufficiente di griglie. </li></ol></li><li> Glow Discharge. NOTA: La scarica luminescente converte il livello di carbonio rivestimento naturale idrofobico delle griglie in idrofila. Questo passaggio è facoltativo. <ol><li> Posizionare le griglie con il lato rivolto verso l&#39;alto di carbonio su un vetrino 7,5 x 2,5 cm coperto con parafilm. Inserirlo nella camera delle attrezzature bagliore-scarico e chiudere la camera. </li><li> Pompala campana e glow-scarico per 20 sec a 25 mA e 7 x 10 -2 mbar. NOTA: Durante questo periodo un bagliore viola luce diventa visibile. Rimuovere il vetrino con le griglie e utilizzarle entro 1 ora, altrimenti, dovranno essere scaricate nuovamente bagliore. </li></ol></li></ol> 3. Il campione Plunge congelamento NOTA: Usare occhiali di sicurezza e scarpe adeguate quando si utilizza questo strumento per proteggere azoto ed etano spruzzi di liquido. <ol><li> Accendere l&#39;apparecchio-tuffo congelamento. Riempire il serbatoio umidificatore con acqua distillata. Impostare la temperatura desiderata, l&#39;umidità relativa e condizioni tuffanti per tempo blot, forza Blot e tempo di adsorbimento (22 ° C, 95%, 2 sec, 2 e 40 sec nell&#39;esempio presentato qui). Porre nuova carta da filtro assorbente. </li><li> Raffreddare il contenitore etano dal riempimento del serbatoio esterno con azoto liquido fino stabilità è ottenuta (circa 10 min). Una volta che l&#39;azoto liquido si arresta boiling, posizionare la punta del tubo proveniente dal serbatoio etano nella camera interna e aprire la valvola molto lentamente. Liquefare il etano nella camera interna e riempirlo a 1 mm dalla sommità. Evitare il congelamento del etano. ATTENZIONE: l&#39;etano è estremamente infiammabile ed esplosiva. </li><li> Assicurarsi che le pinzette sono allineati all&#39;interno dell&#39;apparato tuffo di congelamento. </li><li> Accendere l&#39;umidità. Caricare una griglia sui pinzette, e caricare 3-5 ml di campione sulla superficie di carbonio (lato opaco) della griglia bucata. Attendere il campione adsorbire alla rete ed eseguire il blotting per raggiungere un sottile strato liquido. </li><li> Flash-congelare la griglia immergendola in etano liquido. Rimuovere il gruppo pinzette-grid dal etano liquido tenendo le pinzette costantemente, e trasferirlo alla camera esterna con azoto liquido. Trasferire la griglia per una piccola scatola griglia immersi in azoto liquido. Assicurarsi di mantenere il campione vetrificata in azoto liquido per tutto il tempo durante il trasferimento sia al serbatoio di stoccaggioo al titolare di crio. NOTA: scatole di griglia possono essere memorizzati in una grande capacità (35-50 L) dewar di azoto liquido per almeno 1 anno. Per immagazzinaggio conveniente possono essere poste in un tubo da 50 ml Falcon con due fori nella parte superiore e una lenza attaccato al suo tappo che può essere tirato dalla bocca del dewar. </li></ol> 4. Trasferire la Cryo-griglia per la TEM <ol><li> Inserire il supporto crio nella workstation crio-trasferimento. Fare attenzione a non danneggiare la punta del supporto durante l&#39;inserimento. Controllare la presenza di piccole fibre e polvere sull&#39;asta e l&#39;O-ring del titolare cryo utilizzando una lente, se c&#39;è qualche rimuovere con carta per lenti ottiche. </li><li> Riempire il dewar del titolare cryo ed il vaso workstation con azoto liquido. Evitare di versare l&#39;azoto liquido utilizzando l&#39;imbuto intrappolato che viene fornito con la workstation. </li><li> Collegare il titolare cryo al controllore fase fredda per monitorare la temperatura, e continuare ad aggiungere azoto liquido e #160, fino a quando la temperatura si stabilizza a circa -194 ° C. Assicurarsi che il livello di azoto liquido è sotto il livello della tenuta di vuoto sia nel vaso dewar workstation e il supporto cryo. Pre-raffreddare le pinzette griglia, l&#39;anello di clip e la punta smussata dello strumento anello clip sulla workstation. Anche pre-raffreddare un insieme di grandi pinzette e un cacciavite in un altro dewar riempito con azoto liquido. </li><li> Trasferire rapidamente la casella della griglia crio contenente le griglie idratati congelati all&#39;azoto liquido nella workstation utilizzando i grandi pinzette. Aprire la scatola della griglia crio con il cacciavite, prendere la griglia idratata congelato e inserirlo nella fessura porta-campioni. </li><li> Posizionare l&#39;anello clip sulla parte superiore della griglia e premere delicatamente con la punta smussata dello strumento anello fermaglio fino a quando non si blocca in posizione. Chiudere la crio-otturatore. Rimuovere la scatola strumenti e crio griglia dalla workstation. </li><li> Spostare l&#39;intera stazione di lavoro con il supporto e la griglia per la console microscopio per miniMize il tempo di trasferimento della griglia in aria ambiente. </li><li> Top fuori il TEM anti-contaminante con azoto liquido, precedentemente riempito e raffreddato per almeno 20 min. Pre-tilt palco microscopio a -60 °. NOTA: Questo minimizzare la perdita di azoto liquido come il supporto viene inserito nella camera di compensazione. </li><li> Iniziare il ciclo camera di compensazione pre-pompa sul microscopio. Assicurarsi che la valvola a cannone elettronico è chiuso (soprattutto se si tratta di un FEG TEM). Attendere che la sequenza di camera di decompressione pre-pompa per finire (circa 2 minuti) prima di inserire il supporto crio. NOTA: Questo è indicato dalla luce rossa sul palco in fase di estinzione. </li><li> Inserire il supporto nel compartimento stagno e ruotarlo di 90 ° in senso orario; collegare il cavo di controllo fase fredda al titolare cryo per controllare la temperatura. Attendere finché la luce rossa si spegne e ruotare sia il palco e il supporto nella posizione 0 ° per inserire il supporto nel hi del TEMcolonna sotto vuoto gh. </li><li> Assicurarsi che la temperatura non scende mai al di sopra -160 ° C per evitare la formazione di ghiaccio cristallino. </li><li> Riempire il dewar del titolare crio. Attendere 15 - 45 min fino a quando il titolare ha equilibrato termico e il vuoto TEM ha recuperato prima di registrare le immagini. </li><li> Se viene rilevato bubbling del azoto liquido, modificare l&#39;altezza di riempimento azoto liquido, o toccare delicatamente l&#39;origine spumeggiante con un batuffolo di cotone. </li></ol> 5. Low-dose di Data Collection NOTA: La tecnica di raccolta dei dati a basso dosaggio è utilizzato per ridurre il danno da radiazione di elettroni al campione limitando l&#39;esposizione a 20 elettroni / Å 2. Questo risultato è ottenuto alternando tra tre configurazioni: &quot;cercare&quot;, con basso ingrandimento (~ 5,000X) e ampio campo visivo, &quot;messa a fuoco&quot;, con alto ingrandimento (~ 150,000X) e un piccolo campo di vista, e di &quot;esposizione&quot;, con la magni finale desideratozione e contenente l&#39;area di interesse da registrare. Blank la trave in una modalità all&#39;altra. <ol><li> Impostare il TEM e il programma a basso dosaggio <ol><li> Ritrarre la crio-otturatore e aprire le valvole di colonna. </li><li> Centrare il palco e impostare l&#39;altezza eucentrica (Z) con il wobbler alpha al rock alla fase ± 15 °. Regolare la posizione Z fino a quando non c&#39;è movimento apprezzabile mentre lo stadio è a dondolo. Attivare il programma a basso dosaggio e selezionare il rivelatore per ciascuna modalità. </li><li> Nel modo di esposizione trovare una zona della griglia che non ha di carbonio, regolare l&#39;illuminazione selezionando l&#39;apertura del condensatore e posto dimensione ottimale in modo che l&#39;area da registrare è completamente illuminata. Assicurati di diffondere il fascio in direzione overcondensation. </li><li> In modalità di ricerca, trovare un piccolo caratteristica che sarà facilmente identificabile a maggiore ingrandimento. Nel modo di esposizione, centrare questa funzione con il joystick (il controller XY). Inizia a basso ingrandimento, se l&#39;impresaure non è nel campo di vista. </li><li> In modalità di ricerca, portare questa caratteristica al centro del campo con la dose xy controlli bassi spostamento immagine. Vai a modo di esposizione e spostare la caratteristica lungo l&#39;inclinazione dell&#39;asse mediante il joystick finché è fuori della zona da registrare (0,5-3 micron). Vai modalità per mettere a fuoco e centrare la funzione utilizzando i comandi di spostamento immagine xy. Inizia ingrandimento minore se la caratteristica non è nel campo di vista. </li><li> Mantenere il raggio centrata in ogni momento. </li></ol></li><li> Raccolta dati <ol><li> Ritrarre la crio-otturatore e aprire le valvole di colonna. Attivare il programma a basso dosaggio. </li><li> In modalità di ricerca, individuare una piazza griglia contenente sottile, ghiaccio omogenea. </li><li> Selezionare un apposito foro e posizionarlo nel centro del campo. Passare alla modalità di messa a fuoco e mettere a fuoco l&#39;immagine. Poi underfocus l&#39;immagine tra 0,5-4,5 micron. </li><li> Passa alla modalità di esposizione e registrare l&#39;immagine. </li><li> Passa alla modalità di ricerca e ripetere i passaggi 5.2.3-5.2.4.Spostare di fronte alla piazza della griglia evitando pre-esposizione buoni fori da registrare. </li><li> Finire la piazza della griglia e passare a un altro buono. </li><li> Regolare l&#39;altezza (Z) e proseguire la raccolta dei dati. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

TEM seguita da SPA ha contribuito molte strutture 3D macromolecolari, avvicinandosi 2.000 voci nella EMDB metà 2014. In generale, per un dato macromolecola, una struttura 3D bassa risoluzione viene determinata dai dati NS, che può essere seguita da una a più alto Struttura risoluzione cryoEM 3D. L&#39;elevato contrasto dei confini molecolari fornite da NS, che facilita la prima ricostruzione 3D, viene successivamente raffinato da cryoEM con la sua capacità di mappare la struttura interna della macromolecola nel suo stato completamente idratato, e la possibilità di raggiungere risoluzione molto più elevata. Un altro vantaggio del cryoEM è l&#39;eliminazione dello stress disidratazione che potrebbe provocare il collasso della macromolecola. Inoltre, vi è la possibilità di omettere il supporto di carbonio, che elimina gli effetti di assorbimento possibile superficiali e mostra la conformazione che la macromolecola adotta in soluzione. Colorazione Cryo-negativi, una combinazione di cryoEM e NS, offre alto contrasto in un completamente hydvalutazione campione e può anche portare alla ricostruzione 3D utilizzando SPA, tuttavia è stato utilizzato meno frequentemente, con meno di 10 voci EMDB, in parte perché la macchia si può interferire con l&#39;integrità della macromolecola 31. Altri due tecniche TEM favorevoli alla ricostruzione 3D sono elettroni 2D cristallografia e tomografia elettronica. 2D elettroni cristallografia richiede un cristallo planare o tubolare; diffrazione elettronica del cristallo è utilizzato per la ricostruzione in 3D che potrebbe condurre alla risoluzione atomica 32. In tomografia elettronica di campioni fissati vetrificati o tradizionalmente, un componente macromolecola o sub-cellulare è ruotato all&#39;interno del TEM per successiva ricostruzione tomografica 33, con il vantaggio che oggetti singolari possono essere ricostruiti; Tuttavia attualmente questa tecnica ha un limite di risoluzione che varia da 40 a 20 Å 34,35. Tra tutte queste tecniche TEM molecolari, SPA di NS e cryoEM dati è stato il più diffusoutilizzato. Il protocollo qui illustrato è dedicato ad ottenere immagini cryoEM adatte per l&#39;analisi SPA; tuttavia la maggior parte del protocollo è applicabile ai cryoEM di 2D cristalli e campioni tomografiche anche. Una sessione cryoEM successo dipende dal successo combinato di molti passaggi critici; aspetti importanti da tenere a mente, spiegazione dei manufatti cryoEM comuni e come evitarli sono descritte nei paragrafi seguenti. Questa sezione descrive anche le linee guida per la raccolta dati per ottenere ricostruzioni 3D di alta qualità utilizzando il metodo SPA. Evitare transizione cristallina del ghiaccio. Un aspetto centrale è che il campione ha bisogno di rimanere in stato vetroso dal momento del-crio precipitare tutta l&#39;osservazione TEM. Così dopo immergendo il campione in etano liquido tutte le fasi successive vengono eseguite azoto liquido (-196 ° C) o elio liquido (-269 ° C) le temperature. Il riscaldamento sopra -135 ° C trasforma l&#39;acqua in vitreoall&#39;acqua cristallina; poi riarrangiamenti macromolecolari possono aver luogo e cristalli d&#39;acqua dominano l&#39;immagine (figura 3A); il campione deve essere eliminata. Accidental campione warm-up potrebbe accadere se crio-precipitare, il trasferimento della rete congelata tra i contenitori (anche se protetto da un gridbox), e / o inserimento titolare crio nel TEM sono troppo lenti, o se le pinzette di movimentazione non erano sufficientemente pre- raffreddato. Deterioramento vuoto significativo nella TEM su crio-trasferimento (l&#39;aria in entrata le trappole fredde campione più caldo) può anche riscaldare il campione. Infine, over-irraggiamento del campione potrebbe anche provocare transizione cristallina ghiaccio. Ridurre al minimo la contaminazione di ghiaccio. Dato il piccolo volume di campione (3-5 ml) applicato alla griglia TEM, evaporazione potrebbe concentrare i componenti tampone (sale, detergenti) e quindi incidere integrità macromolecolare inclusa la perdita dello stato multimerico. Un alto tasso di umidità relativa (RH) microambiente o camera circumvents questo problema. In alternativa, crio-precipitare può essere fatto in una stanza fredda ambientale sufficientemente ventilata. Dopo cryo precipitare RH dovrebbe essere la più bassa possibile per evitare contaminazioni ghiaccio o condensa dell&#39;umidità ambientale sulla crio-griglia, come crio-griglia stessa agisce come una trappola fredda. La contaminazione Ice è composto da particelle con elevato contrasto e nessuna struttura con dimensioni che vanno tra ~ 5 nm e diversi micron che interferiscono con o addirittura totalmente bloccano l&#39;immagine. Evitare correnti d&#39;aria, parlando / respirando verso la crio-grid durante il trasferimento aereo, e ridurre ambiente RH. Aprire i contenitori di azoto liquido con acqua condensata (visibili come particelle sospese bianchi) dovrebbero essere scartati. Massimizzare macromolecolari orientamenti / vista. Per il supporto del campione, una scelta da fare è tra i veri griglie bucata e carbonio sottile su griglie bucata. Questo dipende (i) come campione estende su pellicola di carbonio rispetto ai fori di carbonio, (ii) disponibili campione concentration, come fori nudi possono richiedere una concentrazione superiore al 100X supporto carbonio per una densità simile particelle sull&#39;immagine (da ~ 0,02-2 mM), e (iii) come casuale è la distribuzione di orientamenti macromolecola. Si noti che scarica a bagliore, che rende il idrofila carbonio, avrà un effetto importante in tutti e tre gli aspetti e che questo sarà dipende dal campione. Per quanto riguarda l&#39;orientamento della macromolecola, mentre una vista ricorrente è desiderabile per la determinazione strutturale iniziale ricostruzione conica casuale casualità di vista macromolecolari è desiderabile quando raffinazione ricostruzione 3D per risoluzioni più elevate. Nel nostro esempio, RyR1 interagisce con il carbonio con un favorito vista &#39;quattro volte&#39; (Figura 2D) e richiede griglie bucata per casualità di orientamenti e di una risoluzione più alta 36. Massimizzare SNR. La strategia migliore per aumentare SNR è quello di ridurre le fonti di rumore di fondo. Ghiaccio eccessivospessore e (se presente) lo spessore del film di carbonio al di là di ciò che è necessario per sostenere e incorporare la proteina aggiungerà rumore extra. Così spessore del ghiaccio deve essere ridotta al minimo necessario controllando blotting tempo, pressione, umidità, e la qualità della carta filtro. Per il supporto di carbonio, un sottile (~ 5 nm) pellicola di carbonio è stratificata sulla spessa pellicola di carbonio bucata: la spessa carbonio bucata fornisce resistenza meccanica mentre il campione viene ripreso sul foro sottile di carbonio-coperto. D&#39;altra parte, si noti che estremamente sottile ghiaccio e / o carbonio può provocare un supporto facilmente rotto che può trasformarsi in un nastro (Figura 3D). Per massimizzare SNR, i componenti tampone non necessari dovrebbero essere evitati. Per proteine ​​di membrana, il detergente prende un tributo significativo contrasto (vedere Figura 2D, pannello di destra). Inoltre, riducendo la tensione superficiale del detergente cambia il modo in cui il campione si estende sul supporto. Alcune proteine ​​di membrana richiedono la presenza di lipidi oltre che al detergent, che riduce ulteriormente il contrasto. Per superare questo campione può essere diluito in un tampone con concentrazione di detersivo inferiore e senza lipidi appena prima crio-precipitare 37. Nuovi detergenti alternativi 16 e l&#39;uso di nanodisks 38 per stabilizzare la componente di dominio transmembrana appaiono approcci di successo per l&#39;imaging di proteine ​​di membrana cryoEM. Sforzatevi per immagini di alta qualità e si preparano per la correzione CTF. Provini vetrificati richiedono alti valori di sfocatura per generare un&#39;immagine sufficienti (fase) di contrasto cui il CTF, la funzione che riguarda l&#39;intensità di frequenza, ha diverse transizioni a zero, a quel punto non c&#39;è informazioni. Mentre la correzione CTF non è necessario per bassa risoluzione ricostruzione 3D, quando si punta per la risoluzione più alta, per recuperare una rappresentazione accurata dell&#39;oggetto 3D, le immagini con differenti defoci devono essere raccolti in modo che computazionale correzione CTF può essere fatto.Determinazione CTF e correzione è inclusa nei principali pacchetti software SPA 4-7; dettagli possono essere trovati altrove 39. Per la correzione ottimale CTF, utilizzare una serie di defoci. Una buona strategia è quella di alternare tra 3-4 valori di sfocatura. I valori dipendono dalle dimensioni della macromolecola (dimensioni maggiori richiedono meno sfocatura), lo spessore del ghiaccio / carbonio (campione diluente richiede meno sfocatura), e la tensione (tensione inferiore richiede meno sfocatura). Per 200 kV, una buona gamma di partenza di valori è 2,5, 3, 3,5 e 4 micron sfocatura. La CTF manifesta come alternando anelli di alta e bassa intensità (Thon anelli 40) nella rappresentazione spazio reciproco, lo spettro di potenza. Visualizzazione dello spettro di potenza rivelerà il potenziale di risoluzione; la frequenza della più ampia anello visibile Thon è il più vicino priori una stima della risoluzione ottenibile. Lo spettro di potenza deve essere controllato periodicamente, e astigmatici (non circolare) anelli Thon (Figura 3C) deve essere corretta con l&#39;stigmator obiettivo. Anelli Thon devono essere visibili, almeno fino alla risoluzione desiderata. Un set di dati cryoEM ottenuti usando questo protocollo può essere elaborato direttamente dalla SPA al fine di generare una ricostruzione in 3D. Anche con un campione ideale, la qualità della ricostruzione 3D dipenderà dalla prestazioni e specifiche degli apparecchi TEM, e sulla elaborazione delle immagini. Con i continui miglioramenti in entrambi i fronti, e con menzione speciale per i rivelatori di elettroni diretti recentemente sviluppati, la possibilità di ottenere ricostruzioni 3D a risoluzione atomica più coerente è più vicino di quanto non lo sia mai stato.

L&#39;obiettivo di cryoEM è ottenere elettroni immagini microscopiche di macromolecole nel loro stato idratato nativo. In virtù di incorporare macromolecola in acqua vetrificata, un campione congelato-idratato può essere introdotto direttamente e visualizzato nello strumento TEM. Vitrificazione, realizzato da Flash congelamento (10.000 o C / sec), si blocca il campione senza cristallizzazione dell&#39;acqua e assicura che riarrangiamenti molecolari durante il congelamento sono insignificanti. L&#39;eccesso di elettroni dispersione del campione rispetto al buffer circostante fornisce una piccola ma sufficiente contrasto per vedere la macromolecola in assenza di qualsiasi macchia 1. Elaborazione delle immagini computerizzato può quindi essere utilizzato per ricreare struttura 3D della macromolecola. Grandi macromolecole nella gamma ~ 500 kDa- più MDa sono campioni ideali per cryoEM (che rappresentano oltre l&#39;80% della microscopia elettronica Data Bank (EMDB) voci); questi includono proteine, complessi di proteine, acidi nucleici proteine-complexes e proteine ​​di membrana incorporati in un doppio strato. Queste macromolecole sono meno probabilità di essere cristallizzato (con meno di 2 voci% nel database PDB) eppure è spesso il caso che i pezzi più piccoli risolti da cristallografia a raggi X o NMR possono essere ancorate nella busta 3D creato da cryoEM. D&#39;altro canto, alcune delle più grandi strutture risolti da cryoEM sono identificabili all&#39;interno della cellula intera sezioni sottili TEM 2. Così, cryoEM colma il gap dimensioni e la risoluzione tra strutture subcellulari e atomiche. CryoEM meglio riflette struttura nativa della macromolecola rispetto al metodo più classico di colorazione negativa (NS), dove la macromolecola è disidratata e circondato da uno strato di metallo pesante macchia cui regione di esclusione macchia crea un forte contrasto immagine &quot;negativo&quot; 3. In entrambi i casi il fascio elettronico produce immagini 2D proiezione delle macromolecole, dette particelle, dove le shape dipende dall&#39;orientamento della macromolecola rispetto al fascio di elettroni. Molti particelle, almeno ~ 1.000 e senza limite superiore, possono essere analizzati sul computer con &#39;analisi singola particella&#39; (SPA) software per aumentare il rapporto segnale rumore (SNR) se media, e per trovare i parametri di orientazione spaziale del particolato necessari per ricreare la macromolecola struttura 3D da retroproiezione 4-7. NS, con una maggiore SNR, viene utilizzato per la caratterizzazione preliminare del campione e per generare un novo ricostruzione de 3D; risoluzione difficilmente supera 20 Å, imposto dalla disidratazione e dimensioni del grano metallo pesante. In generale, per la determinazione strutturale cryoEM 3D, una ricostruzione in 3D a bassa risoluzione viene prima ottenuto da NS e quindi cryoEM viene utilizzato per definire questa bassa risoluzione mappa iniziale di studiare ulteriormente la macromolecola nel suo stato nativo idratato, per vedere la sua struttura interna, e per aumentare la sua risoluzione. Note che se il modello NS è stato distorto (l&#39;esempio più comune è appiattimento derivante dalla disidratazione 8) e le particelle cryoEM avuto basso SNR, quindi la distorsione potrebbe portare nel modello cryoEM (l&#39;artefatto modello pregiudizi, che è comune a basso SNR dataset 9). Distorsione strutturale comporterebbe disallineamento tra le NS e particelle prime cryoEM e tra le particelle cryoEM prime e corrispondenti risalti del modello 3D ortogonale alla direzione appiattimento. Polarizzazione modello può risolvere da solo come il modello 3D subisce cicli di affinamento successivi. Se ciò si verifica, che verrebbe rilevato come la mancanza di corrispondenza tra particelle cryoEM prime e corrispondenti risalti dal modello 3D, poi un modello de novo dovrebbe essere costruita dai dati cryoEM. Un buon approccio potrebbe essere quello di utilizzare l&#39;algoritmo ricostituzione angolare 10, che può produrre diversi volumi 3D possibili, e quindi utilizzare il modello NS 3D per scegliere il miglior modello possibile cryoEMche sarà ulteriormente raffinato 11. Una strategia ancora migliore è quello di aumentare il SNR del dataset cryoEM (vedi sezione dedicata nella discussione). La qualità biochimica della macromolecola purificato ha una massima influenza il risultato finale. La macromolecola, purificata da tessuti o espressi in sistemi eterologhi, deve avere un elevato grado di purezza e di essere strutturalmente intatto. Essa non deve formare aggregati né dovrebbe disaggregare. Per definire una particolare conformazione, le condizioni di preparazione dovrebbero promuovere uno stato conformazionale uniforme. Per studiare complessi, è che la loro ottimale k D è nell&#39;intervallo nM, altrimenti fissativi sono stati utilizzati con successo per stabilizzare interazioni affinità inferiori 12,13. Immagini cryoEM trasformati producono preziose informazioni sulle dimensioni, schema generale, stato di aggregazione / multimerizzazione, l&#39;omogeneità e la struttura interna del macromolecule. Tuttavia il potenziale della tecnica è notevolmente migliorata con l&#39;elaborazione delle immagini. Una struttura 3D mostra l&#39;architettura generale della macromolecola, 3D posizione di ligandi e subunità, cambiamenti conformazionali, e consente di aggancio delle strutture atomiche determinati dalla cristallografia a raggi X o NMR. La quantità di informazioni di una ricostruzione in 3D aumenta gradualmente la risoluzione è aumentata: in genere 15-20 risoluzione Å consente attracco inequivocabile di strutture atomiche, a 9-10 eliche Å alfa sono visibili come canne, a 5 Å è possibile discernere fogli beta, e con una risoluzione di 3.5 Å e migliore è possibile costruire un modello atomico 14. La possibilità di ottenere immagini informative e una ricostruzione 3D utilizzando SPA da relativamente piccole quantità di campione fare cryoEM una tecnica attraente, come 3-5 microlitri di almeno 0,05 mg / ml sono sufficienti per preparare una griglia TEM. I requisiti minimi strumentaliper cryoEM sono una crio-stantuffo fatta in casa o commerciale, un microscopio elettronico con alto vuoto ultra, supporti di registrazione di immagini e kit a basso dosaggio, un crio-porta con la sua stazione di pompaggio, un apparato scarica luminescente e un evaporatore. Caratteristiche non essenziali, ma ulteriormente desiderabili sul TEM sono camera CCD (presente in tutti i moderni TEM) o un rilevatore elettronico diretto, pistola emissione di campo (FEG), filtro di energia, e software di raccolta dati ad alta velocità. Questo software in linea di principio consente la raccolta di decine di migliaia di particelle in una singola sessione cryoEM 15, tuttavia i maggiori esigenze di archiviazione dei dati e la successiva supervisione necessità tempo di post-elaborazione per essere presi in considerazione. FEG combinata con la funzione di trasferimento di contrasto (CTF) di correzione alla base la maggior parte delle ricostruzioni in 3D che ha raggiunto una risoluzione sufficiente per visualizzare alfa eliche. A quel punto, il livello di risoluzione è anche dipende dal campione: raggiungendo il 10 risoluzione Å è meno comune per le proteine ​​di membrana che, sealto ordine di simmetria è presente, risoluzione atomica è più realizzabile. Il recente sviluppo di rivelatori di elettroni diretti ha permesso la risoluzione atomica anche per macromolecole con bassa (4x) o no la simmetria, dove la qualità delle mappe di densità elettronica cryoEM soddisfa questi derivano da dati di raggi X diffrazione 16,17. Esempi pratici che illustrano le funzionalità della tecnica sono forniti qui per quattro importanti tipi di macromolecole dove cryoEM ha un ruolo principale Continuando nella loro determinazione strutturale. (I) Con la loro simmetria icosaedrica che aumenta il set di dati da parte di 60 volte e le loro grandi dimensioni che permette fedele e allineamento riproducibili, le strutture di diversi virus icosaedrici sono state risolte a risoluzione quasi atomica per cryoEM seguita da SPA 18. Mostriamo un esempio di una classe di virus icosaedrici, i virus adeno-associati (AAV), per i quali le strutture quasi-atomiche per cryoEM e per cryoEM / x-ray hyMetodi brid esistono 19,20. (Ii) macromolecole con struttura elicoidale includono microtubuli, filamenti e virus. I loro unità ripetitive lungo l&#39;asse elicoidale possono essere analizzati da una versione più complessa di SPA adattato alla geometria elicoidale 21. Nell&#39;esempio mostriamo virus del mosaico del tabacco (TMV), un virus a RNA che è stato risolto alla risoluzione atomica da cryoEM 22. (Iii) le proteine ​​solubili grandi sono stati ampiamente studiati. Tra questi, macromolecole formano cilindri multimerici simmetrici costituiscono un&#39;architettura ricorrente spesso risolti con risoluzione subnanometer 23,24. Qui vi mostriamo le immagini di KLH, un vettore di ossigeno invertebrato, dove un modello molecolare ibrido è stato creato da cryoEM / x-ray metodi cristallografia ibridi 25. (Iv) le proteine ​​di membrana sono un&#39;importante classe di proteine; costituiscono circa 1/3 delle proteine ​​codificate dal genoma umano, ma sono difficili da caratterizzare strutturalmente causa di complessità associate con transmembrane stabilizzazione dominio 26, che costituiscono meno del 1,5% delle strutture risolti mediante qualsiasi tecnica strutturale combinato. Il ruolo di cryoEM e 3D ricostruzione nel loro determinazione strutturale è esemplificata con il recettore rianodina (RyR), una grande eucariotico intracellulare Ca 2+ canale importante nella contrazione muscolare e segnalazione cervello. Le strutture più alte risoluzione cryoEM fino ad oggi, con risoluzione 10 Å, rivelano struttura secondaria 27.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="661">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:243px;">Ethane</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">371745</td>
			<td style="width:167px;">99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:243px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27135</td>
			<td style="width:167px;">99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5326</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mica sheets, 1 x 4 cm</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Graphite rods, presharpened size 1/8&#8221; dia x 2 &#188;&#8221; long tip 0.039&#8221; dia neck type</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">70220-45</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">350 ml cryo-dewars</td>
			<td style="width:132px;">Pope</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8600</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids&#160; Quantifoil</td>
			<td style="width:132px;">Quantifoil</td>
			<td style="width:119px;">Q10525</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids C-Flat</td>
			<td style="width:132px;">Protochips</td>
			<td style="width:119px;">CF-1.2/1.3-4C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Glow discharge device</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Model E7620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Turbo pumping station</td>
			<td style="width:132px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;">Model 655</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Carbon evaporator</td>
			<td style="width:132px;">Denton Vaccum</td>
			<td style="width:119px;">Model 502B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Freeze plunger</td>
			<td style="width:132px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/ctf</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software EMAN</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:243px;">Image Processing software Spider</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software Freealign&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">3D visualization software Chimera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Native Keyhole Limpet Hemocyanin</td>
			<td style="width:132px;">Biosyn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts of cryo-electron microscopy: a primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3d reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Esecuzione accurata di tutte le fasi di protocollo indicati in figura 1 consente la visualizzazione di congelati idratati, macromolecole non macchiato. Risultati sono mostrati per quattro campioni rappresentativi con diverse caratteristiche strutturali. Le loro immagini microscopiche ottenuti con i metodi di NS e cryoEM vengono confrontati (Figura 2). Immagini (i) NS di AAV5 rivelano particelle virus-simili di circa 130 Å di diametro. La coesistenza di strutture pieni e vuoti corrisponde a rotture (che consentono l&#39;ingresso macchia) e capsidi strutturalmente intatti, rispettivamente. CryoEM mostra strutture uniformemente vuoti; anzi queste particelle virali non contengono materiale genetico 28. NS mostra particelle rotonde predominanti mentre cryoEM mostra particelle quasi esagonali, che riflette la loro forma icosaedrica. (Ii) Le immagini dei elicoidali TMV mostrano barre di diametro 180 Å e di lunghezza variabile, spesso più di 0,1 micron, con una ripetizione elicoidale di 23 Å visibile siain NS e in cryoEM. Il canale centrale 40 Å è pieno di macchie nelle immagini NS e vuote nelle immagini cryoEM. (Iii) Native KLH, una didecamer di 8 MDA assembla in botti caratteristici di 350 Å di diametro e 400 di lunghezza Å. NS e cryoEM rivelano KLH di viste laterali rettangolari e circolari end-on vista. Entrambe le tecniche rivelano sei striature perpendicolari all&#39;asse di simmetria e le unità morfologiche equispaziate all&#39;interno di ciascuna fila. CryoEM rivela una struttura interna vuota. (Iv) il recettore rianodina, un grande canale intracellulare tetramerica di 2,26 MDA è visto come un quadrato di 275 x 275 Å 2. Caratteristiche di superficie Intricato, come una croce centrale e una depressione centrale manifesta come l&#39;accumulo di macchie da NS, e le regioni a bassa densità di cryoEM. Mentre NS mostra contrasto simile in tutti i quattro campioni testati, confronto dei pannelli cryoEM espone il SNR inferiore (contrasto) di RyR1 per la presenza di detersivo per solubilizzare la proteina di membrana. Tipici esempi di manufatti cryoEM sono indicati per RyR1: ghiaccio cristallino, la contaminazione di ghiaccio, astigmatismo, e le strutture web-like (Figura 3). Le loro cause e prevenzione sono ulteriormente descritti nella sezione di discussione. SPA e 3D ricostruzione di frozen-idrato RyR1 rivela la sua struttura simmetrica quadruplice, che riflette l&#39;organizzazione homotetrameric della proteina (Figura 4A). Il dominio citoplasmatico costituisce un prisma quadrato di 275 x 275 x 120 Å 3 e contiene diversi domini globulari riproducibili che formano una struttura di ponteggio-like. Il dominio transmembrana forma un piccolo prisma di piazza affusolata con dimensioni massime 115 x 115 x 60 A 3. Alle 10 la risoluzione Å è possibile visualizzare eliche alfa (Figura 4B). Mappatura differenza 3D può rivelare la posizione di ligandi importanti, in questo caso la differenza mappa 3D di FKBP12, un conside 12 kD proteinarosso una subunità di RyR1, si sovrappone RyR1 (Figura 4C) 29. Infine, cambiamenti conformazionali forniscono una visione dinamica della macromolecola. In questo caso RyR1 precedentemente stabilizzato in condizioni chiuso o aperto rivela una traslocazione massa dalla chiuso allo stato aperto (Figura 4D) 27. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di flusso della tecnica della microscopia elettronica a cryo. Il diagramma evidenzia le principali fasi del protocollo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig2.jpg" /> Figura 2. Confronto tra NS e cryoEM per una varietà di campioni. (A) AAV5, un virus icosaedrica. (B) TMV, un virus elicoidale. Inserti mostrano la ripetizione elicoidale di 23 Å. (C) Native KLH. (D) RyR1; vista rappresentativi sono evidenziati (f, vista quattro volte e s, vista laterale). Tutti i campioni vengono esposte a condizioni dosi basse e allo stesso ingrandimento di 50,000X un sotto una tensione di accelerazione di 200 kV. Bar Scala, 10 nm. Tutti i campioni sono NS sul sostegno di carbonio, campioni cryoEM A, C, D sono in carbonio sottile sopra quantifoil, e il campione cryoEM B è direttamente sopra i fori quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig3.jpg" /> Figura 3. Galleria di immagini che mostrano manufatti cryoEM comuni su un campione RyR1 cryoEM. (A) Crystalline contaminazione (frecce). Ghiaccio. (B) Ice (C) astigmatismo. RyR1s nell&#39;immagine astigmatico sono appena visibili. L&#39;inserto a destra mostra la SPECT potererum dell&#39;immagine con anelli Thon asimmetrici. L&#39;inserto a sinistra mostra lo spettro di potenza di un&#39;immagine non astigmatica per riferimento. (D) le strutture Web-like. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig4.jpg" /> Figura 4. CryoEM e 3D ricostruzione del recettore rianodina. . (A) rappresentazione isosurface (B) Docking di una struttura cristallina di RyR1 di N-terminale 30 che mostra un buon accordo tra le coordinate atomiche e la busta cryoEM; frecce indicano due eliche alfa che sporgono dalla struttura. Arrowhead indica una delle quattro eliche che circondano il poro del canale ionico. Le linee tratteggiate indicano i confini della membrana. (C) RyR1 e 3D lozione del legante FKBP12 (colore arancione). (D) cambiamenti conformazionali di RyR1 nel corso della chiusa (arancione) all&#39;aperto (nero mesh) conformazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Cosa fare e cosa non fare di Cryo-microscopia elettronica: A Primer su preparazione del campione e raccolta dati di alta qualità per la ricostruzione macromolecolare 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

45.7K Views.  Virginia Commonwealth University. This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Video: Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Assemblaggio, carico, allineamento e di una cella analitica del campione Ultracentrifuga

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Ricerca

Biologia

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA microarray: Esempio di controllo della qualità, ibridazione e scansione di array

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal colony. Proper collection of tissues for further histological processing can impact the quality of testing results. This article describes the conduct of a basic gross examination including identification of heart, liver, lungs, kidneys, and spleen, as well as how to collect those organs. Additionally four of the more difficult tissue/sample collection techniques are demonstrated. Lung collection and perfusion can be particularly challenging as the tissue needs to be properly inflated with a fixative in order for inside of the tissue to fix properly and to enable thorough histologic evaluation. This article demonstrates the step by step technique to remove the lung and inflate it with fixative in order to achieve optimal fixation of the tissue within 24 hours. Brain collection can be similarly challenging as the tissue is soft and easily damaged. This article demonstrates the step by step technique to expose and remove the brain from the skull with minimal damage to the tissue. The mesenteric lymph node is a good sample type in which to detect many common infectious agents as enteric viruses persist longer in the lymph node than they are shed in feces. This article demonstrates the step by step procedure for locating and aseptically removing the mesenteric lymph node. Finally, identification of infectious agents of the respiratory tract may be performed by bacterial culture or PCR testing of nasal and/or bronchial fluid aspirates taken at necropsy. This procedure describes obtaining and preparing the respiratory aspirate sample for bacterial culture and PCR testing.

This article describes the procedures for conducting a basic postmortem examination of a mouse or rat, and the collection of basic organs, as well as more challenging sample types from for histological, microbiological, and PCR evaluation.

Necroscopia diagnostica e selezionati Collezione di tessuti e campioni di ratti e topi

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualizzazione di compattazione del DNA nei cianobatteri tramite tomografia ad alta tensione Cryo-elettrone

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.