Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del National Institutes of Health e del Beckman Research Institute della Città della Speranza. Vorremmo ringraziare i revisori per i loro commenti costruttivi che aggiunge chiarezza al manoscritto.

1. HO-stimolato traslocazione frequenze <ol><li> Inoculare 10-20 culture indipendenti 1 ml di YPGly / Lac media (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 3% glicerolo e lattato 3%) con singole colonie del genotipo desiderato. Incubare le culture durante la notte, o per il tempo sufficiente a raggiungere una densità cellulare di circa 7-5x10 1x10 8 cellule / ml, a 30 ° C su un rotore, o con agitazione. </li><li> Aggiungi galattosio alle culture ad una concentrazione finale del 2% per indurre HO endonucleasi-diretto presso il DSB his3-Δ3 &#39;(cromosoma III) e his3-Δ5&#39; (cromosoma XV) substrati traslocazione. </li><li> Incubare per 4 ore a 30 ° C su un rotore, o con agitazione. </li><li> Dopo 4 h, diluizioni appropriato delle culture su YPD (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 2% di destrosio) per produrre circa 100 a 200 colonie per piastra, e un numero sufficiente di cellule su istidina medio manca di produrre un osservabile Il suo numero di colonie + ricombinante. Incubare le piastre a 30 ° C per 2-3 giorni. </li></ol> NOTA: Passo 1,4 descrive la determinazione delle frequenze traslocazione in condizioni di placcatura selettiva delle culture su terreno istidina carente. Questa analisi può anche essere condotto sotto non selettivi condizioni di placcatura culture su YPD, e poi replica-plating le colonie che sorgono sul suo piastre-due-tre giorni dopo. Questi metodi producono frequenze simili di traslocazione (Figura 2C). <ol start="5"><li> Determinare la frequenza traslocazione dividendo il numero di colonie prototrophic istidina per il numero totale di cellule vitali placcato (determinato da diluizioni placcatura in YPD). Determinare la frequenza mediana traslocazione e il 95% intervallo di confidenza 15. </li></ol> 2. Placcatura efficienze <ol><li> Rimozione di una aliquota di cellule da ogni cultura un giorno all&#39;altro, e di determinare il numero di cellulare da emocitometro conteggio (Baxter Healthcare Corporation del catalogo #:. B3178-1). </li><li> Piastra di circa 100 a 200 cellule utilizzando una diluizione appropriata sul YPD. Incubare per 2-3 giorni a 30 ° C (es. Per una cultura con una densità cellulare di 1x10 8 cellule / ml, si dovrebbe piatto 100-200 ml di una diluizione 10-5 per piastra). </li><li> Aggiungere 20% galattosio alle culture ad una concentrazione finale del 2%. </li><li> Dopo 4 ore, rimuovere un aliquota di cellule da ogni cultura, determinare il numero delle cellule dal conte emocitometro, e la piastra di circa 100 a 200 cellule utilizzando una diluizione appropriata sul YPD. Incubare per 2-3 giorni a 30 ° C. </li><li> Determinare l&#39;efficienza placcatura dividendo il numero di colonie che appaiono sul YPD per il numero di cellule placcato, e moltiplicando questo quoziente per 100. Determinare la percentuale media con un intervallo di confidenza al 95%. </li></ol> 3. Genomica Southern blot <ol><li> Selezionare una singola sua colonia ricombinante + indipendente da ogni prova e prepararsi DNA genomico 16. </li><li> Digest circa 4 mg di DNA con endonucleasi di restrizione BamHI. </li><li> Separare BamHI digerito frammenti su un 0,7% gel, e trasferimento in una membrana di nylon carica positiva (Hybond N +, GE Healthcare Codice prodotto:. RPN303B) 17. </li><li> Ibridare con un P-32 etichettata sonda ottenuto da innesco casuale (Amersham Biosciences Codice prodotto:. RPN1604) con 1,8 kb BamHI / BamHI clone genomico contenente il gene HIS3. </li><li> Visualizza frammenti di DNA mediante autoradiografia o phosphorimaging. </li></ol> 4. Blot analisi cromosomica con cromosomi separati in un profilo-bloccato omogenea campo elettrico (CHEF): <ol><li> Preparare cromosomi scelto Sua ricombinanti + in spine agarosio 18: <ul><li> Crescere una cultura liquido del suo candidato + TXV:: III cromosoma contenenti ricombinante in 5 ml di YPD a circa 1-2 x 10 8 cellule / ml. </li><li> Spin down e lavare le cellule 2 volte con 50 mM EDTA. </li><li> Risospendere le cellule in circa 200 ml di 50 mM EDTA, e calda a 50 ° C. </li><li> Aggiungere un uguale volume di fuso 2% (w / v) bassa temperatura di fusione agarosio portato a 50 ° C, mescolare accuratamente. </li><li> Erogare circa 80 microlitri aliquote in stampi spina e lasciare raffreddare per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Estrudere prese dallo stampo in un 12-ben piatto. Fino a cinque spine può essere collocato in ciascun pozzetto. </li><li> Aggiungere 3 ml di soluzione preparata spheroplasting (14 mM 2-β-mercaptoetanolo, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 Sorbitolo M) in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C per 4 ore con agitazione. </li><li> Rimuovere la soluzione spheroplasting e sostituire con 3 ml di soluzione LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) al litio solfato Dodecyl, adjust pH a 8,0). Incubare a 37 ° C per 15 min con agitazione. </li><li> Rimuovere la soluzione LDS e sostituirla con un&#39;altra aliquota 3 ml di LDS. Incubare a 37 ° C per una notte e scuotendo con cautela. </li><li> Rimuovere LDS e sostituire con 3 ml di 0,2 X NDS (0,6 g di Tris base, 93 g di EDTA disodico diidrato, 5 g di N-Lauroyl Sarcosina, regolare il pH a 8,0, ha portato a 500 ml con dH 2 O). Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti con agitazione. Rimuovere NDS, e ripetere 2 volte. </li><li> Rimuovere NDS e sostituire con 3 ml di TE. Lavare con leggera agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Ripetere 4 volte. </li><li> Conservare le spine a 4 ° C in 2 ml di TE. Spine può tenere fino a un anno. </li></ul></li><li> Cromosomi separati su un 1% gel utilizzando un Bio-Rad-CHEF DRII apparato a 14 ° C (Catalogo #: 170-3612). </li></ol> Parametri: 1 ° Blocco: interruttore &#39;70 tempo, 15h a 6V/cm. 2 ° blocco: Interruttore orario 120s, 11h a 6V/cm <ol start="3"><li> Visualizza cromosomi dalla colorazione con bromuro di etidio 1μg/ml per 30 minuti, irradiando con 60 mJ di UV in un Stratalinker UV (Stratagene), e de-colorazione per 30 minuti in dH 2 O. Irradiando etidio bromuro cromosomi colorati nick il DNA per consentire l&#39;efficiente trasferimento alla membrana. </li><li> Trasferimento cromosomi di una membrana a carica positiva (Hybond N +, GE Healthcare Codice prodotto:. RPN303B) per azione capillare in condizioni di denaturazione (0.4N NaOH, 1.5M NaCl). </li><li> Ibridare con un P-32 etichettata sonda ottenuto da innesco casuale (Amersham Biosciences Codice prodotto:. RPN1604) con 1,8 kb BamHI / BamHI clone genomico contenente il gene HIS3 17. </li><li> Visualizza cromosomi mediante autoradiografia o phosphorimaging. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Una rappresentazione grafica del test traslocazione è raffigurato a livello cromosomico (Figura 1). Uno schema della procedura sperimentale è anche (Figura 2A). Sia pre-e post-induzione efficienze placcatura sono determinate dividendo il numero totale di vitali, le cellule formanti colonie per il numero totale dei corpi cellulari nella cultura determinata dalla emocitometro count (Figura 4B). Pre-e post-induzione efficienze placcatura non sono risultati significativamente differenti per le cellule wild-type (p = 0,1400) (Tabella 1). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tabella 1" /> Tabella 1. Pre-e post-induzione efficienze placcatura in cellule wild-type. Il numero uno di corpi cellulari per millilitro sono determinate dal numero di emocitometro. b Il numero di cellule vitali per millilitro sono determinati dalla placcatura opportune diluizioni su terreno non selettivo per la produzione di ~ 100-200 colonie. c Le informazioni pre e post-induzione efficienze placcatura sono determinate dividendo il numero totale di vitale, formanti colonie, le cellule per il numero totale dei corpi cellulari nella cultura, determinato dal numero di emocitometro. Ciò suggerisce che la presenza o l&#39;assenza di entrambi traslocazione cromosomica non influisce sulla capacità di sopravvivere formazione di DSB. La frequenza di traslocazioni cromosomiche può essere calcolato dividendo il numero di colonie prototrophic istidina per il numero totale di cellule vitali determinato dal piastrato su YPD (Figura 2B). Questa analisi può essere condotta utilizzando ceppi di genotipo diverso per capire come la perdita della funzione della proteina influenza SSA (cioè rad51Δ - / -). Frequenze di ricombinazione determinato in diversi ceppi possono essere rappresentati graficamente per confrontare le differenze nella capacità di questi ceppi di riparare il HO-endonucleasi DSB indotte da SSA (Figura 2C). Frequenze traslocazione ottenuti con il ceppo selvatico diploide sotto selettivo (2.2x10 -2) e non selettiva (2.17x10 -2) le condizioni non erano statisticamente differenti tra loro (p = 0,9131), mentre le frequenze traslocazione ottenuto selettivamente (6.0x10 -2) e non selettiva (11.9x10 -2) con la rad51Δ - / - omozigoti erano simili, ma statisticamente differenti (p-value = 0,0089). Le frequenze ottenuti sia selettivo (p-value = 0,0001) e non selettiva (p-value = 0,0002) con i pulsanti ° rad51 - / - omozigoti erano statisticamente differenti da quelli ottenuti utilizzando le condizioni in corrispondenza del ceppo selvatico. Putativo traslocazione portante cloni può essere ulteriormente esaminati da genomico Southern blot ed analisi cromosomica blot (Figura 3). Per l&#39;analisi del sud, il DNA genomico viene digerito con endonucleasi BamHI prima di elettroforesi su gel di agarosio, blotting e ibridazione a 32P-etichettati 1.8kb HIS3 sonda per visualizzare la diagnostica 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb tIII:: XV, 5 kb TXV:: III, e 8 kb his3-Δ5&#39; frammenti (Figura 3B.1) . Cromosomi intatti possono essere preparati, separati da CHEF (Figura 3B.2), cancellati al nylon e ibridato con il 32 P-etichettati 1,8 kb HIS3 sonda per visualizzare la 1.1 Mb intatto cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: traslocazione cromosomica III, 0,6 Mb tIII: traslocazione cromosomica XV, e 0,3 Mb intatto cromosoma III (Figura 3B.3). Una mappa grafica raffigurante previsto endonucleasi BamHI-digerito frammenti di DNA genomico, e genitore e cromosomi ricombinanti, è raffigurato (Figura 3A). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Formazione traslocazione dei cromosomi da single-strand annealing (SSA). 1) DSB sono creati al his3-Δ3 &#39;e his3-Δ5&#39; substrati (cromosomi XV e III, rispettivamente) da endonucleasi HO dopo l&#39;aggiunta di galattosio alle culture. 2) DSB sono trattati per generare 3 &#39;a singolo fili alle estremità dei cromosomi rotti. 3) annealing macchinari SSA 311 complementari o 60 nucleotidi a singolo filamento HIS3 sequenze formate in ciascuno dei substrati ricombinazione. Non omologhe code formate sulla ricottura vengono rimossi dalla digestione endonucleasi. Complementari quattro sovrasta bp sui frammenti rimanenti cromosomica formata da HO-endonucleasi digestione può anche temprare. 4) La legatura conclude la creazione di un gene intatto HIS3 e TXV:: traslocazione cromosomica III da SSA. Le cellule che trasportano questo cromosoma possono essere selezionati per la loro capacità di crescere su medio istidina carente. Legatura può anche generare il reciproco tIII:: traslocazione cromosomica XV NHEJ da un meccanismo simile. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Test per determinare la frequenza di traslocazione da SSA. A) Un ml YPGly / Lac colture vengono inoculate con colonie di cellule di un genotipo selezionare e cresciuto fino a una densità appropriata di circa 7-5x10 1x10 8 cellule / ml. Galattosio viene aggiunto ad una concentrazione finale del 2% per creare DSB al substrati ricombinazione sui cromosomi III e XV. Per condurre il test in condizioni selettive, diluizioni appropriate fatta in modo che circa 100 a 200 cellule sono placcati su YPD e un numero sufficiente di cellule sono placcati su terreno privo di istidina produrre un numero osservabile della Sua colonie + ricombinante. Per condurre il test senza selezione, circa 100 a 200 cellule sono placcati su YPD, coltivate per due o tre giorni di singole colonie e poi replica placcata sul istidina media manca. B) frequenza di traslocazione può essere determinato dividendo il numero di colonie che crescono sul suo piastre per la frazione che crescono sul YPD. C) Le frequenze traslocazione di ceppi di genotipo diverso (cioè wild-type e rad51Δ - / -) può essere tracciata per confrontare le differenze nella capacità di questi ceppi per riparare i DSB da SSA. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Determinare l&#39;efficienza placcatura. (A) un&#39;aliquota di cellule è preso dalla cultura durante la notte prima e dopo induzione DSB, diluizioni sono apportate appropriate, seguita da un conteggio emocitometro per determinare il numero totale dei corpi cellulari per ml di cultura. Diluizioni appropriate sono placcati su terreno non selettivo per determinare il numero totale di cellule vitali per ml, contando le colonie che appaiono sul YPD. (B) L&#39;efficacia placcatura è quindi determinato dividendo il numero totale di cellule vitali per il numero totale dei corpi cellulari, e moltiplicando questo quoziente per 100. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Rilevamento di eventi traslocazione cromosomica da genomico Southern blot e blot cromosoma. A) Rappresentazione grafica dei cromosomi rilevanti prima (a sinistra) e dopo (a destra) la formazione di traslocazione. Misure di genitore e cromosomi ricombinanti sono elencati nella megabase coppie (Mb). Dimensioni dei frammenti di restrizione contenenti sequenze rilevanti generate da BamHI digestione del DNA genomico da parenti ei ceppi ricombinanti, e ha rivelato su macchine da ibridazione con una kb 1,8 clone BamHI HIS3 genomico, sono elencati in kilobase coppie (kb). I cromosomi non sono in scala. B) Analisi fisica di presunti cloni di traslocazione-cuscinetto. (1) analisi genomica Southern blot - Il DNA genomico è stato raccolto e digerito con endonucleasi di restrizione BamHI, frazionato mediante elettroforesi su gel, blopreformato in nylon e ibridato a un P-32 etichettato 1,8 kb HIS3 sonda per visualizzare i seguenti frammenti: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb tIII:: XV, 5 kb TXV:: III, e 8 kb his3-Δ5 &#39;. Corsie: a) diploide genitore, b) La sua + non reciproci traslocazione ricombinante, c) La sua traslocazione reciproca + ricombinante. (2) CHEF gel - cromosomi intatti sono stati preparati in spine agarosio, separati da CHEF, colorati con bromuro di etidio e visualizzati sotto raggi UV. Corsie: Come sopra. (3) macchine Cromosoma - cromosomi separati sono stati cancellati al nylon e ibridato con l&#39;etichetta P-32 1,8 kb HIS3 sonda di visualizzare i cromosomi seguenti: 1.1 Mb intatto cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: traslocazione cromosomica III, 0,6 Mb tIII: traslocazione XV cromosoma, e 0,3 Mb intatto cromosoma III. Corsie: Come sopra.

<ol>
	<li>Sen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+genomic+deletions+mediated+by+recombination+between+Alu+elements.">Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements.</a> The American Journal of Human Genetics. 79, 41-53 (2006).</li><li>Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+recombination-mediated+structural+deletions+in+the+chimpanzee+genome.">Alu recombination-mediated structural deletions in the chimpanzee genome.</a> Plos Genetics. 3, 1939-1949 (2007).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+human+health,+disease,+and+evolution.">Copy number variation in human health, disease, and evolution.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 451-481 (2009).</li><li>Goodier, J. L., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposons+revisited:+The+restraint+and+rehabilitation+of+parasites.">Retrotransposons revisited: The restraint and rehabilitation of parasites.</a> Cell. 135, 23-35 (2008).</li><li>Lanktree, M., Hegele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+metabolic+phenotypes.">Copy number variation in metabolic phenotypes.</a> Cytogenet Genome Res. 123, 169-175 (2008).</li><li>Mullighan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+genetic+alterations+in+acute+lymphoblastic+leukaemia.">Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia.</a> Nature. 446, 758-764 (2007).</li><li>Mattarucchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomologies+and+interspersed+repeat+elements+at+genomic+breakpoints+in+chronic+myeloid+leukemia.">Microhomologies and interspersed repeat elements at genomic breakpoints in chronic myeloid leukemia.</a> Genes Chromosomes Cancer. 47, 625-632 (2008).</li><li>Stenger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+distribution+of+inverted+and+direct+Alus+in+the+human+genome:+implications+for+insertion,+exclusion,+and+genome+stability.">Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability.</a> Genome Res. 11, 12-27 (2001).</li><li>Hedges, D., Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inviting+instability:+Transposable+elements,+double-strand+breaks,+and+the+maintenance+of+genome+integrity.">Inviting instability: Transposable elements, double-strand breaks, and the maintenance of genome integrity.</a> Mutat Res. 616, 46-59 (2007).</li><li>Symington, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RAD52+epistasis+group+genes+in+homologous+recombination+and+double-strand+break+repair.">Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66, 630-670 (2002).</li><li>Lewis, L., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tying+up+loose+ends:+nonhomologous+end-joining+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Tying up loose ends: nonhomologous end-joining in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat Res. 451, 71-89 (2000).</li><li>Pannunzio, N. R., Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+is+required+for+efficient+repair+of+simultaneous+double-strand+breaks+resulting+in+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> DNA Repair (Amst). 7, 788-800 (2008).</li><li>Nicholas, R., Pannunzio, G. M. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+and+RAD1+cooperate+in+translocation+formation+by+single-strand+annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 56, 87-100 (2010).</li><li>Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+Inhibits+Translocation+Formation+by+Non-Conservative+Homologous+Recombination+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Rad51 Inhibits Translocation Formation by Non-Conservative Homologous Recombination in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57, 267-272 (1987).</li><li>Sambrook, J., MacCallum, P., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Iadonato, S. P., Gnirke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RARE-cleavage+analysis+of+YACs.">RARE-cleavage analysis of YACs.</a> Methods Mol. Biol. , 75-85 (1999).</li><li>Argueso, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+breaks+associated+with+repetitive+DNA+can+reshape+the+genome.">Double-strand breaks associated with repetitive DNA can reshape the genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 11845-11850 (2008).</li><li>Batzer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+repeats+and+human+disease.">Alu repeats and human disease.</a> Molecular Genetic Metabolism. 67, 183-193 (1999).</li><li>Fasullo, M., Dave, P., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-damaging+agents+stimulate+the+formation+of+directed+reciprocal+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DNA-damaging agents stimulate the formation of directed reciprocal translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat. Res. 314, 121-133 (1994).</li><li>Richardson, C., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+chromosomal+translocations+induced+by+DNA+double-strand+breaks.">Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks.</a> Nature. 405, 697-700 (2000).</li><li>Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+altered+by+chromosomal+translocations+in+leukemias+and+lymphomas.">Genes altered by chromosomal translocations in leukemias and lymphomas.</a> The Genetic Basis of Human Cancer. , (2002).</li><li>Fasullo, M. T., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+chromosome+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+use+of+his3+recombinational+substrates.">Direction of chromosome rearrangements in Saccharomyces cerevisiae by use of his3 recombinational substrates.</a> Mol. Cell. Biol. 8, 4370-4380 (1988).</li><li>Manthey, G. M., Naik, N., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Msh2+Blocks+an+Alternative+Mechanism+for+Non-Homologous+Tail+Removal+during+Single-Strand+Annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Msh2 Blocks an Alternative Mechanism for Non-Homologous Tail Removal during Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 4, e7488-e7488 (2009).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy.">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li><li>Lin, F. L., Sperle, K., Sternberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+homologous+recombination+during+transfer+of+DNA+into+mouse+L+cells:+role+of+DNA+ends+in+the+recombination+process.">Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).</li><li>Ivanov, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Requirements+for+the+single-strand+annealing+pathway+of+double-strand+break+repair+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Genetic Requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand break repair in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Genetics. 142, 693-704 (1996).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Alte dosi di radiazioni ionizzanti presentano un rischio intrinseco di instabilità del genoma attraverso la generazione di un gran numero di DSB 19. Genomi eucariotici sono pieni di sequenze ripetitive che sono substrati eccellenti per la generazione di traslocazioni e riarrangiamenti genomici altri 20,21. Traslocazioni cromosomiche da HR sono frequentemente osservate quando DSB sono introdotti tra sequenze ripetitive 12,21,22. Schiacciante evidenza suggerisce che gran parte l&#39;instabilità genomica associata a leucemie e linfomi possono essere attribuiti a traslocazioni cromosomiche, sottolineando l&#39;importanza di capire come questo meccanismo si verifica negli eucarioti 22,23. Abbiamo sviluppato un sistema di lievito per l&#39;esame della formazione dei cromosomi traslocazione di DSB indotte HR tra le regioni a corto di omologia su cromosomi diversi che sono di dimensioni simili a elementi ripetitivi dispersi in tutto il lievito e genoma umano. Nel saggio, il substrato traslocazione his3-Δ3 &#39;si trova su una copia del cromosoma XV. L&#39;altro his3 allele (his3-Δ200) ha un ~ cancellazione 1kb del promotore HIS3 e la sequenza di codifica che impedisce questa sequenza venga utilizzato come modello per la riparazione 24. Il substrato his3-Δ5 &#39;si trova nel locus LEU2 su una copia del cromosoma III, con l&#39;altra copia del cromosoma III che contiene un inalterata LEU2 allele (Figura 1). Un galattosio-inducibile cassetta endonucleasi HO espressione contrassegnati con KAN-MX è stato inserito nel locus TRP1 del cromosoma IV (TRP1:: GAL-HO-KAN-MX). Ogni substrato traslocazione è affiancata da un HO-endonucleasi sequenza di riconoscimento che può essere oggetto di scissione da indurre l&#39;espressione del gene HO attraverso l&#39;aggiunta di galattosio al mezzo. Dopo la scissione HO-endonucleasi che agiscono sui his3-Δ3 &#39;e his3-Δ5&#39; substrati, le cellule possono utilizzare in modo efficiente il tratto comune a corto di HIS3 omologia di sequenza (311 bp e 60 bp) per riparare i cromosomi rotto da HR, generando una traslocazione cromosomica con un intatto HIS3 allele 12-14,25. Perché le cellule genitore manca una copia intatta del gene HIS3, non sono in grado di crescere sul suo mezzo. Solo le cellule che hanno subito l&#39;evento traslocazione può essere selezionato per il medio istidina carente. Pertanto, la frequenza di traslocazioni cromosomiche può essere calcolato dividendo il numero di colonie prototrophic istidina per il numero totale di cellule vitali placcato, determinato da piastrato su YPD. DNA genomico e cromosomi intatti possono quindi essere isolate dal rappresentante sue colonie +, e la presenza di un cromosoma traslocazione verificato da genomico Southern Blot e analisi dei cromosomi. Attenta analisi ci ha permesso di raccogliere ulteriori importanti informazioni sul test 12. Genomica analisi Southern blot ha dimostrato che non vi è il taglio quasi totale di cromosomi XV e III dopo 30 minuti di HO-endonucleasi induzione, e quindi non c&#39;è sfondo significativo di uncut substrati cromosomiche nella popolazione (G. &amp; A. Manthey Bailis, risultati non pubblicati). Genomico analisi Southern blot e del suo cromosoma - sopravvissuti indica che le cellule perdono spesso uno, l&#39;altro o entrambi i cromosomi taglio e rimanere vitale (L. Liddell &amp; A. Bailis, risultati non pubblicati). È importante sottolineare che le efficienze placcatura quasi equivalente a quello non selettivo, prima e dopo l&#39;induzione di espressione di HO-endonucleasi indica che né la mancata riparazione cromosomi rotti, né il fallimento di mantenere cromosomi traslocazione influisce sulla capacità di sopravvivere formazione di DSB. Coerentemente con questo, il TXV: traslocazione cromosomica III ha dimostrato di essere instabile in cellule mitotiche in assenza di selezione. Questo è stato dimostrato da una crescente TXV:: III contenente la sua ricombinanti + pernottamento non-selettivo, placcatura singole colonie su piastre non selettivo, e placcatura replica su terreno selettivo privo istidina. Dieci al 70% delle colonie derivanti da questi piatti hanno perso la TXV:: traslocazione cromosomica III (N. Pannunzio &amp; A. Bailis, risultati non pubblicati). Traslocazione cromosomi generati dall&#39;esposizione IR negli esseri umani mostrano una simile instabilità 26. Questo suggerisce che la formazione di traslocazione può contribuire a eventi precoci nella tumorigenesi attraverso la promozione di perdita di eterozigosi. In secondo luogo, estese analisi genetiche e molecolari suggeriscono che SSA, un meccanismo efficiente e obbligatoriamente non conservative di AR, è il meccanismo principale della formazione di traslocazione da HR a seguito della creazione simultanea di DSB su due cromosomi 12,27,28. Questo è consistent con la constatazione che grandi dosi di risultato IR in una densità di DSB sufficiente a creare interruzioni adiacente a più sequenze ripetitive nel genoma del lievito, e una frequenza elevata di formazione traslocazione da HR. Insieme, queste osservazioni suggeriscono che l&#39;effetto oncogeno di esposizione IR negli esseri umani possono, in parte, derivare dalla riparazione di DSB da un meccanismo efficiente di risorse umane che genera traslocazioni che, attraverso la loro instabilità intrinseca, promuovere cambiamenti genetici che tumorigenesi lancio. Poiché la radiazione è spesso usato per curare il cancro, riarrangiamenti del genoma che risultano dalla riparazione di DSB indotte da radiazioni possono contribuire alla generazione di tumori secondari che si presentano frequentemente nei pazienti. Così, questo modello può aiutarci ad acquisire una migliore comprensione delle basi genetiche e molecolari di un&#39;importante risposta clinica al trattamento IR.

quantitation and analysis of the formation of ho-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in saccharomyces cerevisiae

Variazione genetica è spesso mediata da riarrangiamenti genomici che emergono attraverso l&#39;interazione tra i dispersi elementi ripetitivi presenti in ogni genoma degli eucarioti. Questo processo è un importante meccanismo per la generazione di diversità tra e all&#39;interno degli organismi 1-3. Il genoma umano è costituito da circa il 40% sequenza ripetitiva di origine retrotrasposoni, tra cui una varietà di linee e SINE 4. Eventi di scambio tra questi elementi ripetitivi può portare a riarrangiamenti del genoma, tra cui le traslocazioni, che possono interrompere il dosaggio del gene e di espressione che può portare a malattie autoimmuni e cardiovascolari 5, così come il cancro negli esseri umani 6-9. Scambio tra gli elementi ripetitivi si verifica in una varietà di modi. Scambio tra le sequenze che condividono perfetto (o quasi perfetta) omologia si verifica da un processo chiamato ricombinazione omologa (HR). Al contrario, non omologhe fine unirsi (NHEJ) usa poco o non-omologia di sequenza per lo scambio di 10,11. Lo scopo principale di AR, in cellule mitotiche, sia per riparare rotture del doppio filamento (DSB) generati endogenamente dalla replica del DNA aberrante e lesioni ossidative, o da esposizione a radiazioni ionizzanti (IR), e altri agenti dannosi DNA esogeno. Nel test qui descritto, DSB sono creati simultaneamente al confine con substrati ricombinazione a due diversi loci cromosomici nelle cellule diploidi da un galattosio-inducibile HO-endonucleasi (Figura 1). La riparazione dei cromosomi rotti genera traslocazioni cromosomiche dal singolo filamento ricottura (SSA), un processo in cui le sequenze omologhe adiacenti alle estremità dei cromosomi sono uniti covalentemente successivamente alla ricottura. Uno dei substrati, his3-Δ3 &#39;, contiene un 3&#39; troncato HIS3 allele e si trova su una copia del cromosoma XV al locus nativo HIS3. Il secondo substrato, his3-Δ5 &#39;, si trova nel locus LEU2 su una copia del cromosoma III, e contiene un 5&#39; troncato HIS3 allele. Entrambi i supporti sono affiancate da un sito di riconoscimento HO endonucleasi che possono essere oggetto di incisione da HO-endonucleasi. HO siti di riconoscimento endonucleasi nativi del locus MAT, su entrambe le copie del cromosoma III, sono stati soppressi tutti i ceppi. Questo impedisce l&#39;interazione tra i substrati ricombinazione e gli altri finisce cromosoma rotto di interferire nel saggio. La KAN-MX-segnato galattosio-inducibile cassetta endonucleasi HO espressione è inserita nel locus TRP1 sul cromosoma IV. La quota substrati 311 bp e 60 bp della sequenza HIS3 di codifica che possono essere utilizzati dalla macchina HR per la riparazione di SSA. Celle che utilizzano questi substrati per riparare i cromosomi rotto da HR formare una intatta HIS3 allele e una TXV:: traslocazione cromosomica III che possono essere selezionati dalla capacità di crescere sulla istidina medio manca (Figura 2A). Frequenza traslocazione da HR è calcolato dividendo il numero di colonie prototrophic istidina che sorgono sul terreno selettivo per il numero totale di cellule vitali che si presentano dopo la placcatura opportune diluizioni su terreno non selettivo (Figura 2B). Una varietà di mutanti di riparazione del DNA sono stati utilizzati per studiare il controllo genetico della formazione di traslocazione di SSA utilizzando questo sistema 12-14.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae at 

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

L&#39;HO-stimolato test traslocazione monitor singolo filamento di ricottura seguito alla creazione di DNA a doppio filamento a loci multipli in diploidi<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Questo meccanismo può modello di riarrangiamenti del genoma nelle cellule somatiche di eucarioti superiori in seguito all&#39;esposizione ad alte dosi di radiazioni ionizzanti.

Quantificazione e analisi della formazione di HO-endonucleasi Stimolato traslocazioni cromosomiche da Single-Strand Ricottura in Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

quantitation-analysis-formation-ho-endonuclease-stimulated

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

14.6K Views.  Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences. L'HO-stimolato test traslocazione monitor singolo filamento di ricottura seguito alla creazione di DNA a doppio filamento a loci multipli in diploidi Saccharomyces cerevisiae. Questo meccanismo può modello di riarrangiamenti del genoma nelle cellule somatiche di eucarioti superiori in seguito all'esposizione ad alte dosi di radiazioni ionizzanti.

Video: Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR monitorata Redox Titolazione dei cofattori di<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...