Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca (NIH / NIDCD 009.269, 012.831 e ARRA amministrative supplemento sovvenzioni NIH) a Weihong Lin. Noi in particolare ringraziamo il signor Tim Ford a UMBC per la sua assistenza tecnica in videoregistrazione e l&#39;elaborazione. Desideriamo inoltre ringraziare il Dott. Daphne Blumberg, la signora Chere Petty a UMBC e il signor Nicola McCollum da Olympus America Inc. per la loro assistenza materiale in videoregistrazione.

1. Topo Preparazione Naso Abbiamo usato adulto C57BL / 6 topi sfondo in questo studio. Tutte le cure e le procedure di animali sono approvati dalla cura degli animali e utilizzare i comitati (IACUC) della University of Maryland, Baltimore County. 1.1 Acquisire il naso da topi paraformaldahyde-fissi <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> Figura 1. Le ossa di un cranio del mouse A:. Vista dorsale del cranio B:. Vista ventrale del cranio con la mandibola rimosso. Il cranio è stato preparato da un 40 giorni vecchio topo. Singole ossa sono colorati per una migliore visualizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <ol><li> Profumato transcardially di fissare singoli topi a seguito di the protocollo di Lin, et al., (2008) 16. In breve, i topi sono stati anestetizzati profondamente con tribromoethanol (Avertin 250 mcg / g di peso corporeo), perfusi con transcardiaca 0.1M tampone fosfato (PB, 30-50 ml), seguito da un fosfato tamponata fissativo contenente 3% paraformaldeide, 19 mM di L-lisina monocloridrato, e 0,23% di sodio m-periodato (circa 35-50 ml). Si può anche seguire la procedura descritta in questo articolo JoVE per la perfusione degli animali 35. </li><li> Utilizzare un paio di forbici per tagliare mandibola (o mascella inferiore) e rimuovere la pelle sulla testa. </li><li> Separare l&#39;intera testa dal resto del corpo. </li><li> Rimuovere il palato. Inoltre pulire e rimuovere il tessuto connettivo e muscolare rimanente sulla superficie del cranio per ottenere il campione mostrato nelle figure 1A e 1B. </li><li> Sotto un microscopio dissezione, togliere l&#39;osso del cranio che copre il cervello e bulbi olfattivi. Tagliare il tessuto in eccesso e ossa. Note, per la preparazione dei tessuti prolungato in cui il cervello e il naso rimangono collegati, solo le ossa del cranio vengono rimossi. Per gli esperimenti di immunoistochimica, il tessuto era post-fissato per 1,5 ore e trasferito 0.1M tampone fosfato (PBS) con il 25% di saccarosio durante la notte. Nasale tessuto deve essere mantenuta per tutta la dissezione umidificato mediante immersione nella soluzione di saccarosio tamponata più volte. </li></ol> 1.2 Acquisire il naso da topi appena eutanasia <ol><li> Singoli topi sono stati trasferiti in una gabbia pulita ed esposti a gas CO 2, a cui è seguito dislocazione cervicale 5 minuti dopo l&#39;ultimo respiro. Per ridurre il sangue nel tessuto naso, usare un paio di forbici per aprire la cassa e tagliare il cuore per permettere al sangue di defluire. </li><li> Ripetere i passaggi da 1.1.2 a 1.1.5, tranne il post-fissazione e crioprotezione con il 25% di saccarosio. Il campione deve essere conservato e mantenuto umidificato con soluzione salina contenente Tyrode (in mm): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl 2, 10 Na piruvato, 10 D-glucosio, 10 e N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-etano tampone acido (HEPES, regolato a pH 7,4). In alternativa, piegare un pezzo di Kimwipes, immergerlo con la soluzione di Tyrode, e posto sotto il provino durante la dissezione e, occasionalmente, immergere il campione in soluzione del Tyrode o far cadere qualche soluzione sul tessuto per tenerlo umidificata per mantenere la vitalità delle cellule e dei tessuti . </li></ol> 2. Incisivo, anteriore Vomer e Mascella rimozione ossea <ol><li> Inizia da un punto di vista ventrale. Individuare l&#39;osso vomere e rompere l&#39;osso vomere lungo la sua lunghezza con un rongeur o pinze con i denti per rompere il ventrale maggior parte dell&#39;osso. </li><li> Utilizzando seghettate pinze, rimuovere i segmenti spezzati dell&#39;osso vomere per l&#39;esercizio di un&#39;attività delicatamente i frammenti ossei dal organo vomeronasale (VNO). Si noti, per i topi di meno di un mese, o anche solo interessati al MOE, questi due steps può essere saltato. </li><li> Tenere la testa saldamente con una pinza. Utilizzare il rongeur per rompere la porzione anteriore di entrambe incisivi e la regione snodato di mascella anteriore tra i due incisivi e l&#39;osso vomere. </li><li> Rompere la parte ventrale del mascellare superiore destra alla regione appena anteriormente al zigomatica fino al livello della piastra dorsale zigomatico. </li><li> Capovolgere il naso per un punto di vista dorsale. Utilizzare il rongeur per rompere il diritto mascellare anteriore della piastra zigomatico dorsale. Tutta la destra mascella anteriore del piatto zigomatico dovrebbe essere sciolto. Utilizzare i pinza sottile per separare delicatamente qualsiasi tessuto nasale alla base della mascella, quindi sollevare delicatamente via il frammento osseo. </li><li> Ripetere i passi 2.4 e 2.5 per allentare l&#39;incisivo sinistro e sinistro mascellare anteriore e togliere loro dopo l&#39;osso nasale è stato rimosso. </li></ol> 3. Osso nasale e Dorsale rimozione Piastra zigomatico <ol><li> Usate il forcipe o dentata il rongeur di rispostare il resto delle ossa frontali appena caudalmente ossa nasali. Dopo la rimozione di questo pezzo di osso, la parte caudale dell&#39;osso nasale può essere afferrato con pinze. </li><li> Utilizzare il rongeur per rompere la porzione anteriore dell&#39;arco zigomatico, che è collegato alla piastra zigomatico. </li><li> Prendete le pinza sottile sul bordo laterale della fine dorsale della piastra zigomatico e capovolgere delicatamente l&#39;osso e rimuoverlo. Se l&#39;osso non è allentata, utilizzare il rongeur per premere delicatamente per allentare la rimozione. </li><li> Utilizzare le pinze sottili o una lama di rasoio per allentare la sutura mediale tra destra e sinistra ossa nasali. </li><li> Utilizzare il seghettato pinze per afferrare l&#39;estremità caudale dell&#39;osso nasale destra. Spostare delicatamente l&#39;osso da un lato all&#39;altro per separarlo dalla base del tessuto. È utile per spostare la pinza lungo il terzo caudale dell&#39;osso nasale per spostare il lato dell&#39;osso a lato. Come separa l&#39;osso nasale, sollevare lentamente l&#39;osso dall&#39;estremità caudale. </li><li> Mentre tegli osso nasale è leggermente sollevato, inclinare l&#39;osso lateralmente per rivelare un affioramento laterali del midollo che è rivestito con sottile tessuto epiteliale respiratorio. Utilizzare una pinza sottile per rilasciare delicatamente il tessuto dall&#39;osso nasale. Continuare a sollevare l&#39;osso nasale. Quando l&#39;osso è completamente separato dal tessuto sottostante, usare le forbici per tagliare l&#39;osso nasale, alla fine rostrale. </li><li> Ripetere i punti 3.1, 3.5 e 3.6 per la rimozione di osso nasale sinistra. </li><li> Ripetere i punti 3.2 e 3.3 per il lato sinistro del naso. </li></ol> 4. Laterale rimozione Piastra zigomatico <ol><li> Rimuovere la piastra zigomatico un lato alla volta. O piastra zigomatico può essere rimosso per primo. </li><li> Da un punto di vista ventrale, rompere la mascella inferiore al zigomatica fino pausa raggiunge il zigomatica. </li><li> Da un punto di vista dorsale, afferrare delicatamente il zigomatica e sollevare in avanti e laterale. Se la piastra zigomatico è ancora attaccato a qualsiasi tessuto, prendere la multaforcipe e recidere delicatamente le connessioni tra il tessuto e l&#39;osso. </li><li> Ripetere per la piastra zigomatico sull&#39;altro lato del naso. </li></ol> 5. Orbit rimozione ossea <ol><li> Da un punto di vista ventrale, rompere l&#39;osso Palatina tra i molari del naso. </li><li> Utilizzare il rongeur per rompere i 3 ei molari del mascellare su ciascun lato del naso. </li><li> Rompere e rimuovere eventuali pezzi rimanenti spessore di osso ventrale e posteriore alle turbinati su ciascun lato del naso. </li></ol> 6. Etmoide rimozione ossea <ol><li> Rompere qualsiasi parte dell&#39;osso etmoide sporgente caudale ai turbinati. Ciò è necessario per evitare la perdita di tessuto turbinate nel rimuovere pezzi sottili di osso etmoide coprono turbinati. </li><li> Per il lato destro del naso, posizionare i pinza sottile sul bordo anteriore dell&#39;osso etmoide e rimuoverla delicatamente. Se una porzione dell&#39;osso rimane, ripetere questa procedura finché tuttil&#39;osso sottile che copre i turbinati è stato rimosso. Le ossa turbinati non devono essere rimossi nella maggior parte delle preparazioni. In topi anziani, la lamina cribrosa diventa fragile. Se è necessaria criosezionamento del tessuto nasale, rimuovere piccoli pezzi della piastra con una pinza sottile per ridurre il potenziale danno causato dalla osso. </li><li> Ripetere il punto 6.2) per il lato sinistro del naso. </li><li> Rimuovere eventuali frammenti di ossa rimanenti prima del sezionamento. Nota: in animali più di un anni, la regione posterodorsal dell&#39;osso setto è alquanto denso e duro. Si può rimuovere questa parte con una pinza sottile. Inserire la punta della pinza in entrambi lato dell&#39;osso per separare la porzione dorsale del setto osseo e il tessuto di rivestimento epiteliale. Utilizzare un paio di pinze per afferrare l&#39;osso e tenere il campione. Utilizzare un altro paio di pinze per rompere la parte ossea superiore della porzione cartilaginea inferiore del setto e rimuoverla delicatamente. </li></ol><ol><li> Impostare la pompa del vuoto aspiratore. </li><li> Mettere il naso in uno stampo embedding. Immergere il naso in OCT media. </li><li> Utilizzare un aspirapolvere per rimuovere le bolle d&#39;aria intrappolate all&#39;interno del tessuto naso. Questo processo può richiedere fino a 5 min. </li><li> Dopo la rimozione di bolle d&#39;aria, il tessuto impostare l&#39;orientamento desiderato. </li><li> Congelare l&#39;ottobre e il tessuto nello stampo usando ghiaccio secco. Il tessuto incorporato può quindi essere cryosectioned immediatamente o conservato a -80 ° C per un uso futuro. </li></ol>

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R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+neurons+expressing+transient+receptor+potential+channel+M5+(TRPM5)+are+involved+in+sensing+semiochemicals.">Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).</li><li>Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui, abbiamo dimostrato una procedura passo-passo per isolare il tessuto olfattivo e respiratorio intatta dal naso mouse sequenzialmente rimuovendo le ossa circostanti, risparmiando il tessuto sottostante. Abbiamo dimostrato che un&#39;attenta rimozione ossea può conservare anche i tessuti più delicati nella loro interezza. Condividiamo anche spaccato eventuali modifiche di questa tecnica, in cui isolare sia il cervello e il tessuto naso insieme per preservare il collegamento nervo. Questo nuovo metodo fornisce un mez...

La cavità nasale mammiferi contiene vari tipi di tessuti ed organi che servono funzioni distinte. La cavità nasale costituisce la porzione di imbocco del tratto respiratorio superiore, che permette di viaggiare aria dentro e fuori i polmoni. Aria inalata passa attraverso la cavità nasale dove subisce temperatura e umidità condizionata 1 così come la pulizia o filtrazione per rimuovere sostanze irritanti e tossiche e microrganismi infettivi 2. Entrambi i trattamenti sono effettuati da nasale epiteli e tessuti subepiteliali, tra cui le ghiandole e vasi e sono fondamentali per la protezione delle vie respiratorie inferiori e dei polmoni. Oltre al suo ruolo nella respirazione e difesa epiteliale, il tessuto nasale contiene anche apparati sensoriali periferici dei sistemi olfattivi e trigemino, che rilevano una vasta gamma di sostanze chimiche in aria che passa. A seconda del sistema è attivato, il rilevamento sensoriale di sostanze chimiche nel naso può suscitare siaun senso di odore, irritazione o dolore 3,4. Il sistema olfattivo periferico è complesso e costituito da diversi organi sensoriali olfattivi anatomicamente separate all&#39;interno della cavità nasale. Tra questi, il principale epitelio olfattivo (MOE) è la più grande, che costituisce circa il 45-52% degli epiteli nasali nei roditori 5 e si trova nella regione posteriore. Nella regione anteroventrale, vi è una coppia di strutture tubolari noti come vomeronasal organo 6, che siedono lungo ogni lato del setto nasale. Altri due piccoli gruppi di neuroni sensoriali olfattivi, noto come l&#39;organo del setto di Masera 7,8 e il ganglio Gruneberg 9, risiedono lungo il setto ventrale e la regione dorsale ingresso della cavità nasale, rispettivamente. Questi organi periferici contengono neuro-epiteli con caratteristiche di spicco nella morfologia, espressione marcatore della cella, e la funzione fisiologica. Insieme, essi rilevano migliaia di odorimolecole con squisita sensibilità 10-12. Oltre agli organi sensoriali olfattivi, la cavità nasale ospita anche altri sistemi sensoriali. E &#39;noto che le fibre del nervo trigemino peptidergico sono presenti nell&#39;epitelio nasale, specialmente l&#39;epitelio respiratorio 13,14. Alcune di queste fibre di rilevare sostanze chimiche irritanti e tossici e sono responsabili per l&#39;avvio di riflessi protettivi come tosse e starnuti 4,15. Composti odorosi e amaro irritanti possono essere rilevati anche da una popolazione di cellule recentemente scoperto chemosensoriali solitarie (SCC), molti dei quali sono innervate da fibre nervose del trigemino 16-19. Questi SCC si trovano a maggiore densità nella zona ingresso della cavità nasale e delle vie d&#39;ingresso vomeronasali, suggerendo che esse possono servire anche una funzione protettiva 16-18. Così, epiteli nasali possono differire sostanzialmente in funzione, morfologia e composizione delle cellule a seconda della lorosedi anatomiche. Anche all&#39;interno di un unico e specializzato epitelio, ci sono differenze regionali. Il MOE è un esempio. Le linee MOE vari turbinati, che sono complicate e arricciati strutture. Grazie a loro, diverse regioni delle esperienze diverse portate d&#39;aria MOE e, quindi, diversa diffusione e di clearance delle molecole di odore nell&#39;aria 20. Inoltre, è noto che i neuroni sensoriali olfattivi (OSN) esprimenti un dato recettore odore sono situati in una delle quattro aggirato zone del MOE 21,22. Come questa differenza di posizione influenza la risposta di un OSN per odoranti non è ampiamente noto. Inoltre, alcune popolazioni OSN mostrano preferenza regionale. OSN guanylyl ciclasi-D (GC-D)-esprimenti hanno distribuzioni zonali favorendo le regioni cul-de-sac delle ectoturbinates 23,24. Più di recente, abbiamo trovato una sottopopolazione di OSN canoniche che esprime transitoria recettore potenziale canale M5 (trPM5) ed è preferenzialmente situati nelle regioni laterali e ventrali 25. Questi risultati indicano che MOE non è uniforme. Tuttavia, come queste differenze regionali influenzano codifica olfattivi non è compreso. Questo è in parte perché accurata indagine fisiologica del MOE e il naso è stato limitato dalla difficoltà di ottenere intatta nasale epiteli con organizzazione anatomica conservata con i metodi attuali. La nasale epiteli sono prevalentemente circondato dalle ossa anteriori del cranio, compreso il naso, mascella, palatino, zigomatico, e le ossa etmoidali. In topi adulti e altri modelli di roditori, queste ossa sono dure e difficili da rimuovere senza danneggiare il tessuto nasale strettamente associata, in particolare dei turbinati delicati. Spesso, decalcificazione chimici a base viene usato per ammorbidire le ossa per consentire criosezionamento dei tessuti nasali per morfologica, immunoistochimica, e in studi di ibridazione in situ, tuttavia, dipending l&#39;età dell&#39;animale, il processo di decalcificazione può durare durante la notte fino a 7 giorni 24,26-28. Questo trattamento è limitata anche perché richiede tessuto fissativo essere conservato. Inoltre, decalcificazione chimica può essere dura e influenzare la immunomarcatura di alcuni anticorpi sensibili 29,30. Per gli studi fisiologici, è richiesta tessuto vivo, e, quindi, questi esperimenti sono spesso condotti su OSN isolate o fette MOE ottenuti da neonati le cui ossa del cranio sono sottili e morbidi 17,31,32. Studi fisiologici possono anche utilizzare i preparati montare tutto, dividendo la testa 25,33,34, ma di solito solo la superficie mediale del naso è facilmente accessibile, limitando le registrazioni fisiologiche su altre aree. Qui, descriviamo un efficace metodo di disossamento manuale per preparare i tessuti nasali intatte con conservato organizzazione anatomica e morfologia. Noi sequenziale rimuoviamo le principali ossa del anterioreè necessaria cranio sotto un microscopio dissezione per esporre un epitelio nasale quasi totalmente intatto, mantenendo le sottili ossa turbinati intatto a meno che i topi sono molto vecchi e criosezionamento. Abbiamo anche estendere il metodo per conservare la connessione tra i tessuti nasali e bulbi olfattivi, così come il resto del cervello, facilitando così esame simultaneo di entrambi i circuiti periferici e centrali. Il nostro metodo può essere utilizzato per preparare paraformaldeide-fisso, nonché fresco, tessuto nasale vivo. Così, il nostro metodo è previsto per facilitare gli studi morfologici, immunoistochimici e fisiologici della respirazione, l&#39;olfatto, e nasale danni e malattia.

<table border="1">
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Dissection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>501333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 3 </td>
 <td>WPI</td>
 <td>503235 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 55</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14099</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont AA</td>
 <td>Fine Science Tools (FST)</td>
 <td>11210-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Specimen forceps, Serrated</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating scissors</td>
 <td>WPI</td>
 <td>501753</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors, Straight</td>
 <td>Miltex</td>
 <td>V95-304</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>SZ40</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tissue embedding</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td>
 <td>Sakura Finetek</td>
 <td>4583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic embedding mold</td>
 <td>VWR</td>
 <td>15160-215 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator vacuum pump</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>09-960-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Section staining </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral red</td>
 <td>ACROS Organic</td>
 <td>CAS 553-24-2</td>
 <td>Nuclei staining</td>
 </tr>
</table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

Il naso dei mammiferi è un organo multi-funzionale con le strutture interne complesse. La cavità nasale è rivestita con vari epiteli, come epiteli olfattivi, respiratori, e squamose che differiscono notevolmente in sedi anatomiche, morfologia e funzioni. In topi adulti, il naso è coperto con varie ossa del cranio, limitando l&#39;accesso sperimentale alle strutture interne, in particolare quelli del posteriore, come il principale epitelio olfattivo (MOE). Qui si descrive un metodo efficace per ottenere quasi tutto intatto e tessuti nasali con organizzazione anatomica conservata. L&#39;utilizzo di strumenti chirurgici sotto un microscopio da dissezione, abbiamo sequenziale rimuoviamo le ossa del cranio che circondano il tessuto nasale. Questa procedura può essere eseguita su entrambe le teste del mouse, dalla pelle paraformaldeide-fissi e appena sezionato. L&#39;intera procedura disossamento richiede circa 20-30 min, che è significativamente più breve del tempo richiesto per sperimentale convenzionale a base chimica decalcificazione. Inoltre, vi presentiamo un metodo semplice per rimuovere le bolle d&#39;aria intrappolate tra i turbinati, che è fondamentale per l&#39;ottenimento di sezioni orizzontali o coronale o sagittale sottili intatte dalla preparazione dei tessuti nasali. Tessuto nasale preparati usando il nostro metodo può essere utilizzato per tutta osservazione monte dell&#39;intero epiteli, nonché morfologica, immunocitochimica, RNA ibridazione in situ, e studi fisiologici, specialmente negli studi in cui regione specifica esame e confronto sono di interesse.

Usando questo metodo, si può attendibilmente ottenere tessuto nasale quasi completamente intatte. Figura 2A mostra un&#39;immagine esemplare adulto nasale da una testa paraformaldeide-fissa. In questo esemplare, tutti e quattro gli organi sensoriali sub-olfattive, tra cui il MOE, organo del setto, il ganglio Gruneberg e VNO, sono intatte. Inoltre, gli epiteli delle vie respiratorie e dei tessuti subepiteliali, come le ghiandole e vasi, sono conservati. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo in u...

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An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Un efficace manuale disosso metodo per preparare intatto il mouse tessuto nasale con organizzazione anatomica Conservato

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.5K Views.  University of Maryland Baltimore County. 

Video: An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Ricerca

Biologia

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Un metodo sezionamento migliorato per Recalcitrante tessuti vegetali Campioni

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

Isolamento di Intact EyeBall per ottenere tessuto di superficie oculare integrale per l'esame istologico e l'immunoistochimica

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Applicazione del movimento passivo della testa per generare accelerazioni definite alle teste dei roditori

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

A Mouse Model of Pulmonary Fibrosis Induced by Nasal Bleomycin Nebulization

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse models continue to be an important tool for developing new anti-fibrotic strategies. In this study, intrapulmonary administration of bleomycin (BLM) is carried out by nasal nebulization to create a mouse model of pulmonary fibrosis that closely mimics clinical disease characteristics. C57BL/6 mice received BLM (7 U/mL, 30 min/day) by nasal nebulization for 3 consecutive days and were sacrificed on day 9, 16, or 23 to observe inflammatory and fibrotic changes in lung tissue. Nasal aerosolized BLM directly targeted the lungs, resulting in widespread and uniform lung inflammation and fibrosis. Thus, we successfully generated an experimental mouse model of typical human pulmonary fibrosis. This method could easily be used to study the effects of the administration of various nasal aerosols on lung pathophysiology and validate new anti-inflammatory and anti-fibrotic treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Un modello murino di fibrosi polmonare indotta dalla nebulizzazione nasale di bleomicina

Various animal models of pulmonary fibrosis have been established using bleomycin to clarify the pathogenesis of pulmonary fibrosis and find new drug targets. However, most pulmonary fibrosis models targeting lung tissue have uneven drug administration. Here, we propose a model of uniform pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization.

Un modello murino di fibrosi polmonare indotta dalla nebulizzazione nasale di bleomicina

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse ...

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial information for understanding the mechanism of diseases and designing treatments. In this work, we describe procedures and methodologies for studying in-cell metabolic activity in a retrogradely perfused mouse heart in real-time. The heart was isolated in situ,&#160;in conjunction with cardiac arrest to minimize the myocardial ischemia and was perfused inside a nuclear magnetic resonance (NMR) spectrometer. While in the spectrometer and under continuous perfusion, hyperpolarized [1-13C]pyruvate was administered to the heart, and the subsequent hyperpolarized [1-13C]lactate and [13C]bicarbonate production rates served to determine, in real-time, the rates of lactate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase production. This metabolic activity of hyperpolarized [1-13C]pyruvate was quantified with NMR spectroscopy in a model free-manner using the product selective saturating-excitations acquisition approach. 31P spectroscopy was applied in between the hyperpolarized acquisitions to monitor the cardiac energetics and pH. This system is uniquely useful for studying metabolic activity in the healthy and diseased mouse heart.

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

We describe an experimental setup for administrating hyperpolarized 13C-labeled metabolites in continuous perfusion mode to an isolated perfused mouse heart. A dedicated 13C-NMR acquisition approach enabled the quantification of metabolic enzyme activity in real-time, and a multiparametric 31P-NMR analysis enabled the determination of the tissue ATP content and pH.

Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e spettroscopia NMR 13C / 31P