Ringraziamo Vi Nguyen per la lettura del manoscritto e l&#39;assistenza di laboratorio in generale.

1. Preparazione della cultura Agrobacterium <ol><li> Tumefaciens ceppo GV3101 precedentemente trasformato compatibile con BiFC Gateway vettore pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-YN, ciascuno contenente una fusione costrutto di governo indiano. </li><li> Inoculare un 5-ml YEB (5g L estratto di manzo -1, 1g L estratto di lievito -1, 5 g L -1 peptone, 5g L Saccarosio -1, 2mM MgSO 4, pH 7,2) cultura della proteina di fusione BiFC costruisce trasformato con l&#39;Agrobacterium selezione appropriato di antibiotici. Crescere la cultura notte a 28 ° C in agitazione a 200 rpm. </li><li> Togliere 1 ml di coltura in una provetta sterile 1,5 ml centrifuga. </li><li> Cellule pellet a 1.000 g per 10 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con l&#39;aggiunta di 1 ml di infiltrazione dei media (5 g L -1 D-glucosio, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0,1 mM acetosyringone) 11. Risospendere le sfere pipettando, le cellule pellet di nuovo a 1.000 g per 10 min. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio altre due volte. </li><li> Risospendere il pellet in media da 0,5 ml infiltrazione. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 600 nm e regolare finale OD 600-1,0 a 1,2. </li><li> Aliquota una quantità uguale di sospensione Agrobacterium di ogni costruzione in un nuovo tubo di 1,5 ml, vortex per 10 sec. Per una infiltrazione singole, 100 ml di ogni costrutto è più che sufficiente. </li><li> La miscela Agrobacterium è ora pronto per l&#39;infiltrazione. </li></ol> 2. Infiltrazione <ol start="11"><li> N. benthamiana piante sono coltivate a 21 ° C, con 16-ore di luce e 8-h cicli di buio. Cinque gli impianti di sei settimane di età dovrebbero essere usati per l&#39;infiltrazione. </li><li> Rimuovere le piante dalla camera di crescita e di luogo in luce bianca per 1 ora prima infiltratring permettendo stomi per aprire completamente. </li><li> Elaborare risospeso miscela Agrobacterium in un 1 ml slip-siringa senza ago tubercolina. </li><li> Posizionare la punta della siringa contro la parte inferiore della foglia e delicatamente spingere il pistone mentre direttamente a sostegno della parte superiore della foglia con un dito. Il liquido si diffonderà attraverso la foglia come si riempie gli spazi d&#39;aria mesophyllar. </li><li> Etichetta la zona infiltrata con un pennarello per l&#39;identificazione futuro. </li><li> Per infiltrarsi con diversi costrutti, assicuratevi di cambiare sia i guanti o pulirli con etanolo al 70% tra le infiltrazioni. Se possibile, lasciare uno spazio nervatura centrale tra campioni diversi per evitare la contaminazione crociata. </li><li> Posizionare le piante in un armadio di crescita in condizioni di crescita normale. </li></ol> 3. Osservazione del segnale YFP ricostituito <ol start="18"><li> Accise un segmento di 5mm x 5mm di tessuto di foglie all&#39;interno della zona infiltrata </li><li> Montare il campione, in acqua, su un vetrino di vetro, coprire il campione con un coprioggetto ed esaminare le interazioni con un microscopio confocale o fluorescenza. </li><li> Espressione deve essere monitorata ogni 24 ore dal momento di infiltrazione fino a 5 giorni dopo, come sopra espressione / traffico può comportare la visualizzazione di proteine ​​di fusione fluorescenti diversi luoghi nel corso del tempo. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Un esempio di interazione proteina-proteina testato mediante test BiFC è illustrato nella figura 1. AtTHP1 e AtSAC3A si ritiene siano componenti della Arabidopsis omologo di lievito TREX-2 complessi. Possono interagire con un AtNUP1 nuclearporin e facilitare l&#39;esportazione mRNA 10. AtTHP1 e AtSAC3A sono stati clonati in pEarlyGate201-YC mentre AtNUP1 è stato clonato in pEarlyGate202-YN. I costrutti sono stati successivamente trasformati in GV3101. I tre costrutti sono stati appaiati con 3 possibili combinazioni (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A) per l&#39;infiltrazione. Il segnale ricostituito YFP è stata osservata sotto un LCSM 48 ore dopo l&#39;infiltrazione. I segnali sono state osservate nelle cellule epidermiche e localizzato nella periferia nucleare o al plasma nucleare, che è coerente con la localizzazione sub-cellulare di queste proteine. I controlli negativi non hanno mostrato alcun segnale YFP. <img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Arabidopsis TREX-2 componenti esportazione mRNA complesso interagire tra loro. N. benthamiana foglie, co-trasformato con costrutti del GOI fusa pEarleyGate201-YC e pEarleyGate202-YN (come indicato), hanno ripreso 48-72 ore dopo l&#39;infiltrazione, utilizzando un microscopio Leica TCS SP2 confocol. Le immagini sono mostrate come fusi YFP confocale e luminose immagini a campo di epidermica N. benthamiana foglia cellule

<ol>
	<li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li><li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions.">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li><li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li><li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+in+yeast.">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nature. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis.">Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis.</a> Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).</li><li>Earley, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics.">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAY+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).</li><li>Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+homolog+of+the+yeast+TREX-2+mRNA+export+complex:+components+and+anchoring+nucleoporin.">Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).</li><li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+tobacco+plants+and+generation+of+stably+transformed+plants.">transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants.</a> Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).</li><li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells:+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs.">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li><li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization.">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Saggio BiFC è un potente strumento per studiare le interazioni delle proteine. A differenza del tradizionale test Y2H, BiFC non solo permette la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina, ma fornisce anche ulteriori informazioni del complesso proteico come la localizzazione sub-cellulare. Inoltre, è possibile rilevare le interazioni indirette finché le due proteine ​​candidato può essere portato abbastanza vicino da un terzo partner. Come ogni tecnologia, BiFC ha i suoi limiti. A causa della necessità...

<table border='1'>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL slip-tip tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309602</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein interactions in plant using a gateway compatible bimolecular fluorescence complementation (bifc) system

Abbiamo sviluppato una tecnica BiFC per testare l&#39;interazione tra due proteine ​​in vivo. Ciò si ottiene dividendo una proteina fluorescente gialla (YFP) in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse. Questi costrutti possono essere co-trasformato in Nicotiana benthamiana tramite trasformazione mediata da Agrobacterium, consentendo l&#39;espressione di proteine ​​di fusione di transito. La ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta 1-7. Per testare e convalidare il interazioni proteina-proteina, BiFC possono essere utilizzati insieme con il lievito due ibridi (Y2H) test. Questo può rilevare le interazioni indirette che può essere trascurato nel Y2H. La tecnologia Gateway è una piattaforma universale che consente ai ricercatori di navetta il gene di interesse (GOI), in quanto espressione di molti e sistemi di analisi funzionale possibile 8,9. Sia l&#39;orientamento e la cornice di lettura può essere mantenuta senza l&#39;utilizzo di enzimi di restrizione o la legatura di rendere l&#39;espressione-ready cloni. Come risultato, si può eliminare tutte le re-sequencing misure per garantire risultati costanti nel corso degli esperimenti. Abbiamo creato una serie di vettori Gateway compatibile BiFC e Y2H che fornire ai ricercatori un facile da usare strumenti per eseguire test sia BiFC e Y2H 10. Qui, dimostriamo la facilità di utilizzo il nostro sistema BiFC per testare interazioni proteina-proteina in N. benthamiana piante.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System at JoVE.com

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l&#39;espressione di proteine ​​di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

detection-protein-interactions-plant-using-gateway-compatible

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

25.2K Views.  University of Western Ontario. Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l'espressione di proteine ​​di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta.