Lo studio delle interazioni proteina-proteina fornisce una comprensione della regolazione di molti processi biologici. Qui dimostriamo una procedura descritta inizialmente da Y John shoe and co. Lavoratori nel 2007, dove gli autori hanno usato BiFC in combinazione con FRET per convalidare l'interazione tripartita tra tre molecole proteiche.
Tuttavia, abbiamo incluso misurazioni della durata della fluorescenza in questa procedura per comprovare le misurazioni FRET. Per dimostrare un'interazione tripartita, abbiamo scelto una proteina, che è nota per omodimerizzare. Inoltre, è stato anche convalidato internamente per interagire con un sensore di calcio di proteina indicato come proteina C in questo protocollo.
Le proteine MNC interagiscono nel citoplasma. In questa tecnica, due proteine sono etichettate con proteine YFP divise. La loro interazione si traduce nella restituzione di YFP funzionali che fungono da accettore FRET al terzo partner interagente, che è etichettato con CFP che agisce come donatore FRET.
Inizia con l'amplificazione delle sequenze codificanti dei geni di interesse che sono geni M e C nel nostro caso mediante PCR e clonali in opportuni vettori di ingresso. Convalidare i cloni selezionati sugli antibiotici contenenti piastre mediante digestione di restrizione e sequenziamento del DNA. Mobilitare i CDS ricostituiti dai cloni di ingresso ai vettori di destinazione.
Tutti i vettori utilizzati in questo esperimento sono elencati nella tabella uno. Infine, trasformare le cellule agrobacterium GV3101 con i vettori di destinazione per elettroporazione. Qui coltiviamo piante di Nicotiana Benthamiana ancora da quattro a sei foglie in condizioni controllate in una camera di coltivazione.
Preparare il mix di terreno mescolando soilrite, torba di cocco e compost in un rapporto di 2:1:1. Stendere uno strato spesso un pollice di questo mix in un vassoio di plastica per rendere il letto del terreno e saturarlo con un po 'd'acqua. Cospargere circa 200 semi sopra il terreno e trasferirlo in un vassoio più grande di circa un centimetro di acqua stagnante.
Coprire questo vassoio con un involucro di plastica per creare una camera di umidità. Trasferire questo vassoio in una camera di coltivazione impostata a 23 gradi centigradi con 16 ore di luce e otto ore di ciclo di buio. Dopo due settimane trasferire le giovani piantine in piccoli vasi da tre a quattro pollici contenenti miscela di terreno saturo d'acqua.
Metti questi vasi in un vassoio di plastica e trasferiscili nella camera di coltivazione per altre quattro settimane. Per l'agroinfiltrazione, i ceppi batterici devono essere appena sottocolturati e miscelati insieme al ceppo P19 di agrobacterium in rapporti appropriati. Iniziare questa procedura inoculando ceppi di agrobatteri GV3101 contenenti costrutti BiFC e FRET da piastre striate in 10 ml.
al brodo contenente antibiotici appropriati. Parallelamente, avviare anche una coltura del ceppo P19 di agrobatteri, che viene aggiunto per prevenire il silenziamento transgenico. Coprire il pallone con un foglio di alluminio e tenerli in uno shaker incubatore, impostarlo di 28 gradi centigradi a 170 RPM per 16 ore.
Dopo la crescita notturna trasferire 1 ml. di queste colture a un cubito usa e getta per misurare la densità ottica a 600 nanometri utilizzando uno spettrofotometro. Mescolare le colture di ceppi appropriati biFC e fret partner contenenti ceppi in modo che l'OD finale sia 0,5 e quello di P19 sia 0,3 in un volume totale di 2 ml.
Per ottenere questi rapporti seguiamo la formula mostrata sullo schermo per questi calcoli. Centrifugare le colture miste di agrobatterici a 3000G per cinque minuti a temperatura ambiente e scartare con cura il surnatante. Sospendere il pellet in un 2 ml.
buffer di infiltrazione. Potrebbe essere necessario utilizzare un mixer a vortice per sospendere nuovamente le cellule in una sospensione cellulare omogenea completamente. Dopo questo incubare i tubi a temperatura ambiente al buio per tre ore.
Nel frattempo, etichetta ogni vaso per la miscela di costruzione con cui si infiltrerà. Riempire una siringa senza ago da 1 ml con la miscela agrobatterica.
Premere delicatamente ma con fermezza la punta della siringa sul lato abassiale di una foglia completamente espansa mentre si sostiene la foglia dall'altro lato. Spingere delicatamente lo stantuffo fino a quando la soluzione si riempie nell'area fogliare equivalente a due o tre volte quella della punta della siringa. Infiltrare la miscela batterica in un massimo di quattro punti su una foglia e ripetere questa procedura per tre o quattro foglie per un tipo di infiltrazione.
Inoltre, includere almeno due impianti per costrutto per infiltrazione. Ricordarsi di asciugarsi le mani con alcool al 70% o di cambiare i guanti per evitare qualsiasi contaminazione incrociata. Trasferire tutti i vasi in un vassoio e incubare nella camera di crescita nella stessa condizione di crescita.
Controllare una piccola parte della foglia agroinfiltrata utilizzando un microscopio a fluorescenza. Quando la fluorescenza sia da YFP che da CFP sono rilevabili nelle cellule, procedere al microscopio confocale per il test BiFC FRET-FLIM. Nel nostro caso, questa analisi è stata effettuata tre giorni dopo l'agroinfiltrazione.
Ora che le piante sono pronte per essere visualizzate al microscopio, tagliare campioni di foglie quadrate da cinque a 8 mm. lontano dalla ferita della punta della siringa e montarli su acqua distillata. Posizionare un coperchio pulito scivolare su di esso e sigillare.
Visualizza questi campioni al microscopio a scansione laser confocale. In questa procedura, la base per determinare e quantificare l'interazione tra due proteine è la riduzione della durata di fluorescenza del partner donatore fret al momento della sua interazione con l'accettore, che viene utilizzata per calcolare l'efficienza di FRET. La complessità nel caso dell'interazione tripartita aumenta ulteriormente perché l'accettore FRET in questo caso non è una singola molecola, ma una coppia YFP BiFC divisa, che dovrebbe prima essere ricostituita in vivo per diventare un fluoroforo accettore FRET funzionale.
Per eseguire FRET-FLIM, dobbiamo determinare la durata di fluorescenza delle molecole donatrici, prima da solo e poi in presenza di un partner FRET. Aprire l'applicazione FLIM nel microscopio a scansione laser confocale, avviare la console e utilizzare il conteggio dei fotoni di riconoscimento dei modelli per misurare la durata della fluorescenza. Selezionare la modalità di misurazione standard per il conteggio di tutti i fotoni.
Prenderemo due tipi di piante agroinfiltrate. Uno che ha il gene CCFP e l'altro che ha CCFP insieme a MYFP perché l'interazione della proteina M è già stata convalidata con la proteina C usando BiFC e Y2H, ci aspettiamo una buona efficienza FRET con questa coppia interagente. Ora prima eseguiamo la scansione della foglia agroinfiltrata CCFP e cerchiamo una cellula che mostri una buona fluorescenza CFP.
Le impostazioni del microscopio vengono visualizzate sullo schermo. Il campione è illuminato a una potenza laser sufficiente per ottenere circa 0,1 fotoni per impulso. Per i campioni con intensità di fluorescenza variabile, cattureremo 50 fotogrammi per raccogliere fotoni adeguati necessari per la misurazione della durata.
Poiché la CFP è nota per mostrare due vite di fluorescenza a causa del suo adattamento confermativo, alimentiamo i dati utilizzando un modello di riconvoluzione esponenziale mantenendo il valore di N uguale a due. A queste impostazioni, le due vite sono visibili a uno e 3,2 nanosecondi. Useremo la durata superiore per tutti i calcoli successivi.
Ora siamo pronti a misurare FRET tra CCFP e MYFP. Per questo utilizziamo il campione di foglie della pianta agroinfiltrata con CCFP e MYFP. Cerchiamo una cellula che esprima sia CCFP che MYFP e confermiamo i loro rispettivi modelli di emissione eccitandoli utilizzando un laser a impulsi a 40 nanometri e un laser a luce bianca a 514 nanometri.
Successivamente passiamo alla console FLIM per misurare la durata della CFP utilizzando le stesse impostazioni utilizzate in precedenza per misurare la durata della CCFP. Ma questa volta la cellula sta anche esprimendo MYFP che può potenzialmente interagire con CCFP e causare una riduzione della durata di CCFP. Leggendo il grafico ottenuto utilizzando il modello di riconvoluzione esponenziale N con N uguale a due, c'è infatti una diminuzione della vita della CFP da 3,2 a 2,6 nanosecondi.
Ora avviamo la console FRET nel software e calcoliamo l'efficienza FRET inserendo manualmente la durata indiscutibile nell'equazione fornita nel software e l'efficienza FRET osservata è del 56% Ora passiamo al passaggio finale, cioè visualizzare l'interazione tra tre partner. Per questo, prendiamo il campione di foglie da una pianta che è stata co-infiltrata con CCFP e MYFPN con MYFPC. Analizziamo la pianta fogliare alla ricerca di una cellula che mostra sia la CFP che la fluorescenza YFP ricostituita che emana dall'interazione tra due proteine M.
Usiamo lo stesso laser e la stessa lunghezza d'onda di emissione utilizzati in precedenza. Successivamente, spegniamo il laser a 514 nanometri e passiamo alla console FLIM. Se il dimero MYFP interagisce con CCFP.
Dovremmo vedere una riduzione della durata della CCFP osservata durante la sua interazione con MYFP. Tuttavia, se il CCFP non riesce a interagire con il dimero MYFP, la sua durata di fluorescenza dovrebbe rimanere a 3,2 nanosecondi. Utilizzando le impostazioni simili come menzionato sopra, misuriamo la durata della CFP in presenza di YFP ricostituita.
Adattiamo il grafico usando il modello di ricovoluzione esponenziale N con un uguale a due e ci spostiamo sulla console FRET. E sì, c'è un calo della durata della PCP da 3,2 a 2,3 nanosecondi. Calcoliamo l'efficienza FRET come descritto sopra.
L'efficienza FRET calcolata è del 55% Qui abbiamo usato FLIM per misurare la durata di fluorescenza del partner donatore FRET in presenza e assenza dell'accettore FRET. Ci si aspettava una riduzione della durata di fluorescenza del donatore se ci fosse stata un'interazione positiva tra le due proteine. In caso di controllo positivo, cioè CCFP e MYFP.
Osserviamo una riduzione della durata di fluorescenza del donatore da 3,3 a 2,5 nanosecondi e l'efficienza fret è stata del 56%Un esercizio simile con YFP ricostituito è risultato dall'interazione tra due amonomeri e proteine C ha anche portato a un'interazione FRET positiva che ha portato alla riduzione della durata di fluorescenza del donatore a 2,6 nanosecondi. L'efficienza FRET calcolata era di circa il 55% in questo caso. La riduzione della durata di fluorescenza del donatore fret fornisce una forte evidenza di un'interazione tripartita tra queste proteine.
Il protocollo qui descritto è un potente strumento per determinare le interazioni tripartite proteina-proteina nelle cellule viventi. Questa procedura può anche aiutare a determinare la localizzazione intracellulare dei complessi risultanti, che è importante per decifrare la funzione e il significato fisiologico di qualsiasi complesso proteico. In conclusione, il test FRET-FLIM basato su BiFC offre l'opportunità di studiare e caratterizzare aspetti importanti delle interazioni proteiche tripartite, che possono essere utili negli studi di interazione proteina-proteina in sistemi sia animali che vegetali.
