우리는 원고와 일반적인 실험실 지원을 읽을 바이올렛 Nguyen 감사합니다.

1. Agrobacterium 문화의 준비 <ol><li> Agrobacterium 긴장 GV3101은 이전에 게이트웨이와 호환 BiFC 벡터 pEarleyGate201 - YC 및 pEarleyGate202 - YN, 융합 GOI의 구조가 포함된 각 변형. </li><li> BiFC 융합 단백질의 5 ML YEB (5g L -1 쇠고기 추출물, 1g L -1 효모 추출물, 5g L -1 펩톤, 5g L -1 자당, 2mM MgSO 4, 산도 7.2) 문화를 예방하기와 agrobacterium 변형 구성 적절한 항생제 선택합니다. 28 야간 문화를 성장 ° C 200 rpm으로 흔들어. </li><li> 멸균 1.5 ML의 원심 관에 문화 1 ML를 제거합니다. </li><li> 상온에서 10 분 1,000g에서 펠릿 세포가 뜨는 폐기. </li><li> 침투 미디어 1 ML (5g L -1 D - 글루코오스, 50 MM MES (시그마), 2 MM 나 3 PO 4, 0.1 MM acetosyringone) 11을 추가하여 펠렛을 씻으십시오. pipetting하여 Resuspend 펠렛, 10 분 1,000g에서 다시 펠릿 세포. </li><li> 세척 단계 두 번 더 반복합니다. </li><li> 0.5 ML의 침투 미디어의 펠렛을 Resuspend. </li><li> 600 nm의 흡광도에서를 측정하고 1.2-1.0로 OD 600 최종 조정합니다. </li><li> 새로운 1.5 ML 튜브에 각 구조의 agrobacterium 정지의 동일한 금액을, 10 초위한 와동 나누어지는. 하나의 침투에 대한 각 구조 100 μL 정도 이상입니다. </li><li> agrobacterium 혼합물은 이제 침투 준비가되었습니다. </li></ol> 2. 침투 <ol start="11"><li> N. benthamiana 공장 16 - H 조명 및 8 - H 어두운 사이클로, 21 ° C에서 성장하고 있습니다. 6 주 된 식물 다섯은 침투에 대한 사용해야합니다. </li><li> stomata 완전히 열 수 있도록 infiltratring 전에 1 H에 대한 하얀 빛 아래 성장 공간과 장소에서 식물을 제거합니다. </li><li> 1 - ML 슬립 팁 투베르쿨린 주사기 바늘없이 resuspended agrobacterium 혼합을 그립니다. </li><li> 잎의 아래쪽에 대해 주사기의 팁을 놓고 직접 손가락으로 잎의 상단을 지원하면서 부드럽게 플런저를 우울. 그것이 mesophyllar 공기 공간을 가득 채우고 같은 액체는 나뭇잎을 통해 확산됩니다. </li><li> 미래를 식별 마커 펜으로 침투 지역을 라벨. </li><li> 다른 구조로 침투하면 장갑을 변경하거나 infiltrations 사이에 70 % 에탄올과 그들을 청소하거나 있는지 확인하십시오. 가능하면, 교차 오염을 방지하기 위해 다른 샘플 간의 잎의 중륵맥 공간을 둡니다. </li><li> 정상적인 성장 조건에서 성장 캐비닛에 식물을 놓습니다. </li></ol> 3. 재구성 YFP 신호의 관측 <ol start="18"><li> 침투 영역 내에서 잎 조직의 소비세 5mm X 5mm 세그먼트 </li><li> 물 속에 들어가면, 유리 현미경 슬라이드에 coverslip으로 샘플을 커버하고 공촛점 또는 형광 현미경을 사용하여 상호 작용을 조사, 샘플을 탑재합니다. </li><li> 시간 코스 이상의 여러 다른 위치를 표시하는 형광 융합 단백질을 높일 수 표현 / 매매 이상과 같은 표현식은 최대 5 일 후로 침투의 시간에서 24 시간마다 모니터링해야합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : BiFC 분석하여 테스트 단백질 단백질 상호 작용의 예제는 그림 1에 표시됩니다. AtTHP1과 AtSAC3A는 효모 TREX - 2 복합 Arabidopsis 상동체의 구성 요소로 여겨지고 있습니다. 그들은 nuclearporin AtNUP1과 상호 작 용할 수 있으며 mRNA 수출 10 용이하게하실 수 있습니다. AtNUP1가 pEarlyGate202 - YN에 복제하는 동안 AtTHP1와 AtSAC3A는 pEarlyGate201 - YC으로 복제했다. 구조는 이후 GV3101으로 변형되었다. 침투에 대한 (AtNUP1 + AtSAC3A,, AtTHP1 + AtSAC3A AtTHP1 + AtNUP1) 세 개의 구성 가능한 조합은 3와 쌍을했다. 재구성 YFP 신호 침투 후 LCSM 48시간 아래에 관찰되었다. 신호는 표피 세포에서 관찰하고 이러한 단백질의 서브 셀룰러 로컬 리 제이션과 일치 핵 주변이나 핵 플라즈마에 현지되었습니다. 부정적인 통제는 YFP 신호를 보여주지 않았다. <img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. Arabidopsis TREX - 2 mRNA 수출 복잡한 구성 요소가 서로 상호 작용할 수 있습니다. N. benthamiana 단풍, GOI의 구조와 공동 변화는 Leica TCS SP2 confocol 현미경을 사용하여 침투 후 48-72 H 몇 군데 있었다 pEarleyGate201 - YC 및 pEarleyGate202 - YN (로 표시)로 융합된. 이미지 통합 공촛점 YFP 및 표피 N.의 밝은 필드 이미지로 표시됩니다 benthamiana 잎 세포

<ol>
	<li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li><li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions.">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li><li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li><li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+in+yeast.">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li><li>Kerppola, T. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+tobacco+plants+and+generation+of+stably+transformed+plants.">transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants.</a> Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).</li><li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells:+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs.">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li><li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization.">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

BiFC 분석은 단백질 상호 작용을 공부를위한 강력한 도구입니다. 전통 Y2H 분석과는 달리, BiFC뿐만 아니라 단백질 단백질 상호 작용의 시각화을 허용뿐만 아니라 하위 세포 지방화 같은 단백질 복잡한 더 많은 정보를 제공합니다. 또한, 그것은 두 후보 단백질이 세번째 파트너 가까이에 충분히 가져 수있는만큼 간접적인 상호 작용을 검출하는 것이 가능합니다. 모든 기술과 마찬가지로, BiFC는 제한 ?...

<table border='1'>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL slip-tip tuberculin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309602</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein interactions in plant using a gateway compatible bimolecular fluorescence complementation (bifc) system

우리는 생체내 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하는 BiFC 기술을 개발했습니다. 이 두 아닌 중복 조각으로 분할 노란색 형광 단백질 (YFP를)에 의해 수행됩니다. 각 조각은 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 이러한 구성은 다음 융합 단백질의 통과 식을 수 있도록 Agrobacterium의 중재 ​​변환을 통해 Nicotiana benthamiana에 공동 변형하실 수 있습니다. 심리 단백질은 1-7을 상호 작용을 때 YFP 신호의 reconstitution에만 발생합니다. 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하고 유효성을 검사하려면 BiFC는 효모 두 하이브리드 (Y2H) 분석과 함께 사용할 수 있습니다. 이것은 Y2H에서 간과된 수있는 간접적인 상호 작용을 검색할 수 있습니다. 게이트웨이 기술에 관심 셔틀의 유전자를 (GOI)에 연구자 수있는 범용 플랫폼입니다 많은 표현 가능한 8,9와 같은 기능 분석 시스템과 같은. 오리 엔테이션 및 읽기 프레임 모두 표현 가능한 클론을 만들기 위해 제한 효소 또는 결합을 사용하지 않고 유지하실 수 있습니다. 그 결과, 하나는 실험을 통해 일관성있는 결과를 보장하기 위해 모든 다시 시퀀싱 단계를 제거할 수 있습니다. 우리는 BiFC와 Y2H 모두 assays 10을 수행하기 위해 사용하기 쉬운 도구를 통해 연구자를 제공 게이트웨이 호환 BiFC 및 Y2H 벡터 일련의를 만들었습니다. 여기, 우리는 N.에 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하기 위해 BiFC 시스템을 사용의 용이성을 보여주 benthamiana 식물.

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Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

detection-protein-interactions-plant-using-gateway-compatible

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

25.2K 조회수.  University of Western Ontario. 우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.