Ringrazio Watanabe L, M Gorczyca e altri membri del laboratorio Yoshihara per gli utili commenti e discussioni. Ringrazio K. Scott e L. Looger per gli stock finestre, S Yokoyama per dimostrare esperimenti, Shinya Iguchi per assistenza tecnica e Nobuko Yoshihara di materiale informativo. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Mental Health MH85958 Grants, e la Fondazione Worcester a MY

1. Costruire le MOSCHE <ol><li> Forma una piattaforma dal coperchio della piastra da 35 mm Falcon fondendo la parete laterale e intaglio per formare un angolo appropriato e spessore (Figura 1a; Figura 2). Eseguire un foro nella piattaforma di accettare la testa fly (Figura 1a, b), tale che i boccale sono liberamente esposta all&#39;esterno della camera (Figura 1a). Tagliare l&#39;estremità di una punta Pipetman, con la dimensione corrispondente al volo da osservare. Incollare la punta alla piattaforma come mostrato nella Figura 1a per completare le mosche (Figura 2). </li></ol> 2. Preparazione del Fly per l&#39;osservazione <ol><li> Starve uno mosca adulta per 24 ore a 25 ° C prima dell&#39;esperimento ponendolo in un flaconcino con solo un tovagliolo di carta bagnata, fame se è necessario. </li><li> Anestetizzare la mosca ponendolo in un tubo di 15 ml di plastica in piedi sul ghiaccio. </li><li> Con pinze, inserire una mosca nella camera delVOLA, e spingere delicatamente la mosca fino a quando non è in grado di muoversi. Quindi, inserire una spina per mantenere il volo. (Figura 1a, b). </li><li> Sigillare le parti circostanti della prossimali proboscide (rostro) al bordo interno del foro, applicare una piccola quantità di luce La colla (Tetric EvoFlow) ai lati e al di sopra del rostro dall&#39;esterno (frecce in figura 3). Anche applicare la colla dall&#39;interno delle mosche allo spazio tra la parte dorsale della testa e il bordo interno del foro (Figura 1b). Per consentire la tribuna di muoversi liberamente, occorre prestare attenzione per evitare che la colla di toccare il podio utilizzando un ciglio (o qualcosa di simile) per diffondere la colla. Infine, curare la colla con il più debole illuminazione della luce blu sufficienti per la cura per evitare di danneggiare la mosca dal calore eccessivo. Togliere il tappo. </li><li> Un filo di tenere il rostro parzialmente sollevato (freccia in figura 3) possono essere impiegati per stabilizzare la mosca &#39;testa di s evitando urto della parte faringea di SOG e per esporre la parte ventrale del SOG, soprattutto per i terminali di imaging presinaptici di neuroni Gr5a 8, che sono coperti da una parte della faringe quando la proboscide è completamente retratto. </li><li> Riempire la superficie della piattaforma con un senza zucchero contenenti salina (in mM): NaCl, 140; KCl, 2, MgCl 2, 4,5, CaCl 2, 1,5, e HEPES-NaOH, 5 con un pH di 7,1 10. Questo saccarosio senza soluzione salina ha tonicità simili a quelli di uso comune contenente saccarosio saline come HL3.1 11. </li><li> Aprire la capsula testa con una lama in tungsteno e pinze con le punte affilate come forbici, che è un dispositivo su misura e originariamente progettato dal Dr. Kageyuki Yamaoka, il Giappone, per tagliare le cuticole e trachea per esporre il SOG (Figura 4). Il bordo ventrale della cuticola testa è stata tagliata come ventrale più possibile, mentre il taglio bordo dorsale non era così critico. In primo luogo, fare un incisione attraverso l&#39;margine posteriore usando una lama di tungsteno. Quindi, tagliare la parte ed i bordi anteriori con le pinze appuntite. Il pezzo cuticola taglio deve essere sollevato con le pinze e rimossi. Nervi Antenne e antenne dovrebbero essere tagliati fuori dalle pinze appuntite. </li><li> Per evitare artefatti movimento durante la registrazione, il cervello deve essere stabilizzate mediante l&#39;asportazione di alcune parti della mosca. In primo luogo, rimuovere selettivamente i sacchi aerei tra la SOG e cuticola. Tagliare il esofago alla fine verso la faringe e alla fine entrare nel SOG rimuovere la connessione tra la faringe e il cervello. Quindi estrarre Muscle 16 12, e, infine, staccare qualsiasi trachea che collega il cervello e la cuticola. </li><li> Abbiamo impostato le nostre mosche sul palcoscenico di un microscopio Olympus BX51WI collegato ad un sistema di rotazione del disco microscopio confocale (Improvision in PerkinElmer) (Figura 5). Una lente immersione in acqua, ad esempio 40X/0.8 NA, è stata immersa nella vasca (figura 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + Imaging of the Brain <ol><li> Ca 2 + immagini utilizzando GCaMP3.0 1, 9 è stata effettuata mediante il metodo stabilito da Marella et al. 8 (Figura 6). Utilizzando un microscopio confocale a disco rotante (Improvision), prendere una singola sezione ottica a 4 Hz con un tempo di esposizione di 122ms con 491nm laser di eccitazione, di messa a fuoco la regione di interesse (un corpo cellulare di un neurone motore, o un interneurone, o terminali presinaptici gustative dei neuroni sensoriali) con software Velocity, ver. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. Stimolare la proboscide <ol><li> Aspirare 100mM soluzione acquosa di saccarosio in un ago ipodermico con uno stoppino piccolo (a base di carta giapponese Washi, vedere tabella di reagenti specifici) sporgente dalla punta (Figura 7). </li><li> Scaricare una piccola goccia di soluzione di saccarosio sul stoppino, quindi, aspirare, immediatamente before applicando il bagnato stoppino di carta Washi alla punta della proboscide. Lo stoppino di carta Washi deve essere applicata solo per un istante per evitare di sazietà (Figura 8). Monitorare la risposta estensione proboscide (PER) comportamento utilizzando una fotocamera CCD collegata ad un microscopio di dissezione (Figura 5) simultaneamente con Ca 2 + imaging. I dati devono essere prese entro un&#39;ora dopo aver iniziato la dissezione perché la risposta PER non viene mantenuta più di un&#39;ora in queste condizioni. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Motoneuroni del goniometro rostro, una coppia di muscoli principali responsabili per il sollevamento del rostro dell&#39;estensione proboscide, sono stati segnalati per mostrare le risposte robusti agli stimoli dolci 13. Figura 9 mostra Ca 2 + segnali attraverso GCaMP3.0 1, 9 espressa da un Gal 4 driver, E49 13, da un corpo cellulare del neurone motore. Come mostrato nel video, uno Robuv è stata osservata in sincronia con un aumento Ca 2 + segnale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del cervello Fly live Imaging ed Elettrofisiologia Stage (aria). uno, le mosche è costruito in modo tale che l&#39;angolo della parete permette la testa mosca uscire dritto. Tre segmenti della proboscide mosca sono color-coded, il podio è il magenta. La mosca viene inserito nella camera con una pinza, e un pezzo tagliato dalla estremità di una punta Pipetman è connessa al retro della camera di bloccare la fuoriuscita mosca. B, il foro è annoiato conforme alla testa della mosca. Le lacune rimanenti vengono sigillati con la colla luce, come indicato per garantire che non vi siano perdite. Dopo che la colla è asciutta, la punta Pipetman come una presa è stata rimossa. Saline viene versato nei MOSCHE tali che la superficie del cervello è completamente coperto. Occorre garantire che non vi siano perdite salinezare successivamente sull&#39;estremità anteriore della testa mosca. L&#39;area ombreggiata circondata dalla linea tratteggiata in pannello b mostra la parte da sezionati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografia delle mosche. La parete a forma di mezzaluna di colla (una pistola da colla) è fatto per controllare il flusso di soluzione salina durante la perfusione, e per ridurre la quantità di soluzione salina utilizzata. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> Figura 3. Vista frontale di una mosca montato le mosche. Questa immagine mostra come una mosca si trova nelle mosche e come la luce-colla viene applicata intorno alla testa della mosca (frecce) per creare una soluzione salina a prova di tenuta. Se eventuali perdite saline fino ai proboscide della mosca, poi l&#39;esperimento avrà esito negativo. Il filo (frecce) legato alla fase è di tenere la proboscide in posizione, così che non è completamente retrazione<html> ted. Altrimenti sarebbe ostruire la parte più ventrale del SOG e causare artefatti da movimento. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> Figura 4. Top-view delle mosche con una mosca sezionato. Questa immagine mostra l&#39;esposto di SOG successivo alla rimozione delle cuticole mosca. L&#39;esofago, Muscle 16 e trachee collegato al cervello, nonchè selezionati aria sacchi sono stati rimossi per impedire loro di disturbare il cervello, che può portare a artefatti nei segnali di calcio. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;apparecchiatura di monitoraggio. Questo apparato è assemblato da un microscopio Olympus BX51WI collegata a un sistema di filatura microscopio confocale disco (Improvision), e un lato montato SMZ800 microscopio Nikon. Questa configurazione permette di live-imaging di attività cerebrale durante PER comportamento. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Fotografie per mostrare la vista laterale delle mosche. Lo strato sottile di soluzione fisiologica è inserita tra l&#39;acqua 40X-obiettivo a immersione e la mosca. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> Figura 7. Schema per la realizzazione del stoppino di carta Washi. Gampi-Washi carta è una pergamena tradizionale giapponese che è estremamente sottile e liscio (Haibara, Giappone). È anche molto forte e può mantenere una grande quantità di liquido. La carta Washi deve essere tagliato in un trapezio con dimensioni molto specifici 0,3 mm e 0,7 mm di larghezza, e 4-5 mm in lunghezza (a). Questo trapezoidale viene quindi inserita dal lato 0,7 millimetri nella punta di un ago ipodermico 23 e G può anche essere stabilizzate mediante l&#39;inserimento di un perno di insetto, che è piegata a forma di V (b). C, la carta Washi diventa trasparenti in seguito all&#39;esposizionead un liquido, che lo rende ideale per questo esperimento. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> Figura 8. La stimolazione della proboscide sulle vola alla Washi-stoppino. Lo stoppino di carta Washi sulla punta di un ago ipodermico viene applicata per un istante utilizzando un manipolatore joystick con una mano. L&#39;ago è collegata tramite un tubo flessibile ad un iniettore manipolato con l&#39;altra mano, per l&#39;aspirazione e lo scarico soluzione di saccarosio. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> Figura 9. Rappresentativi dei risultati. uno, PER comportamento registrato attraverso la camera CCD installato sul stereomicroscopio. Vista frontale di una mosca affamata con una proboscide estesi (frecce) prima della stimolazione, alla stimolazione, e dopo la stimolazione con uno stoppino contenente 100 mM saccarosio in soluzione acquosa (punta di freccia). L&#39;illuminazione è compiuta da un laser a 491 nm utilizzatoper GCaMP fluorescenza. b, saccarosio-indotta GCaMP 3,0 risposta nel neurone motore per il goniometro del muscolo rostro nello stato affamato. Il pannello superiore, la prima stimolazione, il pannello inferiore, immediatamente dopo la stimolazione. Bar Scala, 10 micron. C, Quantificazione del saccarosio indotta risposta GCaMP 3.0. Il neurone motore risponde ad uno stimolo saccarosio da un forte aumento nella fluorescenza seguita da una fase di ripristino di alcuni secondi per la linea di base.

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<p class="jove_content"&gt; Non ho nulla da rivelare.</p

Le MOSCHE consente la registrazione simultanea di Ca 2 + PER segnali e comportamenti. Anche con il cervello esposto a un comportamento normale soluzione salina è stata osservata. Utilizzando il Gampi-Washi stoppino al posto di uno stoppino Kimwipe utilizzato nel method7 originale capillare facilita un comportamento altamente riproducibile e stabile PER ed evita la necessità di diventare abili nel fare e la scelta di uno stoppino buona Kimwipe. Le punte sperimentali sopra indicato permesso di evitare perturbazioni con successo dal movimento della proboscide, portando a una registrazione molto stabile di Ca 2 + segnali a basso rumore. Di tanto in tanto, la rimozione dei tessuti non è stato sufficiente per esporre le cellule o sopprimere il movimento in maniera adeguata, porta a scarsi risultati. Tuttavia, una volta erano esperti, oltre l&#39;80% dei preparati prodotto buoni risultati. Questa metodologia è non solo per l&#39;imaging Ca 2 +, ma può anche essere adattata a qualsiasi immagine dal vivo osservando PER comportamento. Ad esempio, possiamo accedere a qualsiasi cella attraverso ilutilizzo di un elettrodo per registrare direttamente attività. In combinazione con due fotoni microscopia eccitazione, siamo in grado di effettuare l&#39;imaging lasso di tempo struttura sinaptica, che possono essere correlate a cambiamenti comportamentali. Pertanto, questo metodo di immagini cerebrali con osservazione del comportamento non è valida soltanto per la dissezione funzionale della rete neuronale, ma potrebbe essere usato come un potente strumento per correlare 14 plasticità sinaptica per i meccanismi alla base della memoria.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di attrezzature / Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar Vivadent </td><td> M04115 </td><td> Light-colla </td></tr><tr><td> BX51WI Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td> Con 40X (NA 0,8) lente dell&#39;obiettivo immersione in acqua </td></tr><tr><td> Spinning sistema di microscopia confocale disco </td><td> Improvision in PerkinElmer </td><td></td><td> Con il laser 491 nm </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ-800 </td><td> Attaccato ad un braccio oscillante. Visione stereo è ancora disponibile con registrazione video </td></tr><tr><td> Gampi-carta Washi </td><td> Haibara, Giappone </td><td></td><td> Un tipo speciale di carta tradizionale giapponese </td></tr><tr><td> CCD della fotocamera </td><td> Imaging Source </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 pixel CCD SONY </td></tr><tr><td> Joystick manipolatore </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettore </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

Per studiare reti neuronali in termini della loro funzione nel comportamento, dobbiamo analizzare come i neuroni funzionano quando ogni modello comportamentale viene generato. Così, registrazioni simultanee di attività neuronale e comportamento sono essenziali per correlare l&#39;attività del cervello al comportamento. Per tali analisi comportamentali, il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, ci consente di incorporare gli indicatori di calcio geneticamente codificate come GCaMP 1, per monitorare l&#39;attività neuronale, e di utilizzare sofisticate manipolazioni genetiche per le tecniche di optogenetic o termogenetica di attivare specificamente identificati neuroni 2-5. L&#39;uso di una tecnica termogenetica ci ha portato a trovare i neuroni fondamentali per comportamento alimentare (Flood et al., In corso di revisione). Come parte principale del comportamento alimentare, un adulto Drosophila estende la sua proboscide per l&#39;alimentazione 6 (estensione di risposta proboscide; PER), in risposta ad uno stimolo dolce da cellule sensoriali sulla sua proboscide o Tarsi. Combining il protocollo per PER 7 con una tecnica di imaging di calcio 8 utilizzando GCaMP3.0 1, 9, ho stabilito un sistema sperimentale, dove si può monitorare l&#39;attività dei neuroni nel centro nutrizionale - il ganglio suboesophageal (SOG), in contemporanea con l&#39;osservazione del comportamento della proboscide. Ho progettato un apparecchio (&quot;Fly cervello vivo Imaging e Stadio Elettrofisiologia&quot;: &quot;VOLA&quot;) per ospitare un adulto Drosophila, permettendo la sua proboscide di muoversi liberamente mentre il suo cervello è esposto al bagno per Ca 2 + immagini attraverso una lente di immersione in acqua . I MOSCHE è anche adatto per molti tipi di esperimenti dal vivo sul cervello mosca come la registrazione elettrofisiologica o lapse imaging momento della morfologia sinaptica. Poiché i risultati di immagini dal vivo può essere direttamente correlata con il comportamento PER simultanea, questa metodologia in grado di fornire un ottimo sistema sperimentale per studiare l&#39;elaborazione delle informazioni delle reti neuronali, e come questo cattività ellular è accoppiato ai processi di plastica e memoria.

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

La mosca della frutta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Si estende la sua proboscide per l&#39;alimentazione, rispondendo ad uno stimolo zucchero dalla sua proboscide o del tarso. Ho unito le osservazioni della risposta estensione proboscide (PER) con una tecnica di imaging di calcio, che ci permette di monitorare l&#39;attività dei neuroni nel cervello, in contemporanea con l&#39;osservazione comportamentale.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.5K Views.  University of Massachusetts Medical School. La mosca della frutta, Drosophila melanogaster, Si estende la sua proboscide per l'alimentazione, rispondendo ad uno stimolo zucchero dalla sua proboscide o del tarso. Ho unito le osservazioni della risposta estensione proboscide (PER) con una tecnica di imaging di calcio, che ci permette di monitorare l'attività dei neuroni nel cervello, in contemporanea con l'osservazione comportamentale.

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

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Neuroscienze

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

La registrazione dell&#39;attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracellulare di registrazione, sensoriale Campo Mapping, e la coltura neuroni identificata nel Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potenziale di membrana Dye Imaging di ventromediale dell&#39;ipotalamo neuroni da topi adulti per studiare glucosio Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Una guida per<em&gt; In vivo</em&gt; Singola unità di registrazione da Optogenetically Identificato corticale inibitorio interneuroni

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...